聚赖氨酸研究进展.ppt

报告人：,聚赖氨酸研究进展,目录,1,2,3,4,前言,聚赖氨酸概述,市场概况,国内外研究现状,5,分离与提取工艺优化,6,发酵调控工艺优化,一 前言,全世界每年约有1020的农副产品、水产品、果蔬会腐败变质，经济损失巨大。 食品的腐败变质主要是指由于微生物的作用而导致食品质量下降或失去食用价值的一切变化，它直接影响食品的品质和消费者的健康。,人工合成 化学防腐剂,天然 防腐剂,苯甲酸、苯甲酸钠、山梨酸、山梨酸钾、丙酸钙等,精蛋白，蜂胶，壳聚糖， 茶多酚，香精油，聚赖氨酸等,危害,限制条件,二 聚赖氨酸概述,-聚赖氨酸纯品为淡黄色粉末、吸湿性强，是赖氨酸直链状聚合物，聚赖氨酸聚合度一般为25-30，结构图如下：,-聚赖氨酸遇酸性多糖类、盐酸盐类、磷酸盐类、铜离子等可能因结合而使活性降低。与盐酸、柠檬酸、苹果酸、甘氨酸和高级脂肪甘油酯等合用又有增效作用、分子量在3600-4300之间-聚赖氨酸抑菌活性最好，当分子量低于1300时，-聚赖氨酸失去抑菌活性。,1 聚赖氨酸的理化性质,2 聚赖氨酸的生物学性质,3 聚赖氨酸的功能和作用,-聚赖氨酸在保鲜防腐方面的应用 -聚赖氨酸在医学方面应用 -聚赖氨酸在生活方面应用 乳化剂 食疗剂,4 -聚赖氨酸测定方法, 分光光度法测-聚赖氨酸含量 采用甲基橙与-聚赖氨酸在一定条件下结合，产生沉淀，通过比色法测出未与-聚赖氨酸结合的甲基橙含量，进一步可得到聚赖氨酸浓度。通过这种比色分析法可检测到低至10-6 mol/L浓度1。 高效液相色谱法测定聚赖氨酸的含量 测定-PL 的方法是高效液相色谱法(HPLC)，波长为UV 215 nm检测，洗提液0. 1% H3P04，流速0. 4 ml/min 2 。,传统研究认为，食品防腐剂的作用机理主要表现在如下3个方面： (1) 作用于细胞壁和细胞膜系统； (2) 作用于遗传物质或遗传微粒结构； (3) 作用于酶或功能蛋白。,5 -聚赖氨酸的抑菌机理,Shima S3等研究发现，防腐剂主要抑制微生物的呼吸作用，导致能量物质ATP和还原物质NADH亏缺，所有合成代谢受阻，活性的动态膜结构不能维持，代谢方向趋于水解,最后产生细胞自溶。 1983年，Vaara M4等发现聚阳离子能破坏G- 细菌的外膜，并进一步杀死这些细菌。 1992年Vaara M5进一步发现,聚赖氨酸是通过吸附到G- 细菌的外膜上，释放出大量的脂多糖，破坏细菌外膜，而起到抑菌作用的。,6 聚赖氨酸的生产方法,聚赖氨酸的化学合成 聚赖氨酸的化学合成是在1947年首先完成的，化学法合成的聚赖氨酸为型，其赖氨酸残基之间的酰胺键是有-氨基和-羧基缩合而成2 。 -聚赖氨酸的生物合成 由L-赖氨酸聚合酶催化单体赖氨酸聚合而成，所以-聚赖氨酸的代谢途径可能经赖氨酸合成途径，最后由聚合酶催化合成。 -聚赖氨酸的发酵生产 筛选聚赖氨酸产生菌株，并利用其进行发酵生产聚赖氨酸。,7 -聚赖氨酸产生菌的筛选,2002年，Nishikawa和Ogawa6研究出一个高效简便的-PL产生菌株筛选方法：在传统的平皿中添加浓度为0.02%的酸性染料Poly-R-478，通过Poly-R-478与-PL的相互作用，使得产-PL菌落周围的Poly-R-478浓缩并产生颜色变化，从而鉴定出产生菌株。 白色链霉菌，诺氏链霉菌，弗吉尼亚链霉菌，麦角真菌,之前，世界赖氨酸市场主要由日本味之素公司、美国ADM公司、德国巴斯夫公司、日本协和发酵公司和韩国希杰公司等控制，目前，日本年产数千吨左右，在满足国内食品行业大量需求外，产品还销往美国、欧洲、韩国等国家。近年来，我国的赖氨酸生产企业迅速崛起，在世界竞争中占据了一席之地。,三 聚赖氨酸的市场概况,四 聚赖氨酸的国内外研究进展,聚赖氨酸的国外研究进展,聚赖氨酸的国内研究进展,五 聚赖氨酸的发酵工艺优化：,国外 -聚赖氨酸发酵工艺优化,Shima 8在洗涤过的菌体中加入培养基，调 pH 值为酸性，-PL 产量达 4-5 g/L。 岩田敏治等 9在 Hiraki 试验方法的基础上，增加了自动流加碱液控制发酵液 pH 的技术，发酵 7 天时产量达 30 g/L 左右。 Kahar 2等人先将发酵 pH维持在 5.0 以上一段时间，累积菌体量；然后将 pH 降至 4.0 左右高速合成 -PL。在补料时期，控制发酵液中葡萄糖浓度为10 g/L，最终使S. albulus S410的产量达到了48.3 g/L。 Hiraki 和 Suzuki16将固定化技术用于白色链霉菌来降低 -PL 发酵成本。他们选用了凝胶和多孔陶瓷作为固定化材料，虽然没能提高产量，但最终达到了降低成本的目的。,国内 -聚赖氨酸发酵工艺优化,姜俊云等11主要研究了 pH、搅拌转速、碳源流加方式对菌体生长和 -PL 合成的影响。试验结果表明，在 5 L 发酵罐中，当 pH 为 4.0、搅拌转速 350 r/min、碳源流加方式为变速流加时，得到了 6.93 g/L 的 -PL 。 朱宏阳等12优化了通风量、pH 和转速，最后经过优化补料方式，-PL 的产量达 13.9 g/L，是出发菌株原始产量的近 20 倍。 刘胜荣15等为了解除产物抑制，筛选了具有高的 -PL 吸附能力和解吸附能力的弱酸性阳离子交换树脂，将该策略应用到发酵罐上，发酵 8天，产量为 23.4 g/L。