采用BSA法发掘小麦成株抗锈性QTL

编号NO：河北农业大学本科毕业论文论文题目 采用BSA法发掘小麦成株抗锈性QTL 学生姓名 张振 学号2009014010206 成绩 85 学院 农学院 专业班级 农学0902班 指导教师姓名 姚占军 指导教师职称 教授 材料目录：1、任务书 （ 1）份2、开题报告 （含文献综述） （ 1）份3、指导教师评阅书 （ 1）份4、答辩记录表 （ 1）份5、论文正文 （ 1）份6、其它材料河北农业大学本科毕业论文任务书学 院： 农学院 教师姓名： 姚占军 职 称： 教 授 2012 年 4 月 20 日专业名称农学论文题目采用BSA法发掘小麦成株抗锈性QTL题目来源自选目的意义：小麦叶锈病是由小麦叶锈菌引起的真菌病害，该病害在世界许多国家的小麦主产区均有不同程度的发生，严重时可造成515%甚至更大的产量损失。培育和利用抗病品种是控制小麦叶锈病最经济有效且对环境安全的重要手段。 小麦抗病性主要包括垂直和水平抗性两类。垂直抗性又称生理小种专化抗性、质量性状抗性、苗期抗性、全生育期抗性或主效基因抗性等。在遗传上是受1个或少数几个主效基因控制，受环境影响不大，但是抗性易丧失。水平抗性又称非小种专化抗性、数量性状抗性、部分抗病性或微效基因抗性，也叫慢病性。在遗传上是受多个微效基因控制的，这些控制数量性状的基因构成数量性状座位（quantitative trait loci，QTL）。由于数量性状是有多基因控制的，传统的研究方法很难明确控制某种数量性状的基因数量以及各个基因的效应和应用价值，随着分子标记及相关分子生物学技术的快速发展，分解和定位QTL已成为现实。持久抗叶锈小麦品种大部分在苗期感病，而成株期对很多菌系表现抗性，即所谓的“成株抗病性”。因此，人们把解决小麦抗病性“丧失”的注意力集中持久抗病育种策略上，把成株抗性的利用作为小麦抗病育种的主要研究方向。可行性分析：1. 本实验室拥有小麦材料徐矮，是河南偃师一带种植的农家品种，为典型的成株抗性材料。F2:3家系是以徐矮和郑州5389为亲本经过一次杂交和两次自交构建了含有155个株系的家系。2. 熟练掌握了提取小麦基因组DNA的方法。3. 熟悉并掌握了SSR分子标记的操作技术，为本实验的顺利进行奠定了基础。本研究采用SSR分子标记技术结合BSA法对徐矮和郑州5389构建的F2:3家系群体进行标记筛选和群体基因型检测，利用完备区间作图法进行QTL分析。该项研究选题正确，研究路线合理，思路清晰，具有一定的实践意义；所涉及的各种仪器设备均能满足实验需要，可行进度安排：2012.52012.6 查阅相关资料、进行实验准备工作，对亲本及F2:3家系DNA的提取。2012.82012.12 在亲本及抗感池间筛选特异性引物, 寻找合适的标记并对群体基因型进行检测。 2013.3-2013.5 整理数据、完成论文并准备答辩。专家意见：由于目前我国大面积种植的小麦品种和重要抗源大都不抗叶锈菌优势小种，急需大力挖掘新的叶锈抗源，以丰富小麦的抗叶锈基因，确保小麦生产的安全。该试验想利用SSR分子标记的方法希望找到与徐矮小麦中的抗叶锈病基因连锁的标记，明确抗病基因的位置，为基因的分子定位作图及精细定位奠定基础。该生比较全面地查阅了该领域的科学文献，基本掌握了相关的研究动态和进展。试验立题依据充分，技术路线、试验方法可行，工作量适中，符合本科生毕业要求，同意开始试验。专家签字：年 月 日学院意见:院长： 年 月 日 农 学 院 学院 农 学 专业 张 振 学生：现把 2012-2013 学年，第 二 学期的毕业论文安排下达给你，你本学期承担的毕业论文任务如下：1、依据本任务书中论文题目、目的意义、可行性分析的内容完成开题报告。2、按照开题报告的要求按期完成毕业论文各项工作的实施。3、完成毕业论文的撰写。4、完成毕业论文的答辩。 请按相关要求完成毕业论文任务。教师签字： 年 月 日河北农业大学本科毕业论文开题报告题 目： 采用BSA法发掘小麦成株抗锈性QTL 学 院： 农学院 学生姓名： 张 振 专 业： 农 学 班级学号： 2009014010206 指导教师姓名： 姚占军 指导教师职称： 教 授 年 月 日学生姓名张振专业班级农学0902班学 号2009014010206指导教师姚占军职 称教授所在学院农学院论文名称采用BSA法发掘小麦成株抗锈性QTL选题依据： 由叶锈菌（Puccinia triticina）引起的小麦叶锈病是影响小麦生产的主要病害之一。适宜范围广，发生区域大，条件适宜可造成40甚至更大的产量损失，同时降低粮食品质。随着全球变暖，气候条件会越来越适合的发生和叶锈病蔓延。培育和利用抗叶锈品种是减轻叶锈病危害最经济、有效、安全的方法。要想利用抗病基因控制叶锈病，必须了解和掌握主要抗源材料和推广品种中的抗性基因。因此深入研究小麦抗叶锈遗传规律，持续不断地发掘和标记小麦抗叶锈新基因对抗病育种和病害防治具有重要意义。常规杂交法一次分析的品种有限，所需时间长，一般需要三个世代的试验结果，涉及数量性状基因时分析困难，同时不能将基因定位在特定的染色体上。该方法一般用于重要抗源或新导入抗性基因品种的基因分析。基因推导法简便、快速，在短期（在48周了解常规方法需要23年才能得到的遗传信息）内可分析大量的材料，结果便于比较。