液相基础理论

液相基础理论一. 高效液相的分类高效液相的主要特点是：高速、高压、高效、高灵敏度。高效液相的分类：1. 液-固色谱（吸附色谱）2. 液-液色谱：其特点是可通过单一的调整流动相和固定相，使分配系数有较大差异， 以达到满意分离。液-液色谱又有正相和反相之分。所谓正相是指固定相为极性，而流动相 为非极性；反相则相反。3. 离子交换色谱:它是基于离子交换树脂上可电离的离子与流动相中具有相同电荷的溶 质离子进行可逆交换，由于离子对交换剂具有不同的亲和力而将他们分离。4. 凝胶渗透色谱：又名空间排阻色谱。它以凝胶为固定相，液体为流动相，当试样注入 色谱柱后，分子量大的分子不能渗透到凝胶孔隙里去而受到排阻，因此首先被冲洗出来。小 分子则可渗透到孔穴内部而最后被冲洗出来。二. 谱带扩张谱带扩张即色谱峰变宽或变形，结果使柱效降低。引起谱带扩张的因素有柱内因素也有 柱外因素。1. 柱外效应：产生这种扩张的主要原因是柱前和柱后死体积过大，组分分子在液相中的 扩张系数a、流动相的流速慢等，其次是进样方式和检测器的响应时间等也会引起谱带扩张， 因为进样器内存在一定的死体积，加上进样时液体的扰动，使试样在柱的顶端以截面的方式 进入固定相，从而造成谱带扩张或不对称。2. 非瞬间平衡：混合物在流动相的携带下，在色谱柱中向前移动，与此同时，它们在固 定相和流动相之间进行连续分配。由于每次分配都需要一定的时间，所以在流动相流动的状 态下，分配平衡不可能瞬间平衡，其结果是谱带边缘被稀释，造成谱带扩张。3. 分子扩散：主要包括涡流扩散（由于柱中曲折的通道造成）、纵向扩散（由于柱中浓 度剃度引起）、传质扩散（固定相传质阻力和流动相传质阻力）。三. 分离条件的选择指标1. 柱效能：由动力学因素所决定的色谱柱效率：用塔板板间距（H）或塔板数（n）表示。2. 分离度：将动力学和热力学参数综合考虑的色谱柱总分离效能指标，峰间距越大，峰 越窄，分离度越大，效果越好。四. 装置1. 流动相存储器2. 高压泵，其基本要求是：a. 具有较高的输出压力b. 能使流动相以无脉冲的方式进入色谱柱c. 耐腐蚀性强d. 输送流动相的速度精确度要高，重复性要好，以得到可重复的分析结果e. 泵的死体积要小，以便于更换溶剂和剃度洗脱3. 梯度洗脱装置4. 进样系统：高压进样阀分为注射器和六通阀。用一特制的微量注射器将样品送入样品圈（定量管），然后将六通阀旋转60Q由高压泵输送的流动相将样品送入色谱柱。样品圈 的容积是固定的，若进样体积超过样品圈的容积，多余的样品将经另一通路流入废液池。 这种进样系统可以在40Mpa下迅速的、重复的将样品送入色谱柱。其缺点是系统管路太 长，易产生色谱峰扩张。5. 色谱柱：高效液相色谱用的色谱柱大都采用内经为1-6mm的不锈钢管，柱长为10-50cm， 柱形一般为直形柱。6. 检测器：a. 紫外检测器（UV）：紫外检测器是目前使用最广泛的检测器。它要求被分析组分必 须吸收紫外光。这种检测器对温度和流量的变化不敏感，而对很多组分却有极高的 灵敏度。现有的紫外检测器具有满刻度为0.005吸收单位的灵敏度和土 1%的噪音 如此高的灵敏度不仅能检测吸收值较高的一些组分，甚至对具有中等紫外吸收的组 分也可检测到几纳克数量级。其缺点是不能对那些没有紫外吸收的样品进行检测， 溶剂的选用也受到一定的限制，对那些紫外光不透过的溶剂如苯则不能用作流动 相。