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基于片断的药物设计 Fragment-based drug discovery,郭宗儒 2009-10-16,From Leach AR, Hann MM, Burrows JN et al. Fragment screening: an introduction. Mol. BioSyst., 2006, 2: 429-446,对靶标认识水平不同的药物分子设计,苗头和先导物的发现途径,天然活性物质 基于结构的分子设计 随机筛选 虚拟筛选,问题的出现,以靶标为核心的新药研发，切入点是用体外方法评价活性活性。 苗头化合物(hit)多以活性强度为衡量标准。 hit-to-lead和先导物优化，大都加入或变换基团，以增加与靶标结合的机会和强度。 一般“不敢”去除基团或片断，以免丢失参与结合的原子或基团(即药效团)。 高通量筛选的化合物过于“成熟”，留给后续的结构变换的余地小，导致投入-产出比低。,高通量筛选的不足,发现苗头的概率很低。理论计算，含有30个C、N、O、S原子的化合物有1060种，而高通量筛选的化合物数即使以百万计(106)，筛选也只占很少部分。 化合物分子量比较大，亲脂性强，优化成药的难度大。组合化学库尤甚。 分子量160的含上述院子化合物数为107，筛选的分子为103104 个。发现苗头的几率高。 公司之间的化合物的结构类型相似，筛选靶标相同，易有知识产权之纠葛。,片 断 及 其 特 征,片断是比类药分子小的化合物，分子量或非氢原子数低于类药性化合物。 化学结构比类药分子简单。 片断应易溶于水，因需要高浓度试液方呈现与靶标的结合信号。 结构上有可以延伸的位置、原子或基团。 没有化学活泼的反应基团。,Congreve M et al. Drug Discov Today. 2003, 8: 876。,由苗头物发展成先导物的性质变化,参数 苗头物均值 先导物均值 增量 分子量 174.1 382.8 207.7 氢键给体 1.7 1.7 0 氢键接受体 2.9 5.6 2.7 非氢原子数 12.8 28.5 15.7,增量大,由先导物发展成药物的性质变化,参数 先导物均值 成药后均值 增量 分子量 272.0 314.0 42.0 氢键给体 0.8 0.8 0 氢键接受体 2.2 2.5 0.3 Clog P 1.9 2.4 0.5 非氢原子数 19 22 3,增量小,FBDD的背景1,Andrews分析了200个药物和抑制剂的结合常数与结构的关系，得出了10 个常见功能基和原子对结合能的贡献均值。,带电荷的基团与受体结合的贡献强于极性基团，极性基团又强于非极性基团。,Andrews P et al. Med. Chem.1984, 27, 1648,* kcal/mol,FBDD的背景2,Kuntz等分析了150个含有167个原子构成的离子或化合物与受体的结合常数，按照下式计算了结合常数与系统自由能变化的关系，进而推定出每个原子对结合的贡献。 G结合 = G复合物 G参比态 = RTlnK 当非氢原子数在15个以内，结合能随原子数的增加而线性增高，平均每个原子的贡献为1.5 kcal/mol；超过15个原子后结合能的变化趋于不变，成为非线性变化，这种现象归因为非热力学因素。 Andrews和Kuntz的研究为配体效率概念奠定了基础。,配体效率(ligand efficiency, LE),分子大小影响物化和药代性质。 减少苗头、先导物中冗余原子的必要性。 配体效率是衡量苗头物或先导物以及优化的化合物的质量的参数，表征化合物的活性效率。 系指配体(苗头、先导物、优化物等)中每个原子对结合能的贡献，在选取先导物和优化过程中是个有用的指标。 计算方法：首先是将复合物结合常数Kd转换为在温度300K的结合的自由能(G) 。 G -RT.lnKd = 1.37 pKd G除以非氢原子数，得出每个原子的自由能贡献即配体效率，用下式表示： LE = G/N非氢原子,配体亲脂性效率,配体效率是将化合物的活性在分子大小的尺度上加以表征，是优化过程中监测化合物的活性、物化性质和成药性程度的一个指标。 还可用配体-亲脂性效率指数(ligand-lipophilicity efficiency, LLE)表征先导物和优化的质量。LLE 的定义是 pIC50 (或pKi) - cLogP (或 LogD) Congreve M et al. J Med Chem, 2008, 51: 3661,契 合 质 量,在结构优化中，当分子量的加大，即使活性增大，配体效率却变化不大，甚至减小。以致不能反映和揭示优化过程的实际状态。 Reynolds等提出了配体的契合质量的概念(fit quality, FQ)，以消除因分子量加大，LE的变化被掩饰和拉平的效应。 