该法也存在一定的局限性，基因推导不适于鉴定成株抗性，苗期推导所依据的侵染型易受环境条件、基因间的互作、遗传背景和所用菌种鉴别能力等因素影响，致使推导结果不准确，甚至得出错误的结论。抗病基因的染色体定位准确细致，可以对抗病基因做全面研究定位在染色体上。但费时费工，工作量大，不适于含有多个具有连锁关系的抗病基因的材料，只适合对少数重点未知抗病基因品种进行分析。分子标记一类主要以DNA分子多态性为基础的一种遗传标记。分子标记因其具有较高的多态性，标记数量丰富，不受外界环境影响，所需样品量少，步骤简单等优点，被广泛应用于小麦抗叶锈基因的标记及染色体定位中。总之，上述研究方法各有利弊，为了获得可靠的试验结果，可以各取所长，综合运用，根据试验目的和试验条件选择适当的研究方法，快速有效的挖掘抗锈基因，丰富抗锈基因库，为品种合理布局、多系品种选择和基因聚合育种提供抗源材料。文献综述：常规杂交法一次分析的品种有限，所需时间长，一般需要三个世代的试验结果，涉及数量性状基因时分析困难，同时不能将基因定位在特定的染色体上。该方法一般用于重要抗源或新导入抗性基因品种的基因分析。基因推导法简便、快速，在短期（在48周了解常规方法需要23年才能得到的遗传信息）内可分析大量的材料，结果便于比较。该法也存在一定的局限性，基因推导不适于鉴定成株抗性，苗期推导所依据的侵染型易受环境条件、基因间的互作、遗传背景和所用菌种鉴别能力等因素影响，致使推导结果不准确，甚至得出错误的结论。抗病基因的染色体定位准确细致，可以对抗病基因做全面研究定位在染色体上。但费时费工，工作量大，不适于含有多个具有连锁关系的抗病基因的材料，只适合对少数重点未知抗病基因品种进行分析。分子标记一类主要以DNA分子多态性为基础的一种遗传标记。分子标记因其具有较高的多态性，标记数量丰富，不受外界环境影响，所需样品量少，步骤简单等优点，被广泛应用于小麦抗叶锈基因的标记及染色体定位中。总之，上述研究方法各有利弊，为了获得可靠的试验结果，可以各取所长，综合运用，根据试验目的和试验条件选择适当的研究方法，快速有效的挖掘抗锈基因，丰富抗锈基因库，为品种合理布局、多系品种选择和基因聚合育种提供抗源材料。参考文献1 Farrer W. The making and improvement of Australian wheatJ. Agricultural Gazette of New South Wales, 1898, 9: 131-68.2 Biffen R H. Mendels laws of inheritance and wheat breedingJ. The Journal of Agricultural Science, 1905, 1(1): 4-48.3 Oelke L M, Kolmer J A. Genetics of leaf rust resistance in spring wheat cultivars Alsen and NormJ. Phytopathology, 95: 773-778.4 Flor H H. Host-parasite interaction in flax rust- its genetics and other implicationsJ. Phyto-pathology 1955, 45: 680-685.5 Browder L E. Probable genotype of some Triticum aestivum Agent derivetives for reaction to Puccinia recondita f. sp. triticiJ. Crop Science, 1973, 13: 203-206.6 Dubin H J, Johnson R, Stubbs R W. Postulated genes for resistance to stripe rust in selected CIMMYT and related wheatsJ. Plant Disease, 1989, 73: 472-475.7 胡长程, 陈万权. 我国25个小麦品种抗秆、叶锈基因初步分析J. 植物病理学报, 1992, 22(4): 369-375.8 郭爱国, 刘颖超, 王焕如, 等. 十八个小麦品种(系)抗叶锈基因的推导J. 华北农学报, 1991, 6(增刊): 109-114.9 陈万权, 胡长程. 我国28个小麦品种抗叶锈基因的推导J. 作物学报, 1993, 19(3): 268-275.10 杨文香. 21个小麦品种(系)抗叶锈性基因推导J. 河北农业大学学报, 2000, 23(3): 69-72.11 Li Z F, Xia X C, He Z H, et al. Seedling and Slow Rusting Resistance to Leaf Rust in Chinese Wheat CultivarsJ. Plant Disease, 94(1): 45-53.12Raupp W J, Sukhwinder-Singh, Brown-Guedira G L, et al. Cytogenetic and molecular mapping of the leaf rust resistance gene Lr39 in wheatJ. Theoretical and Applied Genetics, 2001, 102: 347-352.13 Botstein D, White R L, Skolnick M, et al. Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphismsJ. The American Journal Human Genetics, 1980, 32(3): 314-331.14 Welsh J, McClelland M. Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primersJ. Nucleic Acids Research, 1990, 18(24): 7213-7218.15 Zabeau M, Vos P. Selective restriction fragment amplification: a general method for DNA fingerprintingP. CA2119557. 1993-4-1.16 Rder M S, Korzun V, Wendehake K, et al. A microsatellite map of wheatJ. Genetics,1998,149: 2007-2023.17Yamamoto K, Sasaki T. Large-scale EST sequencing in riceJ. Plant Molecular Biology, 1997, 35: 135-144.18 Chen X M, Line R F, Leung H. Genome scanning for resistance-gene analogs in rice, barley, and wheat by high-resolution electrophoresisJ. Theoretical and Applied Genetics, 1998, 97: 345-355.19 Wenzl P, Carling J, Kudrna D, et al. Diversity arrays technology (DArT) for whole-genome profiling of barleyJ. Proceedings of the National Academy of Sciences of USA, 2004, 101(26): 9915-9920.20 Brookes A J. The essence of SNPsJ. Gene, 1999, 234(2): 177-186.21 Olson M, Hood L, Cantor C, et al. A common language for physical mapping of the human genomeJ. Science, 1989, 245: 1434-1435.22 Paran I, Michelmore R W. Development of reliable PCR-based markers linked to downy mildew resistance genes in lettuceJ. Theoretical and Applied Genetics, 1993, 85: 985-993.23 Konieczny A, Ausubel F M. A procedure for mapping Arabidopsis mutations using co-dominant ecotype-specific PCR-based markersJ. Plant Journal, 1993, 4(2): 403-410.24Autrique E, Singh R P, Tanksley S D, et al. Molecular markers for four leaf rust resistance genes introgressed into wheat from wild relativesJ. Genome, 1995, 38: 75-83.25Feuillet C, Schachermayr G, Keller B, et al. Molecular cloning of a new receptor-like kinase gene encoded at the Lr10 disease resistance locus of wheat. The Plant Journal, 1995, 11(1): 45-52.26 Schachermayr G, Feuillet C, Keller B, et al. Molecular markers for the detection of the wheat leaf rust resistance gene Lr10 in diverse genetic backgrounds J. Molec Breed, 1997, 3: 65-74.