反相色谱流动相的设计PPT参考幻灯片

1反相液相色谱反相液相色谱 流动相的设计流动相的设计 反相液相色谱法反相液相色谱法 流动相的选择流动相的选择1.固定相对分离影响回顾固定相对分离影响回顾2.常用的有机溶剂及其选择性常用的有机溶剂及其选择性3.流动相流动相pH值的影响值的影响4.流动相和固定相的优化流动相和固定相的优化5.梯度洗脱程序梯度洗脱程序6.柱温的影响柱温的影响7.应用举例应用举例8.其他关键细节其他关键细节概要概要2 色谱分离的终极目标：关键组分的分离色谱分离的终极目标：关键组分的分离3 反相液相色谱 流动相固定相固定相:键合相类型(C18 vs 苯基)颗粒类型(核-壳 vs 整体硅胶)流动相流动相:溶剂的选择(乙腈 vs 甲醇)流动相 pH 温度 梯度 固定相对分离影响回顾固定相对分离影响回顾5 Kinetex Kinetex 核核-壳技术壳技术2.6um2.6um色谱柱可以提高色谱柱可以提高3 3倍柱倍柱效（与效（与5um5um全多孔比较）全多孔比较）提高柱效改善分离提高柱效改善分离6 提高柱效改善分离提高柱效改善分离7 固定相选择性对分离度的影响回顾固定相选择性对分离度的影响回顾1疏水性疏水性立体互动立体互动氢键给予氢键给予 氢键接受氢键接受阳离子选择性阳离子选择性键合相与样品的交互作用键合相与样品的交互作用:8 9m in12345m A U0255075100125150175m in12345m A U020406080100C18Polar-RP1+212OHHHOHCH3HEstradiolOHHHOCH3HEstroneC18Phenyl固定相选择性对分离度的影响回顾固定相选择性对分离度的影响回顾2 29 LCLC实验室，一定要有一套互补性强的色谱柱实验室，一定要有一套互补性强的色谱柱相关物质检查之系统适应性试验相关物质检查之系统适应性试验10 各种不同基材色谱柱性能比较各种不同基材色谱柱性能比较选择正确的固相载体固相载体 固定相选择性对分离度的影响回顾固定相选择性对分离度的影响回顾3 311 min01234mAU020406080100120 MWD1 A,Sig=220,8 Ref=off(ZA04061ASTEGEM02.D)1.841 1.902 2.839 3.266 Area:210.058 3.86512345Gemini 3u C18全多孔性载体全多孔性载体 从分析到制备从分析到制备 Rs 1&2=1.27Rs 1&2=1.27背压背压 =264 Bar=264 Bar塔板数塔板数 =16700=16700min01234mAU020406080100 MWD1 A,Sig=220,8 Ref=off(ZA04061ASTEONYX2.D)1.497 1.567 2.485 2.956 Area:209.386 3.61712345Onyx C18整体技术载体整体技术载体 对生物样品接受度高对生物样品接受度高 Rs 1&2=1.35Rs 1&2=1.35背压背压 =86 Bar=86 Bar塔板数塔板数=13800=13800min01234Norm.-20020406080100120140 MWD1 A,Sig=220,8 Ref=off(ZA04061ASTEKIN21.D)1.414 1.479 2.441 2.876 3.51412345Kinetex C18核核-壳技术载体壳技术载体提升分离度提升分离度 Rs 1&2=1.61Rs 1&2=1.61背压背压 =340 Bar=340 Bar塔板数塔板数=20300=20300固定相选择性对分离度的影响回顾固定相选择性对分离度的影响回顾4 412 固定相选择性对分离度的影响回顾固定相选择性对分离度的影响回顾5 5推荐的固定相选择必备工具推荐的固定相选择必备工具:1、反相色谱柱选择终极指南画报2、反相色谱柱选择终极指南画册3、反相柱筛分工具13 14有机溶剂的选择有机溶剂的选择 14 常用的有机溶剂常用的有机溶剂流动相的选择比固定相的选择更具有挑战性，因为它的选择的没有限制的。