其结构主要分为光源、流动池（包括参比池和检测池）、紫外滤光片以及光敏 检测器系统。光源主要有低压汞灯（波长固定在254nm）、氘灯（波长范围：195-400nm）、氘灯-钨灯（紫外-可见光任意波长）。使用紫外检测器对高效液相色 谱中所用的溶剂（流动相组成）都有紫外光吸收，使用时要注意它们的吸收波长上限：溶剂吸收波长上限（nm）溶剂吸收波长上限（nm）内酮330烷基卤化物225芳香烃300四氢呋喃220四氯化碳268醚220乙酸乙酯260环己烷215氯仿250乙月青190二氯甲烷245烷烃185样品检测波长应当在溶剂吸收波长上限以上，才能保证检测的灵敏度。如果两者的吸收 波长很接近，就应该换用吸收波长上限小的溶剂，或用其它类型的检测器。b. 示差折光检测器：示差折光检测器是一种浓度型通用检测器，它借助于连续检测样 品池与参比池中液流间折射率的差值而达到测定试样浓度的目的。，其最大缺点是 对温度变化非常敏感c. 荧光检测器（FLD）：它可检测那些用紫外光激发后能产生荧光的物质。五. 色谱固定相1. 载体的分类和特点：高效液相色谱中采用的载体有两类，即薄壳型和全多孔微粒型。a. 薄壳型：又名表面多孔型。它是在坚实无孔的玻璃珠表面上涂敷一层多孔的表 面（如硅胶、氧化铝、离子交换树脂或聚酰胺等）这个多孔表面厚度为1-3um（核直径的1/30-1/40）。其特点是颗粒表面薄而均匀，且没有深孔，因此促进 了样品分子和固定相之间的有效相互作用，使样品分子的传质速度快，减少了 谱带的扩张，有利于提高柱效。其缺点是比表面积小，故柱容量小，需要较高 灵敏度的检测器。b. 全多孔微粒型：全多孔微粒型载体是指填充剂颗粒本身是多孔性物质。其特点 是比表面积较大，所以柱容量大。对于颗粒直径大于10m的多孔填充剂，由 于小孔深度大，故由固定相的传质和滞留流动相的传质产生的峰宽扩张较大， 特别是非球形的多孔填充剂，其填充特性较差涡流扩散造成的峰宽扩张更大，因此不易获得高柱效。对于颗粒直径小于10m的多孔填充剂，由于孔深大大 缩短，固定相和滞留流动相的传质可以获得很大的改善，柱效有明显的提高。 然而，全多孔微粒型装柱技术要求高，渗透不如薄壳型好，但随着装柱技术的 提高，全多孔微粒型已逐步取代了薄壳型。2. 液-固吸附色谱固定相(吸附剂)：按极性大小可分为极性和非极性两大类。极性吸附剂 主要包括硅胶、氧化铝、氧化镁和分子筛。非极性吸附剂主要有活性炭(在高效液相中 很少用)。硅胶的活性中心是硅上连接的羟基(相邻)相互可以形成氢键。当温度超过 200 r时，表面羟基变为硅氧烷基，活性消失。六. 液-液分配色谱固定相液-液分配色谱的固定相是由惰性载体表面涂布一层固定液所组成，它与气相色谱中的 固定相相似。当样品随流动相通过色谱柱时，样品中的各组分便在液-液色谱两相间进行分 配。这种分配色谱的最大缺点是固定液的流失，柱效降低，柱寿命缩短，而且不能用于剃度 洗脱。化学键合固定相的种类很多，按键合固定相的色谱性质分为极性、非极性和离子型三 种；按表面结构分为分子键合相和聚合键合相；按化学键分为Si-O-C键、Si-O-Si-C键、 Si-O-Si-N 键等。在化学键合固定相的制备中。常用的载体是硅胶。硅胶表面的硅醇基(Si-OH)能与有 机化合物反应。使有机化合物的分子键合在硅胶表面上，其反应途径有如下三种：(1) 酯化键合制得的Si-O-C型固定相(2) 硅烷化键合制得的Si-O-Si-C型固定相。