ATP结合盒转运蛋白与MDR逆转剂

ATP结合盒转运蛋白与MDR逆转剂发表者：姜超248人已访问目前恶性肿瘤严重威胁人类的健康和生命，是人类死亡的主要病因之一，其发病率逐年上升。 肿瘤的治疗临床上是以手术或者放化疗为主，结合生物免疫以及中医药治疗为辅的综合治疗。 其中化疗是绝大多数肿瘤病人都需要使用的重要治疗措施。少数肿瘤可以通过化疗达到临床治 愈，然而对于大多数肿瘤化疗药物无法根本上铲除肿瘤。化疗失败的主要原因之一就是肿瘤耐 药。肿瘤耐药可以分为原发耐药和获得性耐药，分别指肿瘤细胞在未接触化疗药时就已经具有 的耐药性和在化疗过程中逐步产生的耐药性。肿瘤细胞对一种抗肿瘤药物产生耐药性的同时， 对结构和作用机制完全不同的抗肿瘤药物往往也产生交叉耐药，这种现象被成为肿瘤的多药耐 药(multidrug resistance，MDR)，是放化疗失败和肿瘤复发的关键原因。ATP结合盒(ATP-binding cassette,ABC)转运蛋白家族介导的药物外排泵机制是肿瘤耐药的 重要发生机制。根据序列同源性与结构域组成，ABC家族基因可分为ABCABCG等个7亚家 族，分别编码不同跨膜蛋白。它们的共同特点是在跨膜区组成通道，胞浆内面存在ATP结合 区，在Mg2+的参与下水解ATP，完成磷酸化，调节跨膜蛋白离子通道活性，因而能够转运 多种疏水性分子。当这些结构不同的底物进入细胞的浆膜后，ATP转运蛋白可以识别并与之结 合，引起ATP结合区的活化，从而水解ATP，跨膜通道的构象发生改变，将底物泵出到细胞外。 随后，再次发生ATP分子水解，使转运蛋白恢复到原来的构象。这样转运蛋白则以ATP能量依 赖的方式主动地将疏水性的底物从细胞内泵出到细胞外。如果将进入细胞的抗肿瘤药再重新泵 出到细胞外，就会降低细胞内药物蓄积，从而起到降低抗肿瘤药疗效产生耐药作用。研究表明， ABC转运蛋白不仅在肿瘤细胞中高表达，在许多正常组织细胞中也高表达，具有一定的生理 功能。脑、肝脏、小肠、大肠、胰腺、肾脏、睾丸及肾上腺等的上皮细胞及某些内皮细胞均 被发现有ABC转运蛋白的表达&ABC转运蛋白具有以下生理功能:将外源性毒素分泌到胆管、 肠管、泌尿系统内，促进排泄，减少吸收；跨膜转运甾体类激素有利于发挥其正常作用；维持 血脑、血胎盘及血睾屏障功能，防止大脑、睾丸、胎儿受到不良影响；保护和调节干细胞的功 能；维持某些口服类药物如地高辛等的生物利用度(这些药物往往是ABC药泵的底物)。， ATP转运蛋白家族中P-糖蛋白(P-glycoprotein, P-gp,)、多药耐药相关蛋白(multidrug resistance-associated protein, MRP) 以及乳腺癌耐药蛋白(breast cancerresistance protein, BCRP)与MDR的关系最为密切，也是MDR逆转研究的热点。1 P-gp人类P-gp是1个磷酸化和糖基化的跨膜外向转运蛋白，由ABCB1(MDRI)基因编码，位于人类 染色体7q21.1,由1280个氨基酸组成，分子量为170000,包含2个同源单体,每个单体又含 有6个疏水跨膜部分和1个胞内ATP结合部位组成和高度保守的“Walker A”和“Walker B” 结构。多种化疗药物包括蒽环类、长春碱类、紫杉烷类、鬼臼乙叉甙类及米托蒽醍、丝裂霉素 等都是它的底物。肿瘤细胞上高表达的P-gp可以降低抗肿瘤药物在细胞内的累积，从而导致 临床耐药的发生。研究证实几乎所有类型的肿瘤，包括肉瘤、白血病、淋巴瘤等在内，均有MDR1基因的表达。 