第10章酶动力学

第第10章章酶动力学酶动力学研究酶促反应的速度以及影响酶促反应速度研究酶促反应的速度以及影响酶促反应速度的各种因素，包括底物浓度、酶浓度、的各种因素，包括底物浓度、酶浓度、pH、温度、激活剂与抑制剂等。温度、激活剂与抑制剂等。1903 Henri enzymesucrose +H2Oglucose +fructose一、底物浓度对酶促反应速度的影响一、底物浓度对酶促反应速度的影响（单底物酶促反应）（单底物酶促反应）（一）（一）中间复合物学说中间复合物学说中间复合物学说认为酶与底物先络合成一个中间产物，然后中间复合物学说认为酶与底物先络合成一个中间产物，然后中间产物进一步分解成产物和游离的酶。中间产物进一步分解成产物和游离的酶。中间复合物学说证据：中间复合物学说证据：p152 p152 SEESPE1903年，年，Henri以蔗糖酶研究底物浓度与反以蔗糖酶研究底物浓度与反 应速率的应速率的关系，关系，提出了酶与底物作用的提出了酶与底物作用的“中间复合物学说中间复合物学说”。（二）（二）“稳态理论稳态理论”Briggs和和Haldane1925 231KEPKESKSE稳态理论的贡献在于：稳态理论的贡献在于：ES的动态平衡不仅与的动态平衡不仅与E+SES有有关，还与关，还与ESP+E有关。有关。所谓所谓“稳态稳态”：ESES的的形成速度形成速度与与分解速度分解速度相等、相等、ESES的浓度保持的浓度保持不不 变的反应状态变的反应状态132KKKKm米氏常数：米氏常数：当当Km及及Vmax已知时，根据米氏方程可确定酶反应速度与底物已知时，根据米氏方程可确定酶反应速度与底物浓度的关系。浓度的关系。max33SKSVSKmSEKESKVmmax33SKSVSKmSEKESKVm米氏方程：米氏方程：（三）（三）用稳态理论推导米氏方程用稳态理论推导米氏方程 231KEPKESKSE1.当当SKm时时:3.当当S=Km时时:2maxmaxVSKSVVmmaxmaxmaxVSSVSKSVVm根据米氏方程可以说明以下关系：根据米氏方程可以说明以下关系：1.当当SKm时时:3.当当S=Km时时:2maxmaxVSKSVVmmaxmaxmaxVSSVSKSVVm根据米氏方程可以说明以下关系：根据米氏方程可以说明以下关系：即即Km是当酶反应速度达到最大反应是当酶反应速度达到最大反应速度一半时的底物浓度，单位：速度一半时的底物浓度，单位：molL-1或或mmolL-1。max33SKSVSKmSEKESKVmmax33SKSVSKmSEKESKVm复复习习1、Km的物理意义的物理意义当反应速度当反应速度v=1/2Vmax时，时，Km=S，Km的物理意义是：当反应速度达到最大反应速度一半时的底物的浓度。的物理意义是：当反应速度达到最大反应速度一半时的底物的浓度。单位：单位：molL-1或或mmolL-1。Km是酶的特征常数之一，一般只与酶的种类、是酶的特征常数之一，一般只与酶的种类、底物种类及反应条件有关，与酶的浓度无关。因此，在特定条件下测定底物种类及反应条件有关，与酶的浓度无关。因此，在特定条件下测定酶的酶的Km值，可以作为鉴别酶的一种手段。值，可以作为鉴别酶的一种手段。一些酶的一些酶的Km值（见表值（见表10-1）。）。（四）（四）米氏方程中各参数的意义米氏方程中各参数的意义有的酶可作用于几种底物，因而就有几个有的酶可作用于几种底物，因而就有几个Km值，其中值，其中Km最小的底物最小的底物称该酶的最适底物或天然底物。因为：称该酶的最适底物或天然底物。因为：Km愈小（达到愈小（达到Vmax一半所需的一半所需的底物浓度愈小）底物浓度愈小）,表示表示V对对S越灵敏。越灵敏。122、Km可以判断酶专一性和天然底物可以判断酶专一性和天然底物VS1/2VmaxKm2Km13、Km与底物亲和力与底物亲和力 Km是是ES分解速度（分解速度（K2+K3）与形成速度（）与形成速度（K1）的比值。）