研究方法、内容：1 菌种的繁殖与保存感病品种郑州5389用于菌种的纯化与扩繁，将郑州5389种植于温室中，当第一片叶完全展开时，将所用菌种从冰箱取出后，用45温水活化5 min，然后在培养皿中水化10 h。接种时先脱去叶片表面的腊质层，再将锈菌孢子轻涂于叶片正面。接种后喷雾，黑暗保湿14 h-16 h，然后置于温室内潜育发病。当叶片现斑时，进行单侵染点分离。分离后放置于光照培养箱中，18、光照14 h进行离体培养。接种后10 d左右后孢子堆成熟。因单孢子堆菌量太少，先在离体的完整叶片上进行一次繁殖，待孢子堆成熟后接种于感病品种郑州5389上进行扩繁。2 田间试验设计及成株抗叶锈鉴定田间种植：2011年10月份，河北农业大学植物保护学院试验田种植徐矮和郑州5389及155个F2:3家系，田间试验设计采用完全随机区组设计，2次重复，1.5m行长，0.25m行距，每行撒播50粒。试验田每10行种植1行高感品种郑州5389作对照，郑州5389作为诱发行与试验材料垂直种植，以保证接种充分。田间接种：2012年4月中旬，小麦拔节期进行田间混合小种接种。将在温室中繁殖好的叶锈菌混合小种配制成0.05% Tween20孢子悬浮液（先用少量Tween20将孢子粉调成糊状，然后加适量水稀释成桔红色菌液即可），傍晚时用压力喷壶均匀喷洒在诱发行小麦上，随即覆盖塑料薄膜，四周用土压严，充分保湿，次日早晨揭开薄膜。接种后勤浇水，保持田间湿度，同时增施氮肥以利于发病。田间调查：2012年5月底，待对照品种郑州5389严重度达到100%时对群体及其亲本进行田间病害调查。根据倒二叶上叶锈菌孢子堆所占叶片总面积的百分数，目测记录各家系的平均叶锈病严重度作为成株期叶锈病的最大病害严重度（MDS）。3 叶片基因组DNA提取将F2:3各株系所有单株的叶尖混合提取基因组DNA，所提DNA可代表F2各单株的遗传组成。参考Sharp等介绍的CTAB法提取小麦叶片基因组DNA，并在试验中有所改进，具体操作步骤如下：（1）剪取适量叶片置于2 mL离心管，在液氮中研磨，研磨过程中避免样品融化引起DNA降解；（2）迅速向研磨好的样品中加800 L预热的CTAB提取液，65 水浴1 h左右，每510 min轻轻上下颠倒混匀，使样品充分裂解；（3）加等体积的酚氯仿（1:1），轻轻上下颠倒混匀10 min；（4）12 000 rpm离心10 min，用去尖的枪头吸取上清置1.5 mL离心管，加入等体积的氯仿异戊醇（24:1），轻轻上下颠倒混匀10 min；（5）12 000 rpm离心10 min，吸取上清置另一洁净离心管，加入2倍体积预冷的无水乙醇，在-20 静置20 min或更长时间，可观察到絮状沉淀，挑取沉淀或低速离心（6 000 rpm离心10 min，4 )收集沉淀；（6）加入1 mL75%乙醇，离心10 min（10 000 rpm，4 ），收集沉淀，重复一次，常温晾干；（7）加适量0.5TE缓冲液溶解DNA，4 静置过夜，溶解过程中切忌剧烈震荡，高分子量DNA溶解需要几个小时。4 DNA浓度测定用NanoDrop 1000紫外分光光度计检测DNA质量和浓度：先在样品台加2 L超纯水初始化仪器，用吸水纸吸净超纯水；加2 L buffer（溶解DNA用的溶剂）调零，用吸水纸吸净buffer；取2 L DNA样液进行测量，记录DNA浓度、OD260/OD280。若OD260/OD280=1.8时，DNA最纯；若高于1.8，可能有RNA污染；若低于1.8，可能有蛋白质污染。若OD260/OD230小于2.0，表明存在碳水化合物、多肽、苯酚及一些盐基离子；若在2.02.5之间，表明DNA较纯净。5抗感池建立根据1991年Michelmore提出的BSA法，即根据目标性状的表现型对分离群体进行分组混合建立抗感池。具体步骤是：从F2:3分离群体中根据田间表型数据（MDS）分别选取10个抗病株系DNA和10个感病株系DNA，等量混合构成抗病池（Br）和感病池（Bs）。用亲本间有差异的SSR标记筛选抗感池，寻找抗感池间的多态性和亲本间的多态性一致的分子标记，同时根据已公布的小麦公共遗传图谱和网站，查找该标记邻近的分子标记，然后筛选出在亲本和抗感池间有多态性的标记用于整个群体基因型检测，将获得的群体基因型数据用于目的基因遗传连锁图谱的绘制。进度安排：2012.52012.6 查阅相关资料、进行实验准备工作，对亲本及F2:3家系DNA的提取。2012.82012.12 在亲本及抗感池间筛选特异性引物, 寻找合适的标记并对群体基因型进行检测。 2013.3-2013.5 整理数据、完成论文并准备答辩。指导教师意见： 该生对徐矮小麦中的抗叶锈基因用分布于2B小麦染色体上的SSR引物在两个亲本及抗感池间进行引物筛选，为基因的定位作图奠定基础。该论文立题依据充分。该生查阅了大量的国内外文献，全面了解了国内外相关研究的研究进展。本课题组分子实验室仪器设备条件较为完备，该生还掌握了DNA提取及SSR标记检测等一系列实验技能，另外该生有较强的动手能力，能独立完成科学试验，这些都保证了论文的顺利完成。