根据MDR1基因在人体肿瘤中表达的水平，Nooter将肿瘤分为三类：（1）MDR1基因高度表 达的肿瘤，如肾癌、胰腺癌、肝细胞癌等。这类肿瘤的来源组织本身就有中等或高度的MDR1 基因的表达，多表现为原发性耐药，化疗效果差；（2）MDR 1基因中度表达的肿瘤，如乳腺癌、 神经母细胞瘤、白血病等。这类肿瘤较敏感，但是大部分病人在化疗结束后都有复发，复发后 MDR1基因表达的水平更高，对原来敏感的化疗药物耐药；（3）MDR1基因低度表达的肿瘤，如 卵巢癌、小细胞肺癌等。虽然这类肿瘤对化疗药物敏感，但是也会产生多药耐药Burger等苗 用实时定量RT-PCR方法分析了 59例原发乳腺癌标本，结果表明P-gp的表达水平与化疗药物 的初次治疗效果呈负相关，而且P-gp高表达的肿瘤往往预后较差。P-gp已经成为一个重要的肿瘤靶点，通过抑制P-gp功能或表达从而逆转肿瘤细胞的多药耐药 性，使肿瘤细胞恢复对化疗药物的敏感性具有非常重要的临床研究和应用价值。P-gp抑制剂（MDR逆转剂、肿瘤化疗增敏剂）近来成为研究的热点，根据P-gp抑制剂出现的先后顺序和 作用特点将其分为三代：第一代抑制剂的研究开始于1981年。有学者发现钙离子通道阻滞剂维拉帕米能够通过直接与 部分抗肿瘤药物竞争P-gp药泵的外排作用，而提高肿瘤细胞内化疗药物的浓度，从而达到逆 转MDR的作用。后来发现其他的钙通道阻滞剂也有类似作用。第一代P-gp抑制剂还包括：钙 调蛋白拮抗剂，环孢菌素，哇琳及甾体激素类等，其中环抱素的作用最强。它们的主要特点是 在体外试验中可以逆转甚至完全逆转MDR。但在体内试验中，由于自身的剂量限制性毒性，体 内不能达到有效逆转MDR所需要的浓度，例如体内运用维拉帕米出现的严重心血管副作用和环 孢菌素强烈的免疫抑制毒性等。第1代逆转剂在未达到抑制转运蛋白的低浓度就会出现严重的 人体副作用，从而失去临床应用价值。第二代抑制剂是通过改造第一代抑制剂的结构，筛选出逆转活性高而自身毒副作用低的化合物， 代表化合物有PSC833和VX-710 （环抱素D的类似物）还有dexverapamil、dexniguldipine 等。由于很多化疗药物既是P - gp的底物，也是细胞色素P450的同工酶3A4的底物，增敏 剂对P450 3A4的竞争结合影响化疗药物的代谢，导致化疗药物血药浓度升高，产生毒副作用。 例如PSC833比环抱素逆转的作用强1020倍，且在动物模型中与抗肿瘤药物联合应用时，可 使肿瘤体积明显缩小，并有效延长荷瘤动物的寿命。但在临床试验中发现，PSC833能够通过 抑制细胞色素氧化酶P450-3A4介导的紫杉醇和长春新碱代谢，使患者血浆内细胞毒药物水平 明显升高而产生毒副作用10。VX-710是一种能够同时抑制P-gp和MRP活性的逆转剂11，逆转 活性很高，约为第一代抑制剂的100倍以上。然而，VX-710在与紫杉醇联合用药时能显著降 低肿瘤患者的紫杉醇清除率导致毒副反应出现。第三代P-gp抑制剂药物的特点是克服了第二代的缺陷，在与抗肿瘤药物合用时，不影响它们 的药代动力学。主要包括：GF120918、LY335979、Lanquidar（R101933）、ONT2093（OC1442093） 以及XR9576等。目前已进人临床试验的代表性化合物有LY335979和XR9576等。属于一种二 苯基幽烷类衍生物，是一种P-gp高度特异性的抑制剂，但其并非P-gp的底物，对MRP及BCRP 无影响，也是迄今发现的最强的P-gp逆转剂之一，XR9576是邻氨苯甲酸的新型衍生物，是一 种逆转作用极强、P-gp高度选择性的抑制剂。