计算方法是将化合物的非氢原子数归一和标度化，得到相应的LE-Scale，分子中不同原子数，LE-Scale值不同，按如下定义： LE-Scale 0.064 + 0.873e(-0.026HA) 或将幂式展开：LE-Scale 0.0715 + (7.5382/HA) + (25.7079/HA2) + (361.4722/HA3) 配体的契合质量FQ按照如下计算： FQ = LE/LE-Scale FQ将上述的非线性标准化，使配体之间的结合效率有可比性。 Bembenek SD et al. Drug Discov Today. 2009, 14: 278,当非氢原子低于20时，最大亲和力与原子数成线性关系；超过20后活性趋于不变或下降。,若以非氢原子数与配体效率作图，原子数在1025的化合物配体效率呈线性变化。,契 合 质 量,Reynolds CH, BMCL. 2007, 17: 4258,非氢原子数 LE scale 相邻差值 10 0.7204 11 0.6972 0.0232 12 0.6685 0.0287 13 0.6367 0.0318 14 0.6091 0.0276 15 0.5809 0.0282 16 0.5545 0.0264 17 0.5300 0.0245 18 0.5072 0.0228 19 0.4877 0.0195 20 0.4672 0.0205 21 0.4494 0.0178 22 0.4331 0.0167 23 0.4179 0.0152 24 0.4039 0.0149 25 0.3908 0.0131 26 0.3787 0.0121 27 0.3674 0.0113 28 0.3568 0.0106 29 0.3471 0.0097 30 0.3378 0.0093,片断化合物库,体外筛选评价,达到规定活性,复合物单晶结构,是,否,计算机辅助设计,药物化学合成,确定先导物,达到规定活性,是,否,片断化合物库(约1000-2000个化合物) 体外活性筛选 结构生物学：复合物X-线晶体学或 NMR或MS 计算机分子设计辅助 药物设计和化学合成 活性评价 结构生物学或分子对接 构效分析 确定先导物,基于片断的药物设计：方法的整合性,片断化合物举例,片断分子,受体结合部位,片断连接,片断分子分别筛选与组合库比较,6 X 6片断组合库,FBDD需要有灵敏的检测手段,NMR方法： Skinner AL, and Laurence JS. J Pharm Sci. 2008, 97: 4670 X-ray方法：Jhoti H et al. Curr Opin Chem Biol. 2007, 11: 48 SPR方法： Neumann T et al. Curr Top Med Chem.2007, 7: 1630 MS方法： Annis DA et al. Curr. Opin. Chem. Biol. 2007, 11: 51,0,100,200,300,400,500,600,700,1 mM,100 M 1M 10 nM 1 nM,药物,HTS苗头物,药物候选物,片断化合物,药效强度,相对分子质量,Rees et al., Nature Rev. Drug Disc. 2004,上市的口服药物平均分子量为340。 处于 I 期临床试验的候选药物，分子 量小于400的成功率为50%，分子量加大，成功率降低。 Wenlock et al, J Med Chem 2003,配 体 效 率 (LE),Fragment Rule of 3 MW 300 # H-Bond Donor = 3 # H-Bond Acceptors = 3 cLogP = 3 # Rotatable bonds = 3,片断只结合于受体的部分结合位点,片断演化成先导物的三种模式,片断的生长 片断的连接 片断的融合,与受体结合的相邻的两个片断经连接基连接成活性强的较大分子,与受体结合的相互交盖或甚近的两个片断合并成活性强的较大分子,以受体结合的第一个片断为核心，经理性设计，在邻近处逐渐生长成活性强的较大分子,IC50(M) 80 12 3.0 0.51 0.20 0.031 0.018 No HA 10 15 15 20 23 21 24 LE(kcal/mol) 0.47 0.48 0.61 0.43 0.40 0.49 0.44 FQ 0.70 0.83 1.05 0.92 0.96 1.09 1.09 .,片断生长：蛋白激酶B(PKB)抑制剂先导物,优化结构要求化合物的配体效率保持在0.30 以上。 基于PKB与苗头物的三维结合特征，发现在苯环对位的结合部位有负性基团和较大的腔穴。 合成了含有碱性基团的化合物，活性提高，虽分子量增大，仍保持了LE值。 加入新的苯环，仍维持了相同的配体效率。 