第十四讲1目的基因导入受体细胞

第一节第一节 重组重组DNADNA分子导入植物细胞分子导入植物细胞 植物转基因方法有三类：载体介导的转化方法；概念：将目的DNA插入到农杆菌的Ti质粒或病毒的DNA上，随着载体质粒DNA的转移而转移。农杆菌介导法DNA直接转化法；通过物理或化学的方法种质系统法；花粉管通道法、胚囊子房注射法1 1 农杆菌介导的农杆菌介导的TiTi质粒载体转化法质粒载体转化法 农杆菌是一类土壤习居菌，革兰氏染色呈农杆菌是一类土壤习居菌，革兰氏染色呈阴性，能感染双子叶植物和裸子植物，对绝大阴性，能感染双子叶植物和裸子植物，对绝大多数单子叶植物无侵染能力。多数单子叶植物无侵染能力。当植物受伤后，伤口处细胞分泌大量的酚当植物受伤后，伤口处细胞分泌大量的酚类物质，如乙酰丁香酮和羟基乙酰丁香酮，它类物质，如乙酰丁香酮和羟基乙酰丁香酮，它们是农杆菌识别敏感植物的信号分子。们是农杆菌识别敏感植物的信号分子。1.1 选择转化外植体应具备的条件选择转化外植体应具备的条件优先考虑叶片、子叶、胚轴等作为外植体材料。优先考虑叶片、子叶、胚轴等作为外植体材料。要注意外植体的年龄，应选择转化能力较强的要注意外植体的年龄，应选择转化能力较强的幼期外植体，同时还要考虑其最佳感受态时期。幼期外植体，同时还要考虑其最佳感受态时期。转化外植体易于组织培养，并有较强的再生能转化外植体易于组织培养，并有较强的再生能力。力。应考虑外植体中易被转化的分生组织感受态细应考虑外植体中易被转化的分生组织感受态细胞所在的部位及其数量。胞所在的部位及其数量。1.2 农杆菌接种操作步骤农杆菌接种操作步骤 外植体的农杆菌接种外植体的农杆菌接种 将切成小块的外植体浸泡在制备好的农杆菌将切成小块的外植体浸泡在制备好的农杆菌液中，浸泡一段时间后，进行共培养。液中，浸泡一段时间后，进行共培养。注意：注意：A A 浸泡时间浸泡时间 B B 工程菌的浓度工程菌的浓度 通常采用较低的菌液通常采用较低的菌液ODOD值和较短的浸泡时间值和较短的浸泡时间来进行外植体的接种。来进行外植体的接种。农杆菌与外植体的共培养农杆菌与外植体的共培养 将接种农杆菌后的外植体培养在诱导愈伤组将接种农杆菌后的外植体培养在诱导愈伤组织或不定芽固体分化培养基上。农杆菌附着、织或不定芽固体分化培养基上。农杆菌附着、T-T-DNADNA的转移及整合都在这个时期完成。的转移及整合都在这个时期完成。注意：不同物种、外植体种类和农杆菌菌株注意：不同物种、外植体种类和农杆菌菌株的最佳共培养时间有所不同。的最佳共培养时间有所不同。烟草叶片烟草叶片 2d 2d 马铃薯块茎马铃薯块茎 2-4d2-4d 脱菌培养脱菌培养 原因：原因：与农杆菌共培养后的外植体表面及浅与农杆菌共培养后的外植体表面及浅层组织中常常共生有大量农杆菌，对外植体的正层组织中常常共生有大量农杆菌，对外植体的正常生长会产生不利影响，必须进行脱菌培养以杀常生长会产生不利影响，必须进行脱菌培养以杀死和抑制农杆菌的生长。死和抑制农杆菌的生长。方法：方法：是指把共培养后的外植体转移到含有是指把共培养后的外植体转移到含有抗生素的培养基上继续培养生长的过程。抗生素的培养基上继续培养生长的过程。时间：时间：需需5-65-6次继代培养次继代培养 抗生素：抗生素：目前使用最多的是头孢霉素，浓度目前使用最多的是头孢霉素，浓度500mg/L500mg/L筛选培养筛选培养 将外植体转移至筛选培养基上继续培养，将外植体转移至筛选培养基上继续培养，筛选出被转化的细胞，经再分化培养成再生植筛选出被转化的细胞，经再分化培养成再生植株。株。2 2 针对不同的外植体以及不同的转化目的而建针对不同的外植体以及不同的转化目的而建 立多种转化方法立多种转化方法 叶盘转化法叶盘转化法 整体植株接种转化法整体植株接种转化法 原生质体共培养转化法原生质体共培养转化法 悬浮细胞共培养转化法悬浮细胞共培养转化法 叶盘转化法叶盘转化法 无菌叶盘 接种 愈伤再生植株 选择注意：A、要求叶子脱分化后能再分化形成植株；B、应用的局限性。整体植株接种转化法整体植株接种转化法 在整体植株上造成创伤在整体植株上造成创伤 接种（注射器注射）接种（注射器注射）愈伤再生植株愈伤再生植株 要求：一般采用无菌的种子实生苗或试管苗要求：一般采用无菌的种子实生苗或试管苗 原生质体共培养转化法原生质体共培养转化法 嫩叶制备原生质体嫩叶制备原生质体 与含重组与含重组TiTi质粒的农杆菌混合培养质粒的农杆菌混合培养 （农杆菌：原生质体（农杆菌：原生质体=100=100：1 1）32h32h后，收集原生质体，加羧苄青霉素杀死农杆菌后，收集原生质体，加羧苄青霉素杀死农杆菌 3-43-4周，形成小愈伤组织，形成再生植株周，形成小愈伤组织，形成再生植株 特点：获得的转化植株来自同一个转化的细胞特点：获得的转化植株来自同一个转化的细胞 悬浮细胞共培养转化法悬浮细胞共培养转化法 此方法类似于原生质体共培养转化法，主此方法类似于原生质体共培养转化法，主要差别是首先建立悬浮细胞系。