然而，在实际的方法开发中，我们都会大大缩小选项，集中精力在那些会带给我们最大成功可能性的条件上典型的反相溶剂:弱溶剂弱溶剂:水水/缓冲盐缓冲盐强溶剂强溶剂:乙腈乙腈 (64)(64)甲醇甲醇(34)(34)混合溶剂混合溶剂 (1)(1)THF(1)THF(1)使用频率15 选择溶剂的考虑因素选择溶剂的考虑因素一种溶剂的强度取决于疏水性的强弱。溶剂强度会决定洗脱下来一个给定化合物所需的量。反相溶剂的强度:水：0 甲醇甲醇 2.62.6 乙腈乙腈 3.13.1 THF THF 4.4 4.4溶剂选择需要考虑的其他因素：甲醇-粘度较高，在小粒径或长柱提高流速时会受到限制乙腈-价格相对要高四氢呋喃-低波长下有紫外吸收，粘度高 溶剂强度16 溶剂强度溶剂强度:乙腈乙腈 Vs Vs 甲醇甲醇35%甲醇甲醇色谱柱:Gemini 5 m C6-Phenyl,150 x 4.6mm流动相:20mM磷酸二氢钾（pH2.5）%有机溶剂如图所示流速:1.0 mL/min检测波长:220nm1.糖精2.对羟基苯甲酸3.山梨酸4.脱氢乙酸5.对羟基苯甲酸甲酯20%乙腈乙腈用乙腈时分析物更早洗脱下来（即使乙腈的百分比更低）用乙腈洗脱的时候，洗脱顺序发生了变化17 溶剂选择性溶剂选择性 给定溶剂的洗脱强度由它的疏水性决定（如，庚烷比己烷强，因为它的疏水性更强）然而，溶剂的选择性，是由它的极性性质所决定的（如，庚烷和己烷都具有相同的溶剂选择性）乙腈有偶极矩，但是在氢键作用下又是非常弱的质子接受体NCH3四氢呋喃在氢键作用下能接受质子，但不能给予质子O甲醇在氢键作用下既是强的质子给予体又是质子接受体CH3OH18 用不同的溶剂优化用不同的溶剂优化4 4种类固醇的分离种类固醇的分离 溶剂选择性溶剂选择性19 溶剂的筛选溶剂的筛选 (等度条件方法等度条件方法)1.1.从高比例乙腈开始逐步减少，直到从高比例乙腈开始逐步减少，直到kk在在2-102-10之间之间 （如果可能）（如果可能）80%AcCNk=025%AcCNk 621%AcCNk 1140%AcCNk 0.820 溶剂的筛选溶剂的筛选 (等度条件方法等度条件方法)2.2.用其他溶剂重复操作用其他溶剂重复操作:21 苯基色谱柱溶剂的选择苯基色谱柱溶剂的选择 在任何反相的方法中，选择乙腈或甲醇会对最终方法的选择性有显著的影响。然而，当用苯基固定相的时候（如Luna phenyl-Hexyl;Synergi Polar-RP），你会发现甲醇具有更好的选择性，因为它使得苯基固定相的pi-pi作用更为明显。这很可能是因为乙腈氰基上pi电子影响了分析物上的pi电子和固定相苯环上的pi电子之间的作用，而甲醇不会有这样的影响。乙腈上的氰基会干扰固定相苯环与分析物分子之间的pi-pi作用NCH3甲醇在氢键作用下既是强的质子给予体又是质子接受体CH3OH22 苯基色谱柱溶剂的选择苯基色谱柱溶剂的选择色谱柱:Luna 5m C18(2)C18(2)150 x4.6mmLuna 5m Phenyl-HexylPhenyl-Hexyl 150 x4.6mm流动相:A:20mM 磷酸二氢钾 pH 2.5B:27%乙腈 或或 50%甲醇流速:1.0 mL/min化合物:北美黄莲提取物 1.黄莲碱 2.