的比值。vK Km m值近似表示酶与底物之间的亲和程度：值近似表示酶与底物之间的亲和程度：K Km m值愈大，表示亲值愈大，表示亲和程度愈小。和程度愈小。131312132KKKKKKKKKKKsm231KEPKESKSE4、Km与米式方程的实际用途与米式方程的实际用途2maxmaxVSKSVVm如当如当SS3 3Km时时（1）根据）根据S求求VV0.75Vmax（2 2）根据相对速度推测酶活性中心饱和度）根据相对速度推测酶活性中心饱和度Y Y：maxSKSVVaYmKmYYS1当当v=Vmax时，表明酶的活性部位已全部被底物占据，时，表明酶的活性部位已全部被底物占据，v与与S无关，只和无关，只和E0成正比。成正比。当当v=1/2Vmax时，表示酶活性部位有一半被底物占据。时，表示酶活性部位有一半被底物占据。5、Kcat的意义：催化常数或的意义：催化常数或转换数转换数 Kcat是指当酶被底物充分饱和时，每秒钟每个酶分子转换是指当酶被底物充分饱和时，每秒钟每个酶分子转换底物的分子数（称为底物的分子数（称为转换数转换数或催化常数），表示酶的最或催化常数），表示酶的最大催化活力的量度。大催化活力的量度。一些酶的转换数见表一些酶的转换数见表10-2。（五）（五）Km和和Vmax的的求解方法求解方法Lineweaver-Burk双倒数作图法（最常用）双倒数作图法（最常用）maxSKSVVmmaxmax111VSVKVm1/Vmax-1/Km1/S1/V斜率斜率=Km/Vmax（一）酶的最适（一）酶的最适pH 最适最适pH：使酶促反应速度达到最大时的：使酶促反应速度达到最大时的pH称为该酶的最适称为该酶的最适pH。最适最适pH与底物种类、浓度及缓冲液成分有关。与底物种类、浓度及缓冲液成分有关。虽然大部分酶的虽然大部分酶的pH酶活曲线是钟罩形，但也有半钟形甚至直线形。酶活曲线是钟罩形，但也有半钟形甚至直线形。二、二、pH对酶促反应速度的对酶促反应速度的影响影响（二）（二）pH影响酶活力的原因影响酶活力的原因过酸或过碱会影响酶蛋白构象，使酶活性丧失。过酸或过碱会影响酶蛋白构象，使酶活性丧失。影响酶和底物分子解离状态，尤其是酶活性中心的解离状态，最终影影响酶和底物分子解离状态，尤其是酶活性中心的解离状态，最终影响响ESES形成。形成。影响酶分子中一些基团解离，这些基团的离子化状态影响酶的专一性影响酶分子中一些基团解离，这些基团的离子化状态影响酶的专一性及活性中心构象。及活性中心构象。三、三、温度对酶促反应速度的影响温度对酶促反应速度的影响（一）最适温度及影响因素（一）最适温度及影响因素 最适温度：最适温度：温度对酶促反应速度的影响有两个方面：温度对酶促反应速度的影响有两个方面：1.温度升高，加快反应速度。温度升高，加快反应速度。2.温度升高，酶变性失活。温度升高，酶变性失活。最适温度不是酶的特征常数，它与底物种类、作用时间、最适温度不是酶的特征常数，它与底物种类、作用时间、pH、离子强、离子强度度等因素有关。等因素有关。温血动物酶的最适温度温血动物酶的最适温度3540；植物酶最适温度；植物酶最适温度4050；微生；微生物差别大，如细菌物差别大，如细菌TaqDNA聚合酶聚合酶70。温度系数温度系数Q10：温度升高：温度升高10，反应速度与原来的反应速度之比，大多，反应速度与原来的反应速度之比，大多数酶的数酶的Q10一般为一般为12。102030405060708090020406080100Temperature OCRelative Activity(%)四、四、激活剂对酶促反应速度的影响激活剂对酶促反应速度的影响（一）（一）无机离子的激活作用无机离子的激活作用无机离子：无机离子：1.