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实验四、双缩脲法测定蛋白质的浓度,相关知识,目前常用的有五种经典方法： 定氮法：灵敏度0.21.0mg 双缩脲法（Biuret法）：120mg Folin酚试剂法(Lowry法)：50100g 紫外吸收法：5g 考马斯亮蓝法（Bradford法）：15g,一、实验目的,掌握双缩脲法定量测定蛋白质含量的原理和方法。 进一步掌握紫外和可见光分光光度计的原理和使用方法。,二、实验原理,双缩脲反应:碱性环境,H2O O=C C=O HN NH R-CH CH-R O=C Cu C=O HN NH R-CH CH-R H2O 紫色络合物,含有两个或两个以上肽键的化合物均有双缩脲反应,蛋白质含有两个以上的肽键，因此有双缩脲反应。在碱性溶液中蛋白质与Cu2+形成紫红色络合物，其颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比，而与蛋白质的分子量及氨基酸成分无关，因此被广泛地应用。 在一定的实验条件下, 未知样品的溶液与标准蛋白质溶液同时反应, 并于540560nm下比色, 可通过标准蛋白质的标准曲线求出未知样品的蛋白质浓度。 除CONH有此反应外，CONH2， CH2NH2，CSNH2等亦有此反应。,三、实验仪器、材料和试剂,（一）仪器 吸量管(1ml/2ml/5ml)、试管及试管架、分光光度计。 （二）材料 标准蛋白溶液(10mg/ml BSA)、 未知液(人血清10) （三）试剂 双缩脲试剂溶解0.175 g硫酸铜（CuSO45H2O）溶于15ml蒸馏水，置于100ml容量瓶中，加入30ml冰冷的蒸馏水和20ml饱和氢氧化钠溶液，摇匀，室温放置12h，再加蒸馏水对刻度，摇匀备用。,四、实验操作步骤,（一） 标准曲线的制作,（二） 绘制标准曲线 以每管蛋白的含量为横坐标,其相对应的A520为纵坐标绘制标准曲线。 （三）未知样品蛋白质浓度的测定 取2只试管，每只分别加入1ml稀释的未知样品，再分别加入4ml双缩脲试剂，操作方法同前。 然后，测540nm处光密度值，取其平均值。从绘制的标准曲线查得未知样品的蛋白浓度。,五、实验结果,Y N 血清样品蛋白质含量 = 100 V 其中： Y为标准曲线查得蛋白质浓度(mg/ml) N为稀释倍数 V为血清样品所取的体积(ml),
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