小檗碱23 苯基色谱柱溶剂的选择苯基色谱柱溶剂的选择27:73 乙腈乙腈:20mM 磷酸二氢钾磷酸二氢钾 pH 2.5m in12345m A U02 04 06 08 01 0 01 2 0Luna C18(2)m in12345m A U02 04 06 08 01 0 01 2 0Luna Phenyl-Hexyl24 苯基色谱柱溶剂的选择苯基色谱柱溶剂的选择50:50 甲醇甲醇:20mM 磷酸二氢钾磷酸二氢钾 pH 2.5m in51 01 52 02 5m A U02 04 06 08 01 0 012Luna C18(2)m in51 01 52 02 5m A U01 02 03 04 05 06 012Luna Phenyl-Hexyl25 26缓冲盐和流动相缓冲盐和流动相pHpH值的作用值的作用26 反相色谱中缓冲盐的选择反相色谱中缓冲盐的选择 对于HPLC方法开发来说，从数量众多的缓冲盐中选择出正确的缓冲盐，非常不容易但事实不是这样但事实不是这样,因为只需几种缓冲盐就能解决大多数问题!估计流动相pH值时的实际考虑：1.目标物质的稳定性2.固定相在低pH值条件下水解 酸性强于TFA时，就会造成固定相流失 减少保留，暴露的硅醇基 不同厂家/品牌的填料的稳定极限不同3.高pH值条件下硅胶溶解 一般的硅胶基质固定相稳定至pH8 保护性键合（如Luna）稳定提高至pH10 有机硅胶杂化（如Gemini）稳定提高至pH1227 反相色谱中缓冲盐的选择反相色谱中缓冲盐的选择28 反相色谱中缓冲盐的选择反相色谱中缓冲盐的选择低低pHpH缓冲盐缓冲盐 pKaRangeTFATFA22.5磷酸磷酸2.11.1-3.1甲酸甲酸*3.82.8-4.82.54.57.08.510中性中性pHpH缓冲盐缓冲盐 pKaRange磷酸盐磷酸盐 (pK2)(pK2)7.26.2-8.2高pH缓冲盐 pKaRange碳酸氢盐碳酸氢盐 pK2 pK210.39.3-11.329 pHpH值对固定相的影响值对固定相的影响OSiOSiOSiOHOHOHOOOSiSiSipH 3.5 任何硅胶基质的反相填料键合和端基封尾之后都会有一定的硅醇基残留。这些硅醇基在pH3.5以上都能够去质子化。去质子化的硅醇基能够与碱性的物质形成离子交换作用，造成峰形拖尾硅醇基质子化硅醇基质子化离子交换减少离子交换减少峰形拖尾减少峰形拖尾减少硅醇基去质子化硅醇基去质子化离子交换作用增加离子交换作用增加增加了峰形拖尾增加了峰形拖尾30 pHpH值对分析物的影响值对分析物的影响 反相色谱最主要的保留机理是疏水作用。化合物离子化会使得他们具有极性化合物的行为，减少与固定相的疏水作用，降低保留能力分子的离子化状态可以由流动性的pH值决定。因此，流动性的pH值能影响具有离子化基团的分析物的保留性能 疏水性增强 更强保留 疏水性减小 更弱的保留 疏水性增强 更强保留 疏水性减小 更弱的保留31 pHpH值对分析物的影响值对分析物的影响32 pHpH值对分析物保留行为的影响值对分析物保留行为的影响 H+碱化碱化酸化酸化水溶性流动相水溶性流动相烷烃类键合相烷烃类键合相33 pH值对分析物保留行为的影响 H+碱化碱化酸化酸化水溶性流动相水溶性流动相烷烃类键合相烷烃类键合相H+34 pH值对分析物保留行为的影响 BABAAB阿米替林阿米替林(pKa 9.4)=（B）碱性）碱性甲苯甲苯=(N)中性中性萘普生萘普生(pKa 4.5)=（A）酸性酸性35 pH值对分析物保留行为的影响首选：首选：pH pH pKa pKa2 2次选：次选：pH pH pKa pKa2 236 pH值对分析物保留行为的影响首选：首选：pH pH pKa pKa 2 2次选：次选：pH pH pKa