金属离子：金属离子：K+、Na+、Mg2+、Zn2+、Fe2+、Ca2+等；等；2.无机阴离子：无机阴离子：Cl、Br、PO43等；等；特点：特点：1.激活剂的选择性，即不同的离子激活不同的酶。激活剂的选择性，即不同的离子激活不同的酶。2.不同离子之间有拮抗作用和可替代作用，如不同离子之间有拮抗作用和可替代作用，如Na+与与K+、Mg2与与Ca2之间之间常常拮抗，但常常拮抗，但Mg2与与Zn2+常可替代。常可替代。3.激活剂的浓度要适中，过高往往有抑制作用，激活剂的浓度要适中，过高往往有抑制作用，150mM激活剂：凡是能提高酶活性的物质，都称为激活剂。包括无机离激活剂：凡是能提高酶活性的物质，都称为激活剂。包括无机离子或简单有机化合物。子或简单有机化合物。许多金属离子是酶的辅助因子，是酶的组成成分，参与催化反应中的电子许多金属离子是酶的辅助因子，是酶的组成成分，参与催化反应中的电子传递。传递。有些金属离子可与酶分子肽链上侧链基团结合，稳定酶分子的活性构象。有些金属离子可与酶分子肽链上侧链基团结合，稳定酶分子的活性构象。有的金属离子通过生成螯合物，在酶与底物结合中起桥梁作用。有的金属离子通过生成螯合物，在酶与底物结合中起桥梁作用。（二）（二）小分子有机物的激活作用小分子有机物的激活作用1.某些激活剂（如某些激活剂（如Cys、GSH）能还原巯基酶中的某些二硫键使）能还原巯基酶中的某些二硫键使成成-SH，-SH是巯基酶起催化作用所需的基团，提高了酶活性。是巯基酶起催化作用所需的基团，提高了酶活性。2.金属螯合剂，如金属螯合剂，如EDTA(乙二胺四乙酸乙二胺四乙酸)，可络合一些重金属离，可络合一些重金属离子，解除它们对酶的抑制，从而使酶活升高。子，解除它们对酶的抑制，从而使酶活升高。五、五、抑制剂对酶促反应速度的影响抑制剂对酶促反应速度的影响失活失活(inactivation)：凡是酶活力的降低或丧失都称为凡是酶活力的降低或丧失都称为酶的失活。酶的失活。抑制抑制(inhibition)：使酶活力下降或丧失但并不引起酶使酶活力下降或丧失但并不引起酶蛋白变性，它主要改变酶活性中心的化学性质。蛋白变性，它主要改变酶活性中心的化学性质。抑制剂（抑制剂（inhibitor）：）：引起酶的抑制作用的物质称为引起酶的抑制作用的物质称为酶的抑制剂。酶的抑制剂。研究抑制剂对酶的作用有重大的意义：研究抑制剂对酶的作用有重大的意义：（1）药物作用机理和抑制剂型药物的设计与开发；抗癌药）药物作用机理和抑制剂型药物的设计与开发；抗癌药（2）了解生物体的代谢途径，进行人为调控或代谢控制发酵；）了解生物体的代谢途径，进行人为调控或代谢控制发酵；（3）通过抑制剂试验研究酶活性中心的构象及其化学功能基）通过抑制剂试验研究酶活性中心的构象及其化学功能基团，不仅可以设计药物，而且也是酶工程和化学修饰酶、酶团，不仅可以设计药物，而且也是酶工程和化学修饰酶、酶工业的基础。工业的基础。（一）抑制程度的两种表示方法（一）抑制程度的两种表示方法1 1、相对活力、相对活力2 2、抑制分数、抑制分数0VVai00011VVVVVaiii（二）抑制作用的类型（二）抑制作用的类型1 1、不可逆的抑制作用、不可逆的抑制作用:抑制剂与酶的必需基团抑制剂与酶的必需基团共价结合共价结合，使酶的活性丧失，无，使酶的活性丧失，无法用透析、超滤等物理方法除去抑制剂而使酶复活。法用透析、超滤等物理方法除去抑制剂而使酶复活。S+EESE+P+IEI2、可逆的抑制作用可逆的抑制作用:抑制剂与酶以抑制剂与酶以非共价键结合非共价键结合引起酶活力降低或丧失，可引起酶活力降低或丧失，可以用透折、超滤等物理方法除去抑制剂而使酶复活。以用透折、超滤等物理方法除去抑制剂而使酶复活。