最后在新的苯环上引入卤素，得到高活性。,(Saxty G et al. J Med Chem 2007, 50: 2293),S-isomer, (0.28M),R-isomer, (31 nM),片断生长: 周期蛋白依赖的激酶抑制剂,周期蛋白依赖的激酶(CDK)活性取决于周期蛋白的存在,其表达水平与细胞周期相关。抑制CDK可抑制肿瘤生长。,两个氢键和芳环疏水作用,MW=316 IC50=0.66M LE=0.38,MW=316 IC50=0.66M LE=0.38 LQ=0.85,Leu81羰基形成氢键, Ile10 and Leu134与苯环的疏水作用,MW=118 IC50=185M LE=0.57 LQ=0.76,MW=187 IC50=97M LE=0.39 FQ=0.64,另一思路是去除苯并环,活性减弱, 但LE未降,MW=258 IC50=0.85M LE=0.44 FQ=0.90,简化后的吡唑4位可向外生长, 氢键给体有利于结合.活性明显提高,LE大增,23,33,MW=337 IC50=0.14M LE=0.39 FQ=0.97,MW=373 IC50=0.003M LE=0.45 FQ=1.19,苯甲酰胺的活性略增, LE降低. 苯环离开羰基明面51, 说明不稳定,苯环2,6位双取代稳定了构象,活性提升, 但进入细胞能力弱, ClogP过大,分子内氢键所致,.,MW=395 IC50=0.047M LE=0.42 FQ=1.06,二氯取代, 对酶和细胞活性均明显增高,MW=362 IC50=0.14M LE=0.31 FQ=0.79,AT7519 于10M 对 P450 1A2, 2D6, 3A4, 2C9, 2C19的抑制作用30% 水溶性(HCl盐)：25mg/ml 进入临床研究,苯环换成哌啶, 酶活水平性降低, 但对细胞作用增强,Wyatt PG, Woodhead AJ, Berdini V et al. Identification of N-(4-Piperidinyl)-4-(2,6-dichlorobenzoylamino)-1H-pyrazole-3-carboxamide(AT7519), a Novel Cyclin Dependent Kinase Inhibitor Using Fragment-Based X-Ray Crystallography and Structure Based Drug Design. J Med Chem, 2008, 51, 49864999,Hajduk等研究红霉素耐药菌甲基转移酶抑制剂 ，用NMR方法筛选片断分子，发现氨基均三嗪的Ki=1 mM，均三嗪骨架适于平行合成，将甲硫基替换成各种胺基，得到先导化合物，Ki = 8 M.,Hajduk PJ, Dinges J, Schkeryantz JM et al. Novel inhibitors of Erm methyltransferases from NMR and parallel synthesis. J. Med. Chem. 1999, 42, 3852-3859.,片断生长 + 平行合成：甲基转移酶抑制剂,片断生长：极光激酶抑制剂,极光激酶(Aurora kinase)调节细胞有丝分裂起关键作用，是抗癌药物的靶标。 用蛋白浸泡技术发现吡唑基苯并咪唑可结合极光激酶A， X-线晶体学研究表明，该化合物结合于在激酶深部的ATP结合位点。 进而发现苯甲酰氨基化合物活性增强，因为占据了一个疏水腔。 为了同时提高对于Aurora B的抑制作用，在苯并咪唑的5位引入吗啉环，提高了对Aurora A和B的抑制活性。 该化合物的小鼠药代动力学性质为：Cl =43 (mL/min)/kg, F= 26%，而血浆蛋白结合率过高(99.5%)。为了全面优化药效和药代性质，分析该化合物的晶体结构，发现氟代苯基并未完全适配于结合腔内，在不增加分子量和ClogP的原则下，保持分子骨架和药效团不变，将苯甲酰胺基变换成环丙脲基AT9283 ，药效和药代性质均明显优化。,IC50(M) 0.091 0.070 0.010 0.003 LE 0.50 0.49 0.35 0.42 FQ 1.09 1.18 1.07 1.17,尿激酶型纤维蛋白溶酶原活化抑制剂,尿激酶型纤维蛋白酶原激活剂(uPA)与其受体(uPAR)结合，可催化裂解纤维蛋白酶原的Arg/Val酰氨键生成纤维蛋白酶，后者负责许多蛋白的水解过程，降解胞内基质的多种成份，引发细胞的迁移，所以，uPA介导了许多病理过程如主动脉瘤、多发性硬化症和癌转移等。 抑制uPA的作用可望治疗这些疾病。筛选小分子弱碱性药物美西律(mexiletine)对uPA的抑制作用IC501 mM，且只有R构型与酶结合， 晶体衍射表明，伯氨基与Asp189的羧基、Ser190的羰基以及Gly219形成氢键，苯基与亚乙基与S1疏水强结合。