pKa 2 237 化合物化合物pKapKa的预测的预测38 缓冲盐的浓度缓冲盐的浓度 一般采用20mM50mM 依据样品浓度，建议为样品浓度的5倍 依据色谱柱硅羟基活度，活度越大，需要浓度越大 对碱性化合物，高浓度缓冲盐可以减弱反相色谱柱的“阳离子选择性”梯度洗脱和在线混合时注意高浓度缓冲盐的溶解性39 反相色谱柱的阳离子选择性反相色谱柱的阳离子选择性在硅胶表面的带电硅醇基可与带电碱性物质产生离子吸引作用，在硅胶表面的带电硅醇基可与带电碱性物质产生离子吸引作用，可造成正面或负面的影响。可造成正面或负面的影响。40 min00.511.522.5mAU-20020406080100120140 DAD1 A,Sig=210,4 Ref=360,100(DJ031111CATECHOL000065.D)min00.511.522.5mAU0255075100125150175 DAD1 A,Sig=210,4 Ref=360,100(DJ031111CATECHOL000066.D)肾上腺素 阳离子选择性改善极性碱的保留阳离子选择性改善极性碱的保留 Luna PFP(2)Luna C18(2)41 阳离子选择性碱性物质峰形变差阳离子选择性碱性物质峰形变差KinetexKinetex PFP PFPKinetexKinetex XB-C18XB-C18美沙酮美沙酮 美沙酮美沙酮 芬太尼芬太尼 芬太尼芬太尼 42 缓冲盐浓度对阳离子选择性的影响缓冲盐浓度对阳离子选择性的影响Luna 5u SCX 100A 2504.6mm 乙腈：乙腈：50mmol/l磷酸二氢钾（磷酸二氢钾（PH3.0）（）（5：95）43 缓冲盐浓度对阳离子选择性的影响缓冲盐浓度对阳离子选择性的影响Luna 5u SCX 100A 2504.6mm 乙腈：乙腈：100mmol/l磷酸二氢钾（磷酸二氢钾（PH3.0）（）（5：95）44 45流动相和固定相的优化流动相和固定相的优化45 优化流动相选择性优化流动相选择性 溶剂筛选：溶剂筛选：乙腈，甲醇乙腈，甲醇确定适合的确定适合的缓冲盐缓冲盐有有调节调节pH值来调整值来调整保留和选择性保留和选择性选择固定相选择固定相色谱柱色谱柱高效高效 C18是否有是否有pH值的值的特殊限制？特殊限制？调节调节pH值来调整值来调整保留和选择性保留和选择性选择固定相选择固定相色谱柱色谱柱没有没有用乙腈，甲醇在低用乙腈，甲醇在低pH值条件下筛选值条件下筛选46 47优化流动相和固定相优化流动相和固定相分析尼古丁及其代谢物尼古丁尼古丁(pKa 8)可替宁可替宁新烟碱新烟碱去甲烟碱去甲烟碱羟基可替宁羟基可替宁OH47 优化流动相和固定相优化流动相和固定相Kinetex C18是否有是否有pH值的值的特殊限制？特殊限制？没有没有用乙腈在低用乙腈在低pH值值条件下筛选条件下筛选48 49尼古丁和降解产物：初始低尼古丁和降解产物：初始低pHpH值条件筛选值条件筛选流动相：流动相：A 0.1%甲酸水溶液甲酸水溶液 B 0.1%甲酸乙腈溶液甲酸乙腈溶液梯度：梯度：10分钟内分钟内B%从从5%变为变为95%流速：流速：1.5ml/min检测器：检测器：254nm化合物：尼古丁（化合物：尼古丁（0.1%）.进样进样1ul尼古丁尼古丁(pKa 8.5)+CH349 优化流动相和固定相优化流动相和固定相Kinetex C18是否有是否有pH值的特殊限值的特殊限制？制？