指导教师：年 月 日审 核 小 组 成 员姓 名职 称备 注姓 名职 称备 注段会军教授刘桂茹教授葛淑俊副教授王睿辉副教授穆国俊副教授开题报告记录：该生介绍了SSR分子标记技术在小麦图谱构建过程中的重要作用以及今后的发展趋势，语言流利，思路清晰，层次分明，回答疑问较准确，研究方法可行。审核小组评语：试验目的明确，相关文献查阅认真，试验条件具备，工作量适度，时间安排合理，试验可行。审核小组组长：（签字）2012年 10 月 20 日学院意见：院长：年 月 日河北农业大学本科毕业论文指导教师评阅书学生姓名：张振 学号：2009014010206专业班级：农学0902班 所在学院：农学院论文题目：采用BSA法发掘小麦成株抗锈性QTL 指导教师评语： 张振同学在毕业实习期间顺利完成了毕业论文工作以徐矮小麦为实验材料用分子标记技术寻找抗病基因，排除了已知基因，并筛选了大量的标记，这为进一步寻找小麦抗叶锈基因奠定了基础。该论文引用资料完全，实验数据准确，结果真实，可靠，科学，论文撰写规范，语句通畅，表达含义清楚，符合逻辑，是一篇优秀的学位论文。成 绩 评 定：是否同意答辩： 指导教师（签名）： 年 月 日河北农业大学本科毕业论文答辩评分表评分指标分 值评 价 内 容得 分论文选题10选题有重要理论意义或实用价值。立题依据充分。文献引用12阅读、引用文献资料较广泛，较全面了解本领域学术动态，综合分析能力较强。论文难度及工作量14难度较大，工作量大。论文成果的创新性12有独到见解，有较大的创新性成果。理论基础与科研能力16具有坚实的基础理论和系统的专门知识，具有较强的独立从事科研工作的能力，研究方法和技术体系得当。写作能力16条理清楚，层次分明，说理透彻，文笔流畅，表格、绘图准确规范，中外文摘要简明扼要，语句通顺，语法正确，符合科技写作规范。答辩报告10能简明扼要、重点突出地阐述论文或设计的主要内容，有新见解，结论明确；时间掌握恰当。回答问题10思维敏捷，逻辑性强，准确流利地回答各种问题。总 分100河北农业大学 2013 届本科毕业论文答辩记录表所在学院：农学院 专业班级： 农学 时间： 2013 年 6 月 7日学 生 姓 名张振学 号2009014010206指导教师姓名姚占军职 称教授毕业论文题目：采用BSA法发掘小麦成株抗锈性QTL答 辩 小 组 成 员姓 名职 称成 绩姓 名职 称成 绩段会军教授86葛淑俊副教授83刘桂茹教授84王睿辉副教授85穆国俊副教授87答辩小组评语：该生介绍了SSR分子标记技术在小麦图谱构建过程中的重要作用以及今后的发展趋势，语言流利，思路清晰，层次分明，回答疑问较准确。答辩小组组长：（签字）2013年 6 月 6 日答 辩 成 绩：85注：本表与学生毕业论文（设计）一同在学院存档（必须用钢笔书写） 河北农业大学 农学院 本 科 毕 业 论 文题 目： 采用BSA法发掘小麦成株抗锈性QTL 专业班级： 农学0902班 学 号： 2009014010206 学生姓名： 张振 指导教师： 姚占军 职 称： 教授 2013 年 6 月 7 日摘要：多年田间鉴定结果表明，小麦农家品种徐矮具有成株抗病性，挖掘其中成株抗性基因，对于丰富小麦抗叶锈基因库和培育持久抗性小麦品种具有重要的意义。本研究采用SSR分子标记技术结合分离群体分组分析法（BSA）对徐矮和郑州5389构建的F2:3家系群体进行标记筛选和群体基因型检测，利用完备区间作图法进行QTL分析。结果表明：2B染色体上有1个与叶锈病成株抗性相关的QTL位点，表型贡献率为37.5%，该位点由抗病亲本徐矮提供，将此位点暂命名为QLr.hbau-2BS。 关键词：BSA ；小麦 ；成株抗性QTLDiscoveryofQTLforAdult-plantResistancetoLeafRustBasedonPSGAnalysisinWheat Abstract:TheyearsoffieldtestsshowedthatChinesewheatlandraceXuaihaveaadult-plantdiseaseresistance.Miningtheresistancehasaimportantsignificanceforrichinggenepoolofwheatleafrustandcultivatinglastingresistantwheatvarieties.Inthisstudy,SSRmakers,togetherwithBSA()analysis,wereusedtomapQTLbyF2populationandF2:3lineswhichderivedfromXuaiandZhengzhou5389.ThereexistedaQTLrelatedtodisease-resistanceonchromosome2B,explaining37.5%ofphenotypicvariance.ThisresistancelocusweresupportedbyXuai,namedQLr.hbau-2BS. Key words：BSA ; wheat ; adult-plantdiseaseresistance QTL小麦叶锈病是由小麦叶锈菌(Puccinia tirticina)引起的真菌病害，该病害在世界许多国家的小麦主产区均有不同程度的发生，也是影响我国小麦生产的重要因素，曾在我国多次大流行并造成严重的产量损失。