美西律虽配体效率只有0.32，但水溶性很好，且口服生物利用度F=90%，pKa=9.2，碱性不象既有的uPA抑制剂过强，故是良好的起始物。 根据萘脒具有活性说明苯环的对位有空间，可引入酸性基团，去掉侧链甲基以消除手性原子，将2,6-二甲基换成二氯，IC5040 M，在晶体结构的引导下，酰苯胺的 IC50=5.2 M，IC50=720 nM，最后经SAR设计化合物活性提高10倍，IC50=72 nM。对大鼠具有良好药代动力学性质，半衰期t1/2=7.5 h，F =60%,IC50 1 mM 40 M 5.2 M 720 nM LE 0.32 0.40 0.29 0.29 FQ 0.57 0.76 0.74 0.84,IC50 =72 nM LE = 0.32 FQ = 0.97,片断连接：FKBP抑制剂,用核磁共振研究FKBP抑制剂，称作SAR by NMR。用15N 标记的FKBP筛选片断库的结合作用，观察和确定酰胺键的15N- 和1H化学位移的变化。 筛选两种分子1和2有弱结合作用。连接成3为强抑制剂。,1 2 3 Kd 2 M 100 M 49 nM 非氢原子数 26 17 45 LE(kcal/mol) 0.30 0.32 0.22 FQ 0.79 0.64 1.06,Shuker SB et al. Science, 1996, 274:1531,片断连接：他克林形成挛药,胆碱酯酶有两个结合位点：深部窄口处的催化部位和暴露于水相的外部位点。 将适宜长度的碳链连接他克林，提高了活性。,Ki=0.018M(小鼠) IC50=0.59M(大鼠脑) HA No=15 LE=0.57 FQ=0.98,IC50=0.0004M(大鼠脑) HA No=37 LE=0.35 FQ=1.25,Pang YP, Quiram P, Jelacic T et al. Highly potent, selective, and low cost bis-tetrahydroaminacrine inhibitors of acetylcholinesterase. Steps toward novel drugs for treating Alzheimers disease. J. Biol. Chem. 1996, 271, 23646-23649.,3,Lewis WG, Green LG, Grynszpan, F et al.Click chemistry in situ: Acetylcholinesterase as a reaction vessel for the selective assembly of a femtomolar inhibitor from an array of building blocks. Angew. Chem., Int. Ed. 2002, 41, 1053-1057,6,Ki=1.1M(小鼠) HA No=31 LE=0.26 FQ=0.80,Ki=0.018M(小鼠) HA No=15 LE=0.57 FQ=0.98,Ki=0.00000041M(小鼠) HA No=48 LE=0.35 FQ=1.80,Sharpless等用环加成反应将两个不同的抑制剂片断经连接基生成fmole级的高活性胆碱酯酶抑制剂,片断连接：他克林与另一弱作用片断形成强抑制剂,片断融合：自组装碳酸酐酶抑制剂,两个片断独立结合于邻近的两个位点，化学活性功能基自组装成亚胺，还原生成高活性抑制剂,. Swayze EE; Jefferson EA, Sannes-Lowery KA et al.SAR by MS: A ligand based technique for drug lead discovery against structured RNA targets. J Med Chem. 2002, 45, 3816-3819.,片断融合：用质谱方法研究U1061A RNA抑制剂,U1061A RNA是抗微生物感染的靶标。 质谱法可在高浓度下进行。 可给出结合信息：化学计量性，竞争结合性。 化合物1和2可同时结合于靶标，二者非竞争性结合，位点不同，相距邻近。 1和2融合一起，提高了活性。,IC50 40 M 41 M 0.064M No HA 12 19 31 LE 0.32 0.50 0.31 FQ 0.48 1.02 0.97,分子量,分布系数,药代 过膜性 生物利用度,药代 半衰期代谢稳定性,药效 配体效率,药效 配体亲脂效率,分子体积,杂原子数,分子表面积,氢键接受 体,氢键给体,可旋转性键,极性表面积,分子量和分布系数是优化物化性质、药效学、药代动力学的高度概括,改编于Johnson et al. BMCL, 2009,19:5560,请指正 谢谢,