(3) Si-O-Si=N 键合。在上述类型中，使用最广泛的是Si-O-Si- C型键合相，因为它的化学键稳定，耐水、 耐热、耐有机溶剂，是高效液相色谱理想的固定相。化学键合相的优点：(1) 、无固定液流失现象，增加了色谱柱的稳定性和使用寿命。(2) 、由于可以键合不同官能团，故能灵活地改变选择性。(3) 、能进行梯度洗脱。(4) 流动相不必用固定液饱和，也不需要前置柱。(5) 表面没有液坑，比一般液体固定相传质快得多。商品键合固定相多数是以其表面所键合的基团来命名的。如薄壳玻珠-氨基、薄壳玻珠- 氰基、堆积硅珠-苯基，多孔硅珠-烷基，多孔硅珠-聚乙二醇等。实际应用中，可根据所键 合基团的极性来进行选择，即极性小的样品可以选择极性小的键合固定相（烷基键合固定相） 并用极性大的流动相（水、醇等）作反向色谱。极性大的样品可以选择大的键合固定相（醚 基、氰基键合固定相，用不同极性的流动相作正相色谱。常用的键合固定相见下表。类型名称表面官能团粒度（um）形状薄冗型薄壳玻珠-烷基十八烷基硅烷25-37球形薄壳玻珠-醚基醚基25-37球形薄壳玻珠-氰基氰基25-37球形薄壳玻珠-氨基氨基25-37球形ODS-SIL-X-I十八烷基硅烷30-40球形Permaphase ODS十八烷基硅烷25-37球形Vydac RP十八烷基硅烷30-44球形Permaphase ETH醚基25-37球形Durapak OPN/Corasil氧丙腈37-50球形DurapakCarbowax400/Corasil羟基37-50球形BondapakPhenyl/Corasil苯基37-50球形Bondapak C18/Corasil十八烷基37-50球形多孔型YWG-CH十八烷基二氯硅烷8-12非球型WYG-Ph苯基8-12非球型YWG-CN氰基8-12非球型YWG-NH2氨基8-12非球型Bondapak C18/Partisil十八烷基硅烷10非球型Zorbax ODS十八烷基硅烷6-8球形Partisil-10 ODS十八烷基硅烷10非球型Partisil-10 PAC氰基10非球型Durapak OPN氰基37-75球形DurapakCarbowax400/Porasilc羟基37-75球形Yanapak ODS十八烷基硅烷10球形Yanapak DMC二甲基硅烷5，10球形Yanapak CN烷基腈10球形Nucleosil-Nme2二甲氨基5，10球形Nucleosil-NO2硝基5，10球形日立胶3050十八烷基硅烷20-25球形日立胶3011-0甲醇基20-25球形七. 离子交换色谱固定相离子交换色谱固定相是一类带有离子交换功能团的固体颗粒，其结构为交联的高分子骨 架上结合可离解的无机基团。其结构为交联的高分子骨架上结合可离解的无机基团。在离子 交换反应中，离子交换剂的本结构不发生明显的变化，仅由带有的离子与溶液中同电性离子 发生等当量的离子交换。高效液相色谱使用的离子交换树脂主要有微网状交换树脂、大网状交换树脂、薄壳型交 换树脂和表面多孔型交换树脂。1. 网状交换树脂这是一类在离子交换色谱中出现较早的离子交换剂，它是以二乙烯苯与苯乙烯的共 聚物为基体，并在其网状结构中引入各种不同的酸碱基团作为交换基团而形成的。这种 离子交换树脂的特点是交联度高（即二乙烯苯含量高），骨架紧密，具有细小的孔径（交 联度8%的离子交换树脂的孔径小于50A。），适用于小分子化合物的分离，并有较高的 柱容量。