培育和利用抗病品种是控制小麦叶锈病最经济有效且对环境安全的重要方法和手段。加强小麦品种及其遗传资源的抗病性研究，对于病害持续控制、确保小麦安全生产至关重要。小麦品种抗病基因研究是抗病育种及抗病基因合理布局的基础工作，逐步探明品种和抗源所具有的抗病基因，对建立抗源的遗传多样性具有重要意义，对实现小麦持久抗性育种具有重要实用价值。二十世纪八十年代以来，分子遗传学和现代生物技术的迅速发展，为植物抗病遗传分析在方法上注入了新的活力。同工酶，染色体原位杂交，DNA 分子遗传标记等技术为植物抗病遗传分析提供了更为准确、快捷的方法。同时由于计算机的发展和渗入，使得对数量形状（QTL）的遗传标记也随之发展起来。当前我国的抗叶锈研究整体水平有了很大提高，但由于我国小麦抗叶锈研究起步晚，基础薄弱，与欧美等发达国家相比还存在很大差距，许多生产品种、农家品种和抗源材料的抗叶锈遗传背景并不了解，这给许多工作带来了很大的盲目性。此外，由于我国小麦叶锈病不像条锈、白粉等病害在生产上大面积流行成灾，使部分育种家放松了对叶锈病的警惕，未经抗叶锈性鉴定直接投入生产，这给小麦安全生产构成了潜在威胁。同时，生产品种多为少数骨干亲本培育而来，抗性谱狭窄且为主效基因控制的苗期抗性，易受突发病虫害影响而丧失抗性，而由微效基因控制的成株抗性较为持久，可满足生产和育种现状的需要。2012年，四川、甘肃等地叶锈大发生，我们应加大力度开展小麦材料的成株抗性鉴定、成株抗性基因的标记与定位工作。农家品种徐矮经河北农业大学植物保护学院小麦锈病课题组苗期和成株期鉴定，发现其具有良好成株抗性。本试验通过对徐矮和郑州5389创建的F2:3家系群体进行成株抗性QTL挖掘，利用SSR分子标记技术结合BSA法，为丰富小麦抗叶锈基因库和培育持久抗性品种提供材料。1材料与方法1.1 试验材料供试小麦材料徐矮是河南偃师一带种植的农家品种，田间鉴定发现其具有成株抗性。本试验所用群体为徐矮和郑州5389通过一次杂交和两次自交构建的155个株系的F2:3家系群体。供试混合菌系为5种致病力不同的叶锈菌混合而来。1.2 主要仪器设备及试剂S1000 Thermal Cycler PCR扩增仪、DYCZ-30 C 型电泳仪、DYY-12型电泳仪电源、WH-861 旋涡混合器、Eppendorf Centrifuge 5415 D 高速台式离心机、HW.SY11-K水浴锅、NanoDrop1000紫外分光光度计、便携式台钻BG-5158等。TaqDNA聚合酶、dNTP、PBR322 Maker、CTAB、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、硝酸银、NaOH、37%甲醛、琼脂糖、Tris碱、乙二胺四乙酸二钠、NaCl、Tris-饱和酚、氯仿、异戊醇、无水乙醇、过硫酸铵、溴酚蓝和二甲苯氰F等。1.3 试验方法1.3.1 菌种的繁殖与保存田间接种所用的混合菌种由我国当前致病力最强的的5个叶锈菌生理小种混合而来。单孢菌系从冰箱取出后，在4045温水中活化5min，然后黑暗水化10h。采用涂抹法初繁菌种：待感病品种郑州5389一叶一心期，先用手指蘸清水轻轻捋小麦叶片，除去叶片正面蜡质层，注意不要对小麦叶片造成损伤。然后喷雾使叶片表面形成一水膜，用手蘸取润湿的叶锈菌夏孢子均匀涂抹于小麦叶片上，接种后喷雾，黑暗保湿1416h，然后置温室内潜育发病。无需进行菌种的纯化，15d左右夏孢子成熟后进行扩繁。扫抹法扩繁菌种：郑州5389一叶一心期，先用0.05%吐温20（Tween20）喷雾，使叶片表面附着一层水膜，然后将长好的菌种均匀反复扫抹郑州5389的叶片，黑暗保湿后温室潜育发病，待菌种成熟后收集备用。如果菌种需要长时间保存，先将菌种收集到试管，自然条件下晾干，然后将菌种分装在保存管中，抽真空后密封，-20冰箱保存。1.3.2 田间试验设计及成株抗叶锈鉴定田间种植：2011年10月份，河北农业大学植物保护学院试验田种植徐矮和郑州5389及155个F2:3家系，田间试验设计采用完全随机区组设计，2次重复，1.5m行长，0.25m行距，每行撒播50粒。试验田每10行种植1行高感品种郑州5389作对照，郑州5389作为诱发行与试验材料垂直种植，以保证接种充分。田间接种：2012年4月中旬，小麦拔节期进行田间混合小种接种。将在温室中繁殖好的叶锈菌混合小种配制成0.05% Tween20孢子悬浮液（先用少量Tween20将孢子粉调成糊状，然后加适量水稀释成桔红色菌液即可），傍晚时用压力喷壶均匀喷洒在诱发行小麦上，随即覆盖塑料薄膜，四周用土压严，充分保湿，次日早晨揭开薄膜。接种后勤浇水，保持田间湿度，同时增施氮肥以利于发病。田间调查：2012年5月底，待对照品种郑州5389严重度达到100%时对群体及其亲本进行田间病害调查。根据倒二叶上叶锈菌孢子堆所占叶片总面积的百分数，目测记录各家系的平均叶锈病严重度作为成株期叶锈病的最大病害严重度（MDS）。常用分级法表示，一般分为8级，即1%、5%、10%、25%、40%、65%、80%、100%。