根据可逆抑制剂与底物的关系分为：根据可逆抑制剂与底物的关系分为：（1）竞争性抑制）竞争性抑制（2）非竞争性抑制）非竞争性抑制（3）反竞争性抑制）反竞争性抑制抑制程度抑制程度是由酶与抑制剂之间的是由酶与抑制剂之间的亲和力大小、抑制剂的浓度以亲和力大小、抑制剂的浓度以及底物的浓度决定及底物的浓度决定。（1）竞争性抑制（）竞争性抑制（Competitiveinhibition）酶活性部位是不能同时结合底物与抑制剂的。抑制剂酶活性部位是不能同时结合底物与抑制剂的。抑制剂具有与具有与底物相似的化学结构底物相似的化学结构，竞争酶的活性中心，并，竞争酶的活性中心，并与酶形成可逆的与酶形成可逆的EI复合物，阻止底物与酶结合；可以复合物，阻止底物与酶结合；可以通过增加底物浓度通过增加底物浓度(即提高底物的竞争能力）而解除此即提高底物的竞争能力）而解除此种抑制。种抑制。例如，丙二酸是琥珀酸脱氢酶的竞争例如，丙二酸是琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制剂。性抑制剂。琥珀酸琥珀酸丙二酸丙二酸（2）非竞争性抑制）非竞争性抑制（noncompetitiveinhibition）底物和抑制剂可以底物和抑制剂可以同时与酶结合同时与酶结合，但是，中间的三元复合物，但是，中间的三元复合物ESI不能进一步分解为产物，因此，酶的活性降低；抑制剂与不能进一步分解为产物，因此，酶的活性降低；抑制剂与酶活性中心以外的基团结合，其结构与底物无共同之处；不能酶活性中心以外的基团结合，其结构与底物无共同之处；不能用增加底物浓度的办法来消除非竞争性抑制作用。用增加底物浓度的办法来消除非竞争性抑制作用。例如；某些重金属离子例如；某些重金属离子（Cu2+、Hg2+、Pb2+）对酶的抑制属于）对酶的抑制属于非竞争性抑制。非竞争性抑制。酶只有在与底物结合后，才能与抑制剂结合。酶只有在与底物结合后，才能与抑制剂结合。E+SES+IESI常见于多底物的酶促反应中。常见于多底物的酶促反应中。（3）反竞争性抑制（反竞争性抑制（uncompetitiveinhibition）（三）可逆抑制作用与不可逆抑制作用的鉴别（三）可逆抑制作用与不可逆抑制作用的鉴别1、看通过透析、超滤、凝胶过滤等方法能否除去抑制剂；、看通过透析、超滤、凝胶过滤等方法能否除去抑制剂；2、通过、通过vE动力学曲线区分。动力学曲线区分。213Ev不可逆与可逆不可逆与可逆曲线曲线1 1：无抑制剂：无抑制剂曲线曲线2 2：不可逆抑制剂：不可逆抑制剂曲线曲线3 3：可逆抑制剂：可逆抑制剂（四）可逆抑制作用的动力学（四）可逆抑制作用的动力学推出三种抑制方程：推出三种抑制方程：（1 1）竞争性抑制）竞争性抑制 （2 2）非竞争性抑制）非竞争性抑制 （3 3）反竞争性抑制）反竞争性抑制Vmax不变；不变；Km变大，而且随变大，而且随I浓度的增大而增大浓度的增大而增大)1(maxSKIKSVVim动力学方程：动力学方程：（Ki为为EI的解离常数）的解离常数）1、竞争性抑制、竞争性抑制：交于交于y轴轴2 2、非竞争性抑制非竞争性抑制1maxSKmSVVKiI动力学方程：动力学方程：交于交于x x轴轴Km不变，不变，Vmax降至降至Vmax/（1+I/Ki）3 3、反竞争性抑制反竞争性抑制Km及及Vmax都变小都变小)1(maxSKIKSVVim动力学方程：动力学方程：一组平行直线一组平行直线有无抑制剂时酶促反应的最大速度与Km值的比较 类型类型 方程式方程式VmaxKm反竞争性抑制反竞争性抑制2maxmaxVSKSVVm)1(maxSKIKSVVim1maxSKmSVVKiI)1(maxSKIKSVVim非竞争性抑制非竞争性抑制竞争性抑制竞争性抑制无抑制剂无抑制剂VmaxKm不变不变增加增加减小减小不变不变减小减小减小减小总总 结结（五）一些重要的抑制剂（五）一些重要的抑制剂1 1、不可逆抑制剂、不可逆抑制剂 有机磷化合物有机磷化合物 有机磷化合物的化学结构式有机磷化合物的化学结构式PYOXRROY为氧或硫。