要差别是首先建立悬浮细胞系。3 植物病毒介导的感染 目前，利用植物病毒载体转化植物细胞大致有以下两种战略：植物细胞原生质体感染；植物组织感染 例：植物双生病毒，成熟的病毒呈双颗粒状，每一颗粒中有一条不同的DNA单链。只有A和B同处一个植物细胞中，才形成具有感染力的病毒。4 4 基因枪法基因枪法 又称又称微弹轰击法微弹轰击法，是利用高速运行的金属颗，是利用高速运行的金属颗粒轰击细胞时能进入细胞内的现象，将包裹在金粒轰击细胞时能进入细胞内的现象，将包裹在金属颗粒（钨或金颗粒）表面的外源属颗粒（钨或金颗粒）表面的外源DNADNA分子随之分子随之带入细胞进行表达的基因转化方法。带入细胞进行表达的基因转化方法。5 5 电击法电击法 细胞膜的基本成分是磷脂双分子层，在细胞膜的基本成分是磷脂双分子层，在适当的外加电压作用下，细胞膜有可能被适当的外加电压作用下，细胞膜有可能被击穿，但不会导致细胞致命的伤害，当移击穿，但不会导致细胞致命的伤害，当移去外加电压后，被击穿的膜孔可被修复。去外加电压后，被击穿的膜孔可被修复。6 显微注射法 利用显微注射仪，通过机械方法把外源DNA直接注入细胞质或细胞核的基因转化方法。此方法的植物样品主要有单细胞、原生质体、分生组织和胚胎组织等多细胞结构。关键是细胞的固定技术。7 7 激光微束法激光微束法 此方法是利用此方法是利用直径很小，能量很高的激直径很小，能量很高的激光微束能引起细胞膜可逆性穿孔光微束能引起细胞膜可逆性穿孔的原理。的原理。在荧光显微镜下找出合适的细胞，然后在荧光显微镜下找出合适的细胞，然后用激光光源替代荧光光源，聚焦后发出激用激光光源替代荧光光源，聚焦后发出激光微束脉冲，造成膜穿孔，处于细胞周围光微束脉冲，造成膜穿孔，处于细胞周围的外源的外源DNADNA分子随之进入细胞。分子随之进入细胞。8 8 多聚物介导法多聚物介导法 聚乙二醇聚乙二醇(PEG)(PEG)、多聚赖氨酸、多聚鸟、多聚赖氨酸、多聚鸟氨酸等都是细胞融合剂。它们可以氨酸等都是细胞融合剂。它们可以使细胞使细胞膜之间或使膜之间或使DNADNA与膜形成分子桥与膜形成分子桥，促使相互，促使相互间的接触和粘连。间的接触和粘连。还可以还可以引起膜表面电荷的紊乱引起膜表面电荷的紊乱，干扰细，干扰细胞间的识别，从而有利于细胞膜间的融合胞间的识别，从而有利于细胞膜间的融合和外源和外源DNADNA进入原生质体。进入原生质体。9 9 花粉管通导法花粉管通导法 将外源将外源DNADNA涂于授粉的枝头上，使涂于授粉的枝头上，使DNADNA沿花粉沿花粉管通道或传递组织通过珠心进入胚囊，转化还不管通道或传递组织通过珠心进入胚囊，转化还不具正常细胞壁的卵、合子及早期的胚胎细胞。具正常细胞壁的卵、合子及早期的胚胎细胞。这一方法技术简单，一般易于掌握，且能避这一方法技术简单，一般易于掌握，且能避免体细胞变异等问题，故有一定的应用前景。免体细胞变异等问题，故有一定的应用前景。第二节第二节 转化率及其影响因子转化率及其影响因子 1 转化率：每微克载体DNA在最佳转化条件下进入受体细胞的分子数。2 转化率的计算 表示方式：一是以转化子数与用于转化处理的DNA分子数或质量的比率表示；例子：1ng 1kb DNA 分子数 109个 得到1000个转化子 转化率：103/109=10-6 含义：106个DNA分子才能获得1个转化子。二是以转化子数与用于转化处理的受体细胞数的比率表示。首先通过菌液的OD值测定或细菌计数，计算用于制备感受态细胞的受体菌总数。然后计算转化子与受体菌的比率。例子：4ml菌液有2108个菌体 得到103个转化子 转化率：103/(2108)=510-6 含义：每个受体菌细胞被转化的概率510-6。或者说，要得到一个转化子，需要 2105个受体菌细胞。3 3 影响转化率的因素影响转化率的因素载体DNA及目标DNA重组 载体本身的性质 一般来说，小分子质量的质粒，转化率高；大质粒通常转化率低，超过30kb的重组质粒很难进行转化。质粒与受体细胞的亲和性 亲和性强的质粒转化率高于亲和性弱的质粒。载体的空间构象 超螺旋构象的载体质粒往往具有较高的转化率，经酶切连接操作后的载体由于空间构象难以恢复，其转化率一般要比新制备的超螺旋质粒低两个数量级。重组DNA的浓度和纯度 3 3 影响转化率的因素影响转化率的因素 受体细胞 受体细胞必须与载体相配 转化方法 不同的转化方法转化效率也有一定的差异。一般来说，电击法转化效率 比较高，其次是Ca2+诱导法，再次是接合法。在同一种转化方法中，不同的技术参数其转化效率也有一定的差异。思考题思考题：农杆菌介导的农杆菌介导的Ti质粒转化法操作步骤质粒转化法操作步骤