从动物肝组织中分离、提取.ppt

,从动物肝组织中 分离、提取、纯化 和鉴定一种酶,10级七年二班 第五组,材料的选择,因动物肝脏中的酶往往结合较多的脂质、核酸的物质，所以取饥饿24小时的动物肝脏为实验材料。,材料的预处理,细胞破碎 机械破碎法：可选用捣碎法或匀浆法。 使用匀浆法时应先将大块的组织或者细胞团用组织捣碎机或研磨器械捣碎分散。 研磨法常用于微生物和植物组织细胞的破碎故本实验不采用。 物理破碎法：冻融法、渗透压法和超声波破碎法均可。 使用冻融法应注意不能在过高的温度下操作，以免引起酶的变性失活。 使用超声波破碎法应注意操作需在冷库中进行，或将样品置于冰浴中，并采用问歇操作，如破碎3060 s，间歇1 min，如此反复进行。 化学破碎法：常用的化学试剂有： 有机试剂（甲苯、丙酮、丁醇、氯仿等）； 表面活性剂（Tween、特里顿（Triton）等）； 螯合剂（EDTA：乙二胺四乙酸）等。他们都可以增加细胞膜的通透性，是酶容易释放。 酶溶法：因对此肝酶不了解故不采用此方法。,2.防止蛋白酶的水解作用： 预防的措施是加入蛋白酶抑制剂。常用的丝氨酸蛋白酶抑制剂有苯甲基磺酰氟（PMSF）、二异丙基氟磷酸；金属蛋白酶抑制剂有EDTA和EGTA（乙二醇四乙酸） 3.除核酸： 一般微生物和植物的粗酶液中有大量的核酸污染。除核酸的常用方法是沉淀法，沉淀剂的选择需要大量的试验来选定，已知的有1%2%的链霉素硫酸盐、PEG、溶菌酶等。,酶的提取,1.常用方法：盐溶液提取、酸溶液提取、碱溶液提取和有机溶剂提取。 本实验中因缺乏酶的更多信息，故采用盐溶液提取法。,盐溶液提取：适用于大多数酶。盐溶现象：大多数P酶在低浓度的盐存在的条件下，酶的溶解度随盐浓度的升高而增加。盐析现象：在盐浓度达到某一界限后，酶的溶解度随盐浓度升高而降低。,影响酶提取的主要因素： 酶在所使用溶剂中的溶解度； 酶向溶剂扩散的速度：酶向溶剂扩散的速度与温度（）、黏度（）、扩散面积（）、扩散距离（）及两相间的浓度差（）有密切关系； 温度：在不影响酶活性的条件下，适当提高温度，有利于酶的提取。适当提高温度，可以提高酶的溶解度，也可以增大酶分子的扩散速度，但是温度过高，易引起酶的变性失活，所以提取时温度不宜过高。,pH值：提取时，溶液的pH值不宜过高或过低，以免引起酶的变性失活，并避开酶的等电点。当pH值等于某酶的等电点时，酶分子的溶解度最小。 提取液的体积：增加提取液的用量，可以提高酶的提取率。但是过量的提取液，会使酶的浓度降低，对进一步的分离纯化不利。因此，控制提取液的总量一般为原料体积的35倍。,酶的分离,常用的酶分离方法有沉淀法、层析法、电泳法、离心法、过滤和膜分离法、萃取法等。 因本实验中对此种酶的了解有限，故应采用等电点沉淀法。 已知所需酶的pI=6.2，故适宜采用此种方法进行分离。 等电点沉淀法：利用两性电解质在等电点时溶解度最低，及不同两性电解质的等电点不同这一特性，通过调节溶液的pH值，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离的方法。在溶液的pH值等于溶液中某两性电解质的等电点时，该两性电解质分子的净电荷为零，分子间的静电斥力消除，使分子能聚集在一起而沉淀下来。因此可以通过调节介质的pH，把目的酶和杂蛋白分开。但由于蛋白质在pI点附件一定范围的pH内都可发生沉淀， 只是沉淀的程度很不一样，而且相当多的蛋白质的pI 点很靠近，所以该法的回收率和纯化倍数都不理想， 一般只用于酶的粗分离阶段。