含氧的为磷酸酯类，含硫的为硫代磷酸基类。为氧或硫。含氧的为磷酸酯类，含硫的为硫代磷酸基类。目前含硫的硫代磷酸酯类农药由于属剧毒类，现多已停止生目前含硫的硫代磷酸酯类农药由于属剧毒类，现多已停止生产。市场上农药多为磷酸酯类。产。市场上农药多为磷酸酯类。n有机磷农药呈油状或结晶状，淡黄至棕色，稍有挥发性。有机磷农药呈油状或结晶状，淡黄至棕色，稍有挥发性。n较易通过皮肤和黏膜、呼吸道及消化道吸收。较易通过皮肤和黏膜、呼吸道及消化道吸收。n在中毒死亡者中，因服有机磷农药中毒致死者占在中毒死亡者中，因服有机磷农药中毒致死者占83.6%83.6%。病 因 使用性中毒生活性中毒生产性中毒有机磷化合物有机磷化合物n能与乙酰胆碱酯酶的活性部位能与乙酰胆碱酯酶的活性部位的的SerOH形成磷形成磷酯键，强烈地抑制酶的活力，使乙酰胆碱不能够酯键，强烈地抑制酶的活力，使乙酰胆碱不能够被分解而过分积累，导致神经系统过于兴奋，引被分解而过分积累，导致神经系统过于兴奋，引起神经系统功能失调而中毒致死。起神经系统功能失调而中毒致死。乙酰胆碱酯酶乙酰胆碱酯酶磷酰化胆碱酯酶磷酰化胆碱酯酶有机磷杀虫药有机磷杀虫药中毒机制：有机磷农药和胆碱酯酶结合示意图中毒机制：有机磷农药和胆碱酯酶结合示意图解毒剂：解毒剂：PAM（解磷定）可以把磷酰化胆碱（解磷定）可以把磷酰化胆碱酯酶上的磷酸根除去，使酶复活。酯酶上的磷酸根除去，使酶复活。青霉素：不可逆抑制糖肽转肽酶青霉素：不可逆抑制糖肽转肽酶Kc a t型不可逆抑制剂（自杀性底物，型不可逆抑制剂（自杀性底物，suicidesubstrate）这种抑制剂是根据酶的催化反应机制来设计的，它们与天然这种抑制剂是根据酶的催化反应机制来设计的，它们与天然底物的结构类似，其本身也是酶的底物，既能与酶结合，也底物的结构类似，其本身也是酶的底物，既能与酶结合，也能被催化发生反应，但在其分子中具有能被催化发生反应，但在其分子中具有潜伏反应基团潜伏反应基团，当酶，当酶对它进行催化反应时，该基团会被暴露或活化，并立即与酶对它进行催化反应时，该基团会被暴露或活化，并立即与酶活性中心内的必需基团共价结合，引起不可逆抑制。此种抑活性中心内的必需基团共价结合，引起不可逆抑制。此种抑制专一性强，又是经酶催化后引起，被称为自杀性底物。制专一性强，又是经酶催化后引起，被称为自杀性底物。例如：例如：卤代卤代-D-Ala是细菌中丙氨酸消旋酶的不可逆抑制剂。是细菌中丙氨酸消旋酶的不可逆抑制剂。2 2、可逆抑制剂、可逆抑制剂 竞争性抑制剂（竞争性抑制剂（Competitiveinhibition）一些竞争性抑制剂与天然代谢物结构相似，能选择性抑一些竞争性抑制剂与天然代谢物结构相似，能选择性抑制病菌和癌细胞在代谢过程中的某些酶，而具有抗菌制病菌和癌细胞在代谢过程中的某些酶，而具有抗菌和抗癌作用。如磺胺类药物和抗癌药和抗癌作用。如磺胺类药物和抗癌药。磺胺类药物及其抗菌机理（磺胺类药物及其抗菌机理（以对氨基苯磺酰胺为例说明）以对氨基苯磺酰胺为例说明）细菌是以细菌是以对氨基苯甲酸对氨基苯甲酸为原料合成二氢叶酸的。二为原料合成二氢叶酸的。二氢叶酸是核酸的嘌呤核苷酸合成中的重要原料成分，氢叶酸是核酸的嘌呤核苷酸合成中的重要原料成分，对氨基苯磺酰胺对氨基苯磺酰胺是是对氨基苯甲酸对氨基苯甲酸的结构类似物。的结构类似物。n这样，这样，对氨基苯磺酰胺对氨基苯磺酰胺可与可与对氨基苯甲酸对氨基苯甲酸相互竞争，抑制二氢叶酸合成酶的活性，影响相互竞争，抑制二氢叶酸合成酶的活性，影响二氢叶酸的合成，导致细菌的生长繁殖受到抑二氢叶酸的合成，导致细菌的生长繁殖受到抑制，从而达到治病的效果。制，从而达到治病的效果。磺胺类药物磺胺类药物二氢叶酸合成酶二氢叶酸合成酶二氢叶酸二氢叶酸 对氨基苯甲酸对氨基苯甲酸 嘌呤核苷酸嘌呤核苷酸