,2010 年，张扬13等利用丝瓜囊对 -PL 产生菌进行固定化培养，实现了菌体的重复利用，同时使得 -PL 产量达 34.1 g/L，日产率达9.34 （Ld）。 董难17等人从碳源和氮源补料方式的优化入手，建立了流加谷氨酸发酵策略和补料酵母粉发酵策略。在发酵过程中流加谷氨酸 174 h 实现 -PL 产量达到了 31.65 g/L，比对照的 -PL 产量（21.22 g/L）提高了 49.2%。 2010年，陈旭升14 通过研究碳源和氮源流加方式对 -聚赖氨酸补料-分批发酵过程的影响，将补料阶段甘油浓度稳定控制在 0 10 g/L，并在发酵 96 h 开始流加酵母粉和( NH4)2SO4混合液，结合 pH 值 2阶段调控策略( 3. 53. 8) ，经过192 h 发酵，可以实现 -PL 产量达到38. 77 g/L，产率达到4. 85 g/( Ld)。,许召贤18等通过在培养基中添加 0.5%的正十二烷来提高溶解氧，从而达到提高-聚赖氨酸产量的目的，168 h，产量达到30.8 g/L。 周永鹏19等通过对出发菌株进行原生质体融合，得到一株重组菌株F4-22，在5 L酵罐中发酵163 h，产量达到了39.96 g/L，比菌株M-Z18（30.11 g/L）提高了32.7%。 孙启星20等通过在线监控pH的基础上，通过种子阶段孢子预处理与接种量的优化，在5 L发酵罐中发酵186 h，产量达到48.9 g/L。在50 L 发酵罐中发酵186 h，产量达到了36.22 g/L。,任喜东21，22，23等利用农副产品生产-聚赖氨酸，产量达到了35.24 g/L。随后又采用在补料分批发酵中酸性pH冲击策略使产量提高至54.7 g/L，并对其产-聚赖氨酸反应机理进行研究。 曾昕24等研究了葡萄糖和甘油作为混合碳源时对于提高-聚赖氨酸产量的作用，表明混合碳源可以加速细胞的生长以及代谢产物的合成，从而提高-聚赖氨酸的生产率。,六 -PL分离与提取工艺优化,1 -PL分离与提取工艺研究进展,莫树平25等研究了离子交换树脂种类和洗脱条件，筛选到了国产大孔弱酸性阳离子树脂 D113 和 HD-2，并建立了相应的工艺条件。 贾士儒26 等根据 -PL 分子质量大小开发了一种利用多级膜分离技术纯化 -PL 的方法，获得了分子质量分布在 2 5 kDa 的 -PL; 周斌27 等建立了离子交换树脂和膜浓缩技术相结合的方法用于 -PL 的提取。,2 -PL 提取工艺路线的初步建立,-PL 各项参数指标：,-聚赖氨酸 总收率：51.2% 蛋白去除率：98.8% 氯含量：19.1% 灰分：3.2% 蛋白含量：2.5% 产品纯度：88.6% 聚合度：28.4,参考文献： 1 Itzhaki R F. Colorimetric method for estimating polylysine and polyarginineJ. Analytical biochemistry, 1972, 50(2): 569-574. 2 Kahar P, Iwata T, Hiraki J, et al. Enhancement of -polylysine production by Streptomyces albulus strain 410 using pH control. J Biosci Bioeng, 2001, 91:190-194. 3 Shima S, MATSUOKA H, IWAMOTO T, et al. Antimicrobial action of. EPSILON.-poly-L-lysineJ. The Journal of antibiotics, 1984, 37(11): 1449-1455. 4 Vaara M, Vaara T. Polycations sensitize enteric bacteria to antibioticsJ. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 1983, 24(1): 107-113. 5 Vaara M. Agents that increase the permeability of the outer membraneJ. Microbiological reviews, 1992, 56(3): 395-411.,6 Nishikawa M, Ogawa K. Distribution of microbes producing antimicrobial -poly-L-lysine polymers in soil microflora determined by a novel methodJ. Applied and environmental microbiology, 2002, 68(7): 3575-3581. 7 Shima S, Sakai H. Poly-L-lysine produced by Streptomyces. part taxonomy and fermentation studiesJ. . 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