,其他沉淀法：盐析法、有机溶剂沉淀法、复合沉淀法需根据酶的种类配置合适浓度的溶液，故无法采用。热处理沉淀法同样不宜。 电泳法：对该酶的带电量不了解。（等点凝胶电泳：会使该酶的亚基分开而不能采用）。 层析法：对酶和层析柱的吸附效果不了解，无法进行分离。 离心法：对酶的大小密度不了解，无法知道所需酶的位置。 过滤法、膜分离法：对酶的大小不了解。 萃取分离法：对酶的溶解度不了解。,酶的纯化、精制,1.结晶： 结晶是溶质以晶体形式从溶液中析出的过程，不仅为酶的结构与功能等的研究提供了适宜的样品，而且为较高纯度的酶的获得和应用创造了条件。通常酶的纯度应当在50%以上，方能进行结晶。常用方法有盐析结晶法、有机溶剂结晶法、透析平衡结晶法、等电点结晶法 由于本实验目的产物为酶，故采用盐析结晶法。 原因：主要用于大分子如蛋白质、酶、多肽等的结晶。特点：不耐热，对pH变化及有机溶剂十分敏感。用中性盐作为沉淀剂，安全、操作简单。盐析结晶法操作包括：加固体盐法；饱和盐溶液；透析扩散法。,有机溶剂结晶法：针对小分子物质的结晶。 等电点结晶法：多用于一些两性物质。,2.浓缩： 从低浓度酶液中除去部分水或其他溶剂而成为高浓度酶液的过程。浓缩的方法很多，离心分离、过滤与膜分离、沉淀分离、层析分离等都能起到浓缩作用。用各种吸水剂，如硅胶、聚乙二醇、干燥凝胶等吸去水分，也可以达到浓缩效果。 本实验采用真空蒸发浓缩法。 真空蒸发浓缩：在一定的真空条件下，使酶液在60以下汽化蒸发，进行浓缩的过程。 一般说来，在不影响酶活力的前提下，适当提高温度、降低压力、增大蒸发面积都可以使蒸发速度提高。,3.干燥： 将固体、半固体或浓缩液中的水分或其他溶剂除去一部分，以获得含水分较少的固体物质的过程。 常用方法有真空干燥、冷冻干燥、喷雾干燥、气流干燥和吸附干燥等。本实验采取任何一种均可。,真空干燥：真空干燥是在与真空系统相连接的密闭干燥器中，一边抽真空一边加热，使酶液在较低的温度条件下蒸发干燥的过程。在真空泵之前需要设置水蒸气凝结收集器，以免汽化产生的水蒸气进入真空泵。酶液真空干燥的温度一般控制在60以下。 冷冻干燥：冷冻干燥是先将酶液降温到冰点以下，使之冻结成固态，然后在低温下抽真空，使冰直接升华为气体，而得到干燥的酶制剂。冷冻干燥得到的酶质量较高，结构保持完整，活力损失少，但是成本较高。特别适用于对热非常敏感而价值较高的酶类的干燥。,喷雾干燥：喷雾干燥是通过喷雾装置将酶液喷成直径仅为几十微米的雾滴，分散于热气流中，水分迅速蒸发而得到粉末状的干燥酶制剂。喷雾干燥由于酶液分散成为雾滴，直径小，表面积大，水分迅速蒸发，只需几秒钟就可以达到干燥。在于燥过程中，由于水分迅速蒸发，吸收大量热量，使雾滴及其周围的空气温度比气流进口处的温度低，只要控制好气流进口温度，就可以减少酶在干燥过程中的变性失活。,气流干燥：气流干燥是在常压条件下，利用热气流直接与固体或半固体的物料接触，使物料的水分蒸发而得到干燥制品的过程。气流干燥设备简单，操作方便，但是干燥时间较长，酶活力损失较大。需要控制好气流温度、气流速度和气流流向，同时要经常翻动物料，使之干燥均匀。 吸附干燥：吸附干燥是在密闭的容器中用各种干燥剂吸收物料中的水分，达到干燥的目的。常用的吸附剂有硅胶、无水氯化钙、氧化钙、无水硫酸钙、五氧化二磷以及各种铝硅酸盐的结晶等。,酶纯度的检验,对该酶进行SDS-PAGE电泳，若仅出现3条色带，则说明酶的纯化成功。,By 10级七年二班 张效栋 周安妮 董捷 刘宇萌,Thanks for listening ！,