缺点是由于它的孔径小，故传质慢，保留时间长，柱效较低。2. 大网状离子交换树脂这种树脂骨架结构与上基本相同，只不过其中加入了惰性溶剂。其特点是具有很多 的大孔和众多的微孔，表面积大。由于大孔的存在，树脂颗粒中心能通过大分子，减少 了固定相的传质阻力。能适用于大分子化合物的分离。缺点是大多具有溶胀性，不能承 受高压。3. 薄壳型离子交换树脂4. 表面多孔型离子交换树脂离子交换色谱主要用于分离离子型化合物。在选择树脂时遵循以下原则：a. 强碱性化合物选用弱酸性阳离子交换树脂b. 弱碱性化合物选用强酸性阳离子交换树脂（常见树脂上的离子为：HSO，COOH, SO3 -2c. 强酸性化合物选用弱碱性阴离子交换树脂d. 弱酸性化合物选用强碱性阴离子交换树脂（常见树脂上的离子为：n+R3, n+R3X, nh2,R4N+C1-, N+（CH3）3,）八. 凝胶色谱固定相凝胶色谱是按样品中分子大小和形状不同而进行分离的，其分离效果取决于凝胶类 型。凝胶是含有大量液体（一般是水）的柔软而富有弹性的物质。九. 高效液相色谱流动相.溶剂对分离度的影响溶剂强度直接决定容量因子（组分在两相中的平衡分配），溶剂强度强，容量因子 就小，溶剂强度弱，容量因子就大；溶剂的变化还直接与组分在固定相和流动相之间的 相互作用；理论塔板数随着溶剂粘度的增大而减小，与粘度的平方根成正比。.对流动相的一般要求a. 纯度要高b. 溶剂脱气c. 应避免使用对柱效有损失或使保留特性发生变化的溶剂d. 溶剂对样品要有适宜的溶解度，否则在柱头部分会产生沉淀e. 溶剂的粘度要小（溶剂的粘度增大，柱压增高，分离时间就会延长，故流动相的粘度一般不超过0.005Pas）f. 溶剂要与检测器匹配常用反相色谱流动相的粘度值有机溶剂/水（v/v）甲醇乙月青四氢呋喃0/1000.890.890.8920/801.400.981.2240/601.620.891.3860/401.540.721.2180/201.120.520.85100/00.560.350.46常用反相色谱流动相与强度k值甲醇/水乙月青/水四氢呋喃/水k0/1000/1000/10010010/906/944/964020/8012/8810/901630/7022/7817/83640/6032/6823/772.550/5040/6030/70160/4050/5037/630.470/3060/4045/550.280/2073/2753/470.0690/1086/1463/370.03100/0100/072/280.01十.液-固吸附色谱流动相的选择液-固吸附色谱中，溶剂将吸附剂吸附着的组分洗脱下来的能力是不同的，为了比较洗 脱能力的相对大小，引入洗脱序列的概念。溶剂的洗脱强度用。表示，极性越强，洗 脱强度越大。下表是相对于氧化铝吸附剂的。值。溶剂。溶剂。氟烷-0.25二氯甲烷0.42正戊烷0.001，2-二氯乙烷0.44Si 异辛烷0.01甲乙酮0.51石油醚0.011-硝基丙烷0.53正癸烷0.04三乙胺0.54环己烷0.04内酮0.56环戊烷0.05二氧六环0.561-戊烯0.08四氢呋喃0.57二硫化碳0.15乙酸乙酯0.58四氯化碳0.18乙酸甲酯0.60二甲苯0.26二乙胺0.63异丙醚0.28硝基甲烷0.642-氯丙烷0.29乙月青0.65甲苯0.29毗啶0.711-氯丙烷0.30二甲亚飒0.75苯0.32乙醇0.88漠乙烷0.35甲醇0.95乙硫醚0.38丁二醇1.1氯仿0.40正丙醇，异丙醇0.82十一.