1.4 基因型分析1.4.1 叶片基因组DNA提取将F2:3各株系所有单株的叶尖混合提取基因组DNA，所提DNA可代表F2各单株的遗传组成。参考Sharp等介绍的CTAB法提取小麦叶片基因组DNA，并在试验中有所改进，具体操作步骤如下：1) 在液氮中研磨小麦叶片，操作过程中勿使样品融化以防止DNA的降解；2) 将研磨好的样品尽快转入到1.5 mL离心管中，加入预热过的CTAB提取液，充分混匀；3) 65水浴30 min至1 h，水浴过程中每10 min充分混匀一次；4) 水浴后在离心管中加相同体积的Tris饱和酚，轻轻摇动10 min；5) 将其混匀后12000转离心10 min，用去过尖的黄枪头吸取上清液，加等体积氯仿异戊醇（24：1）进行抽提；6) 将最后提取的上清液转移至另一1.5 mL离心管中，加入热处理过的RNAase去除RNA，轻轻混匀后，水浴30 min，然后再加入等体积氯仿异戊醇抽提一次；7) 在抽取的上清液中加入预冷的2倍体积的无水乙醇，-20条件下放置20 min或更长时间，用移液枪头挑出絮状沉淀。如果样品出现云雾状沉淀或6000 rpm低速离心10 min，收集沉淀；8) 在沉淀中加入1 mL 70%乙醇冲洗液，轻摇几分钟，离心10 min（10000 rpm，4），收集沉淀。用70%的乙醇冲洗2次，将其凉干；9) 用1TE缓冲液溶解DNA，溶解过程中不要剧烈摇动，高分子量DNA溶解可需要几个小时。1.4.2 DNA浓度检测用NanoDrop 1000紫外分光光度计检测DNA质量和浓度：先在样品台加2 L超纯水初始化仪器，用吸水纸吸净超纯水；加2 L buffer（溶解DNA用的溶剂）调零，用吸水纸吸净buffer；取2 L DNA样液进行测量，记录DNA浓度、OD260/OD280。若OD260/OD280=1.8时，DNA最纯；若高于1.8，可能有RNA污染；若低于1.8，可能有蛋白质污染。若OD260/OD230小于2.0，表明存在碳水化合物、多肽、苯酚及一些盐基离子；若在2.02.5之间，表明DNA较纯净。1.4.3 抗感池建立根据1991年Michelmore等2提出的BSA法，即根据目标性状的表现型对分离群体进行分组混合建立抗感池。具体步骤是：从F2:3分离群体中根据田间表型数据（MDS）分别选取10个抗病株系DNA和10个感病株系DNA，等量混合构成抗病池（Br）和感病池（Bs）。用亲本间有差异的SSR标记筛选抗感池，寻找抗感池间的多态性和亲本间的多态性一致的分子标记，同时根据已公布的小麦公共遗传图谱和网站，查找该标记邻近的分子标记，然后筛选出在亲本和抗感池间有多态性的标记用于整个群体基因型检测，将获得的群体基因型数据用于目的基因遗传连锁图谱的绘制。1.4.4 PCR扩增及电泳分析1.4.4.1 PCR扩增分布于小麦21条染色体的1 277对SSR引物用于亲本、抗感池及小群体间多态性引物筛选。其中SSR 引物参考Rder、Somers3,4等提供的序列，其余来自GrainGens 网站（http:/wheat.pw.usda.gov/GG2/index.shtml）。PCR反应总体系为10L，组成如下： 1 L10PCRbuffer(含Mg2+) ，0.2 L dNTPs(10 mM) ，1 L引物（4 M），1 L模板DNA（30 ng/L），0.1 L TaqDNA聚合酶(2.5 U/L)， 6.7 L ddH2O。PCR反应程序如下：预变性94 5 min变性94 45 sec退火5060 45 sec延伸72 1 min总延伸72 10 min保存4 + 变性、退火、延伸完成一次为一个循环，共经历35个循环。5060 表示退火温度依引物特性而定。1.4.4.2 10%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳PCR扩增产物用10%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，具体操作步骤如下：（1）胶板的制备与电泳槽的组装：先用洗涤灵将胶板上的污渍洗去，自来水冲洗干净，再用餐巾纸擦拭干。将两块胶板对合好以后装入橡胶框中，然后用1%琼脂糖溶液（1TBE配制）封底边和两个侧边。待琼脂糖凝固后，将组装好的胶板装入电泳槽内，取配好的胶液40 mL，加入25 L TEMED后迅速混匀立即灌胶。灌胶时使电泳槽倾斜一定角度，防止气泡产生，胶灌满后立即插上梳子。然后室温凝胶3060 min。（2）电泳：向PCR扩增产物加入2 L 6Loading buffer，混匀。向电泳槽内倒入1TBE电泳缓冲液，待缓冲液浸润凝胶后，拔去梳子，防止气泡产生。每泳道上样12.5 L，恒压250V电泳。待指示带跑至脚板底部停止电泳，1 h左右。（3）银染：电泳结束后，将胶板取下来，将胶片剥下来。首先固定，胶片放入固定液，在摇床上轻摇至指示带消失即可。然后银染，胶片取出，用纯水洗去表面的固定液，放入染色液，在摇床上摇晃58 min，银染时间依胶片数量和银染液使用次数而定。然后显影，胶片取出后，放入纯水中10 s左右，迅速取出控水，放入显影液至条带清晰可见。最后定影，胶片自显影液取出放入定影液中和剩余的显影液。或是用纯水多冲洗几遍，洗去多余的显影液即可。（4）照相并统计带型。