没有没有用乙腈在低用乙腈在低pH值值条件下筛选条件下筛选调节调节pH值来调整值来调整保留和选择性保留和选择性50 51流动相：流动相：A 10mM 碳酸氢铵碳酸氢铵 pH 10.5 B 乙腈乙腈梯度：梯度：10分钟内分钟内B%由由5%变为变为95%流速：流速：1.5ml/min检测器：检测器：254nm化合物：尼古丁（化合物：尼古丁（0.1%）进样量进样量1ul尼古丁及其代谢物：高尼古丁及其代谢物：高pHpH条件下筛选，增加保留条件下筛选，增加保留51 优化流动相和固定相优化流动相和固定相Kinetex C18是否有是否有pH值的特殊限值的特殊限制？制？没有没有用乙腈在低用乙腈在低pH值值条件下筛选条件下筛选调节调节pH值来调整值来调整保留和选择性保留和选择性Kinetex 在在pH 10.5条件下不稳定条件下不稳定有机硅胶杂化有机硅胶杂化 Gemini NX 3um C1852 53尼古丁及其代谢物：最终方法用杂化颗粒尼古丁及其代谢物：最终方法用杂化颗粒色谱柱：色谱柱：流动相：流动相：pH10.5A 20mM 碳酸氢铵碳酸氢铵B 100%乙腈乙腈梯度梯度时间时间 B%0.00 103.00 783.10 105.00 10流速：流速：0.5ml/min进样体积：进样体积：10ul温度：温度：2553 54梯度分析梯度分析 55梯度分析梯度分析梯度洗脱的目的在于在同一个色谱运行下分离疏水差异很大，并且需要很长时间才能在等度洗条件下脱完全的样品。梯度洗脱：峰形更尖锐，更好定量改善对最后洗脱下来的小峰的检测适于运行完样品后对色谱柱的清洗和再生适于摸索分析条件色谱柱：流动相：70:30 0.1%三氟乙酸水溶液:0.1%三氟乙酸乙腈流速：2.0ml/min组成：1.硫脲（标记为t0）4.苯乙酮 7.苯戊酮 2.咖啡因 5.邻苯二甲酸二甲酯 3.苯酚 6.苯丁酮 55 56梯度分析梯度分析min024681012141618010020030040018min色谱柱：Luna 3m C18(2)50 x4.6mm流速：2.0ml/min流动相：A：0.1%TFA水B：0.1%TFA乙腈min00.511.522.533.544.50501001502002503003501+23456776543214minA:B(70:30)A:B(70:30)B%5%B%5%100%in 100%in 5min5min56 梯度斜率梯度斜率梯度斜率与等度洗脱中的溶剂强度相似梯度斜率与等度洗脱中的溶剂强度相似等度洗脱溶剂强度等度洗脱溶剂强度提高溶剂强度减少分析时间同时降提高溶剂强度减少分析时间同时降低了分离度低了分离度减少溶剂强度增加分离度同时也增减少溶剂强度增加分离度同时也增加了分析时间加了分析时间溶剂强度有时会影响选择性溶剂强度有时会影响选择性梯度斜率梯度斜率提高梯度斜率减少运行时间但是提高梯度斜率减少运行时间但是同时减少了分离度同时减少了分离度减缓梯度斜率增加了分离度但同减缓梯度斜率增加了分离度但同时也增加了分析时间时也增加了分析时间梯度斜率有时也会影响选择性梯度斜率有时也会影响选择性梯度洗脱的目的梯度洗脱的目的:优化分离度的同时缩短分析时间优化分离度的同时缩短分析时间57 梯度分析梯度分析示例：五种除草剂色谱柱：Phenomenex Luna C18 150 x 4.6mm58 梯度分析5种除草剂在等度洗脱模式下：59 梯度斜率对分离度的影响梯度斜率对分离度的影响梯度斜率：梯度斜率：1%/1%/分钟分钟乙腈乙腈20-80%20-80%，6060分钟分钟1234560 梯度斜率对分离度的影响梯度斜率对分离度的影响梯度斜率：梯度斜率：2%/2%/分钟分钟乙腈乙腈20-80%20-80%，3030分钟分钟61 梯度斜率对分离度的影响梯度斜率对分离度的影响梯度斜率：梯度斜率：3%/3%/分钟分钟乙腈乙腈20-80%20-80%，20min20min62 梯度斜率对分离度的影响梯度斜率对分离度的影响梯度斜率：梯度斜率：4%/4%/分钟分钟乙腈乙腈20-80%20-80%，15min15min分离度不够分离度不够!