液-液分配色谱流动相的选择1. 正相色谱流动相的选择：在外界条件一样的情况下，增大流动相的极性，即溶剂的溶解 度参数增加，组分的保留时间就缩短，反之则相反，其溶剂组合方式与吸附色谱相似。常用 溶剂的极性排列如下：水（极性最大），甲酰胺，乙腈，甲醇，乙醇，丙醇，丙酮，二氧六 环，四氢呋喃，甲乙酮，正丁醇，乙酸乙酯，乙醚，异丙醚，二氯甲烷，氯仿，漠乙烷，苯， 氯丙烷，甲苯，四氯化碳，二硫化碳，环己烷，己烷，庚烷，煤油。2. 反相色谱流动相的选择：从反相色谱的特点看，流动相的极性强于固定相，因此，反相 色谱通常是用极性最强的溶剂-水作为流动相。为改善分离效果，还往水中加入一定量的、 可与水混溶的所谓有机改善剂。经常使用的有机改善剂有甲醇、乙腈、四氢呋喃、和二 氧六环等，尤以甲醇和乙腈应用最广泛。反相色谱的流动相中，还经常加入一定量的缓冲剂， 以防止溶质的离解。常用的缓冲剂有甲酸、乙酸、丁二酸、磷酸、乙酸铵等。十二.离子交换色谱流动相的选择在离子交换色谱中,分离度的控制主要是通过流动相的pH值和离子强度的调节来控制 的。提高流动相的盐浓度，可减少样品组分的保留时间。原因是降低了样品离子与流动相中 离子交换树脂上滞留次序：阴离子在离子交换树脂上滞留次序：柠檬酸根 SO42- C2O42- I- NO3- CrO42- Br- CNS- HCOO- CH3COO- OH- F-阳离子在离子交换树脂上滞留次序：Ba2+ Pb2+ Sr2+ Ca2+ Ni2+ Cd2+ Cu2+ Co2+ Zn2+ Mg2+ UO22+ Te+ Ag+ Cs+ Rb+ K+NH+Na+H+Li+4流动相的pH值直接影响样品中组分的解离和离子交换剂表面交换基团的电离。对阳离 子交换柱来讲，流动相pH值增加，组分保留时间缩短。阴离子则相反。十三.梯度洗脱为解决恒定流动相组成洗脱中造成的色谱图中峰前挤后宽的现象,就需要采用梯度洗脱 技术，梯度洗脱是指在分离过程中逐渐改变流动相的组成,使溶剂强度逐渐增加，就可以大大 改善峰形，不但提高了峰检测灵敏度，而且缩短了检测时间。在梯度洗脱实际操作中，总是将 极性强的溶剂逐渐加入到极性弱的溶剂中（反相色谱刚好相反）。值得注意的是每次梯度洗 脱后的柱子在下次使用前必须进行处理，以除去强溶剂成分。十四.高效液相色谱分离类型的选择高效液相色谱有四种类型，即液固吸附色谱、液-液分配色谱、离子交换色谱、凝胶色 谱。在实际应用时，应根据试样的特性，如分子量大小、化学结构、溶解度等进行选择。1. 分子量低分子量化合物，由于挥发性高，适用于气相色谱分离。分子量200-2000 范围的化合物，可采用液-固吸附色谱、液-液分配色谱、离子交换色谱。对分子量大于2000 的化合物，如高分子蛋白、核酸、多酚等可采用凝胶色谱。2. 溶解度 对分子量小于2000的式样，可依据它们的溶解度来考虑分离类型。水溶性 好的最好使用液-液分配色谱或离子交换色谱。微溶于水，但在酸、碱条件下能很好电离的 化合物，也可用离子交换色谱。易溶于烃类溶剂的化合物，可用液-固吸附色谱。3. 分子结构根据分子结构选择分离方式，如离子交换色谱用于分离含有离子基团和能电离的化合物。液-固吸附色谱可用于异构体分离。液-液分配色谱可用于同系物分离。对高 分子聚合物可用凝胶色谱。