1.5 数据统计分析1.5.1 F2:3群体表型分析利用Microsoft Excel 2003对F2:3家系进行数据分析，绘制频数分布图。1.5.2 遗传图谱的构建根据徐矮F2:3家系的最大病害严重度（MDS）进行QTL作图。利用软件 MapMaker 3.0b5进行连锁图谱的绘制1.5.3 QTL定位与QTL命名规则借助于Icimapping3.2软件的完备区间作图功能进行QTL分析，取LOD值2.5为阈值。根据已公布的小麦分子标记遗传连锁图谱6,7和GrainGenes 2.0网站（http:/wheat.pw.usda.gov）确定本研究中的QTL在染色体上的位置。QTL的命名采用国际小麦数量性状位点命名法则8，即Q性状英文缩写.研究单位-染色体。如QLr.hbau-1A表示河北农业大学发现的位于1A染色体上抗叶锈QTL。其中Q为QTL的缩写，Lr为leaf rust的缩写，hbau为Agricultural University of Hebei的缩写。1A为A染色体组的1号染色体。2 结果与分析2.1 徐矮F2:3家系的抗叶锈性表型分析由图1可知两个杂交组合的F2:3家系对小麦叶锈菌的田间最大严重度表现为抗病亲本和感病亲本之间的连续分布，表明该群体的叶锈病成株抗性不符合简单性状遗传分离模式，具有数量性状遗传特点。由于F2:3家系的MDS频数分布略偏向抗病亲本，属于偏正态分布，说明徐矮的成株抗叶锈性可能受一个或几个中等效力的QTL和其它微效QTL的共同控制。2.2 连锁群构建及染色体定位图1 徐矮/郑州5389 F2:3家系叶锈病MDS频数分布图2.2.1 BSA策略 通过亲本徐矮和郑州5389对889对SSR引物的筛选，选出在双亲间产生多态性的534对引物组合，多态率为60.07%。利用534对SSR引物进行抗感池检测，获得17对具有多态性的引物，多态率为3.18%。用筛选出的17对引物对F2:3家系的155个株系进行基因型检测。QLr.hbau-2BS图图2 徐矮/郑州5389 F2:3家系构建的SSR连锁群2.2.3 连锁群构建及染色体定位以上17个标记的基因型通过MapMaker 3.0b进行连锁图谱的绘制，得到1个分子标记密集群，通过查询已公布的小麦分子标记图谱，发现这些连锁群位于2B染色体上（图2）。2.3 徐矮叶锈病成株抗性QTL定位利用完备区间作图法，对徐矮/郑州5389F2:3家系的基因型同2012年MDS进行QTL分析共检测到1个叶锈病成株抗性QTL，位于2BS染色体上命名为QLr.hbau-2BS，SSR标记Xbarc55和Xgwm374与其紧密连锁，遗传距离分别为3cM和3.3cM，解释的表型变异高达37.5%，该位点由抗病亲本徐矮提供。图3为与该位点紧密连锁的SSR标记电泳图。采用完备区间作图法(ICIM)对徐矮/郑州5389F2:3家系进行成株抗叶锈QTL检测年份/指标Year/IndexQTL名称QTL标记区间Maker interval位置Position最大似然值LOD贡献率PVE(%)加性效应Add显性效应Dom2012MDSQLr.hbau-2BSXbarc55-Xgwm37445.021.937.5-26.856.14201bpA238bpB110bp90bp图3 紧密连锁的SSR标记扩增产物的非变性聚丙酰胺凝胶电泳图片注：M：PBR322/MspI；P1：徐矮；P2：郑州5389；Br：抗病池；Bs：感病池；5R：5个抗病单株；5S：5个感病单株；A为Xgwm374, B为Xbarc553 讨论3.1 成株抗性基因挖掘长期的育种实践证明抗源的多样化是抗病育种的动力和源泉。目前我国生产上应用的叶锈抗源较为单一，主要是全生育期抗性类型，即苗期抗性基因，由于新毒性小种出现使其逐渐失去利用价值。成株抗性作为不同于苗期主效抗性的抗性类型，在有效利用苗期主效抗性的基础上加强这种抗性的研究工作，丰富小麦的抗源类型，对实现小麦持久抗病育种具有重要意义。我国各地保留下来的农家品种具有丰富的遗传多样性，其中蕴含着丰富的抗性基因，白芒麦中含有一对控制成株抗性的隐主效基因YrBm9，农家品种换香头（3）、白麦（1-3）、白麦（2-1）成株抗条锈性由一对隐性基因控制10等，挖掘并利用农家品种的成株抗病基因资源对我国小麦育种具有重要意义。徐矮是河南偃师一带农家品种，苗期对PHTS小种表现感病，成株期对THTT小种表现良好的抗性，说明一些抗性基因在成株期进行表达，具有小种非专化成株抗性基因。与此同时，我们认识到单纯依靠苗期鉴定结果决定材料的取舍是不够的，容易遗漏掉成株期表达的抗病基因，因此在进行抗源挖掘时，在苗期鉴定基础上结合成株期鉴定结果全面考虑，将其抗性特点彻底摸清，以防淘汰一些宝贵的抗源。3.2 BSA在QTL定位上的应用BSA法是20世纪90年代兴起的一种基于性状的分析方法，由于该法可以大幅度减少待检测的DNA样品的数量，从而降低标记分析的费用，被广泛用于质量抗性（抗病、抗虫）基因的定位，随后用于某些数量抗性基因的定位。Bansal等11利用BSA法将抗叶锈基因Lr48和Lr49分别定位到2BS和4BL染色体上，同时寻找到与其连锁紧密的标记，Xgwm429b-6.1cM-Lr48-7.3cM-Xbarc7，