*增加梯度斜率将减少整体的保留时间同时也降增加梯度斜率将减少整体的保留时间同时也降低了分离度低了分离度63 起始有机相百分比对分离度的影响优化后的方法优化后的方法=梯度斜率：梯度斜率：3%/3%/分钟分钟20-80%20-80%乙腈，乙腈，20min20min乙腈30-90%，20min方法调整=梯度斜率：3%/min64 梯度斜率：梯度斜率：3%/3%/分钟，起始强溶剂分钟，起始强溶剂=30%=30%30-90%30-90%乙腈，乙腈，20min20min分离度变小分离度变小!起始有机相百分比对分离度的影响起始有机相百分比对分离度的影响*提高起始强溶剂的量，降减少整体的保留和分提高起始强溶剂的量，降减少整体的保留和分离度离度65 梯度方法开发梯度方法开发1.从摸索梯度条件开始，判断分析物的洗脱时间：5-95%有机相，X分钟（1分钟/厘米柱长）1504.6mm=B%5-95%15分钟2、根据最早洗脱下来的组分，调整起始有机相比例3%有机溶剂等度保持X分钟3.调整梯度斜率优化分离度或关键物质减缓斜率，提高分离度（5-95%B，20分钟）增加斜率，如果分离度足够（5-95%B，12分钟）66 梯度方法开发梯度方法开发4、优化截止有机相比例作为结束 梯度截止在65%B5.调整起始有机相比例缩短运行时间（如果没有极性组成的限制）5-65%B，18分钟 10-70%B，18分钟 15-75%B，18分钟67 梯度程序方法转移时的微调梯度程序方法转移时的微调梯度洗脱梯度洗脱 最小化滞后体积减少循环时间Pump APump BDetectorInjectorMixer68 69柱温的影响柱温的影响69 方法开发中柱温的应用方法开发中柱温的应用HPLCHPLC方法开发中温度的应用非常具有挑战性，方法开发中温度的应用非常具有挑战性，因为它对选择性的影响不可预知因为它对选择性的影响不可预知升高温度将会：升高温度将会：1.1.减少流动相粘度和背压。这样的话可以用更快的流速，或减少流动相粘度和背压。这样的话可以用更快的流速，或者用更长者用更长/粒径更小规格的色谱柱粒径更小规格的色谱柱2.2.缩短洗脱时间缩短洗脱时间3.3.提高方法的重现性（与室温下的操作相比）提高方法的重现性（与室温下的操作相比）然而，不可能确定升高温度是否有利于还是不利于样品的分离。对于一复杂的分离来说，色谱结果中一份的提高几乎都会伴随着其他部分的减少70 方法开发中温度的应用方法开发中温度的应用71 方法开发中温度的应用方法开发中温度的应用在我们的方法开发工作中：在我们的方法开发工作中：1.初始方法会设在30色谱柱筛选流动相的选择和优化2.更高温度的应用仅在：需要降低柱压（通常伴随着提高流速或使用更长的柱子）30度下不能达到理想的分离度72 73方法开举例方法开举例1 1：梯度优化和固定相筛选梯度优化和固定相筛选73 巴比妥酸盐的临床检测巴比妥酸盐的临床检测巴比妥酸盐是CNS镇定剂，用于减少麻醉，治疗焦虑和失眠，但同时常被滥用LC/MS分析这类化合物的困难在于异戊巴比妥和戊巴比妥是异构体，分子量相同，所以必须达到基线分离才行异戊巴比妥异戊巴比妥pKa=7.8戊巴比妥戊巴比妥74 分离目标：分离目标：异戊巴比妥和异戊巴比妥和戊巴比妥分离戊巴比妥分离流动相和固定相的优化流动相和固定相的优化 碱性样品信息：碱性样品信息：无无pHpH值限制值限制样品干净样品干净溶剂溶剂?10cm乙腈，粘度低乙腈，粘度低缓冲盐缓冲盐?低低pH值（甲酸）值（甲酸）75 核核-壳壳C18C18色谱柱：初始的梯度分析条件色谱柱：初始的梯度分析条件1 1、迅速，陡峭的梯度斜率确定分析物的大概情况、迅速，陡峭的梯度斜率确定分析物的大概情况10-90%B 5min;16%/min减小梯度斜率减小梯度斜率保留不错保留不错峰形不错峰形不错没分开没分开76 梯度斜率优化：梯度斜率优化：10-90%B 5min;16%/min10-90%B 10min;8%/min10-90%B 40min;2%/min77 其他可选的方法：其他可选的方法：核核-壳苯基色谱柱壳苯基色谱柱 2%/min核核-壳壳 C18色谱柱色谱柱 2%/min 用甲醇替换乙腈用甲醇替换乙腈78 79其他关键细节其他关键细节79 强溶剂效应强溶剂效应 避免强进样溶剂 应注意最小化管路长度和内径 优化进样器和色谱柱间的连接 选择死体积小的保护柱6w1/2tR6强溶剂进样强溶剂进样80 强溶剂效应强溶剂效应进样溶剂比流动相弱可以使样品集中在柱头进样溶剂比流动相弱可以使样品集中在柱头从而获得更尖锐的峰形从而获得更尖锐的峰形56w1/2tR6弱溶剂弱溶剂进样弱溶剂进样81 强溶剂效应实际案例强溶剂效应实际案例进样进样10uL10uL进样进样5uL5uL方法源：方法源：ChP2010一部：刺五加中紫丁香苷的测定一部：刺五加中紫丁香苷的测定82 检测器采样频率影响分离效果和柱效检测器采样频率影响分离效果和柱效20 Hz1sec5 Hz对于保留因子小于对于保留因子小于3 3的峰，采样频率可能至关重要的峰，采样频率可能至关重要83 3.0s0.15s2.0s建议为建议为 0.1s 至至 0.15s检测器响应时间影响分离效果和柱效检测器响应时间影响分离效果和柱效对于保留因子小于对于保留因子小于3 3的峰，响应时间可能至关重要的峰，响应时间可能至关重要84 检测器响应时间调整效果实际案例检测器响应时间调整效果实际案例85 检测器响应时间调整效果实际案例检测器响应时间调整效果实际案例峰名称峰名称苯乙酮苯乙酮甲苯甲苯萘萘保留因子K1.324.386.47采样频率2s0.12s2s0.12s2s0.12sN93941719816013183571684618353N N 增加增加%81%18%9%R13.7418.0523.0426.5710.4010.91R增加%31%17%8%峰高261340278299356370峰高增加%30%8%2%86 标准标准HPLCHPLC分析仪器（分析仪器（0 010ml泵泵）不适宜采用低流速或小内径色谱柱不适宜采用低流速或小内径色谱柱 常规LC系统的标准流通池一般10L 当柱内径为2.0mm 时，为了得到最佳结果，必须使用 3L 流通池（半微量流通池）替代标准流通池 标准流通池微体积流通池87 KinetexKinetex 核核-壳色谱柱壳色谱柱实现实现HPLCHPLC和和UPLCUPLC方法无缝转移方法无缝转移Acquity UPLC 50 x 2.1 mmProminence UFLC 50 x 3.0 mmAgilent 1200SL 50 x 2.1 mmAgilent 1100 50 x 4.6 mmAcquity and UPLC is a registered trademark of Waters Corporation.Prominence is a registered trademark of Shimadzu.Agilent is a registered trademark of Agilent Technologies,Inc.Phenomenex is in no way affiliated with Waters,Shimadzu,or Agilent Technologies,Inc.88 谢谢！谢谢！89