体内实验表明，XR9576能够显著增强阿霉素、 长春新碱及紫杉醇等对人体MDR肿瘤模型的治疗作用，而且不影响这些药物的药物代谢。II期 临床试验也证实其对部分多药耐药肿瘤有良好的逆转作用M。试验表明LY335979能够明显减 小荷瘤小鼠的肿瘤体积，并提高实验动物的生存率，更为重要的是LY335979不影响细胞毒药 物的代谢动力学，具有一定开发应用前景13。2 MRPMRP亚家族主要有9个成员：MRP1MRP7、ABCC11和ABCC12，基本结构与P-gp类似，其中一 个由5个a螺旋组成的N末端区域，而MRP4、MRP5则没有此结构。所有的MRP糖基化位点在 第2部分的第1个跨膜域外部及末端的延长结构上。Colo等1992年从小细胞肺癌H69 /AR耐 药细胞系中克隆出耐药相关基因MRP属于MRPC家族。与P- gp不同，MRP主要转运疏水性不 带电荷的分子或水溶性的阴离子化合物。许多已经证实能够逆转P - gp介导的药物对由MRP 介导的MDR无效。在肝癌细胞中研究发现14，MRP1表达水平和肿瘤的分化、类型以及微血管 侵入相关,MRP1显著上调则肝癌预后明显较差。在对162名手术切除肝癌患者的研究后，有 学者发现MRP1-1666GG基因型高表达与肝癌患者低存活率相关uVOREM等16转染肝癌细胞株 HepG2反义cMOAT cDNA使MRP2基因的转录被抑制，发现转染人细胞的NA的浓度高低与 MRP2活性成反比，而相应的一些化疗药物的半数抑制浓度在cMOAT cDNA组也降.证明对MRP2 基因的转录抑制后，可增强肝癌细胞的化疗敏感性，并逆转其多药耐药；目前，研究发现主要 有以下药物可能逆转由MRP介导的MDR，包括维拉帕米及其衍生物、环孢素A、黄酮类、抗激 素类、哇琳类。GST酶抑制药、非甾体抗炎药如阿司匹林、吲噪美辛、异唑；唑琳衍生物、地 高辛等。维拉帕米可以通过竞争性的与膜上的耐药蛋白(P-gp、MRP1)结合，达到逆转MRP 多药耐药，通过抑制耐药基因(P- gp、MRP1)的表达增加化疗药物的敏感性17； Connor等 在研究过度表达MRP1的NC IH460细胞时，又发现苏灵大(su-lindac)具有逆转MRP1介导的 对ADR的耐药* 以上药物能够进入细胞内抑制MRP，但是这些抑制剂与MRP亲和力低且缺 乏特异性，可能是因为MRP主要转运阴离子化合物，而阴离子化合物如PAK -104P、非甾体抗 炎药物和ONO1O78等很少进入细胞内，所以抑制剂在细胞内很难达到有效抑制浓度。3 BCRPBCRP是最近发现的一个ABC药物外排转运蛋白，其为分子量为95000的磷酸化蛋白，与其他 的ABC转运蛋白相比较，在结构上属于半转运蛋白，仅有6个a螺旋和1个ATP结合位点， 多在细胞膜上以同源二聚体的形式发挥作用。目前认为BCRP定位于细胞膜，这表明它可能主 要参与膜内、膜外药物转运，而不是改变药物在胞内的分布BCRP在正常组织中的分布较广 泛，主要分布于具有分布、排泄功能的组织，尤其在胎盘组织中含量特别丰富。Fumitremorgin C( FTC)和 GF120918 是最早发现的 BCRP 增敏剂，Rabindranw等发现了 FTC 可降低肿瘤细胞耐药性，增加细胞内的药物聚集，可以有效逆转米托蒽醍，阿霉素，topotecan 耐药。而且对P -gp或MRP 1介导的耐药性影响小，已经成为BCRP的药理学研究的有用工具， 但因为神经毒性不能用于动物和人体。目前已经合成多种毒性低、活性强的FTC类似物如Ko143，有望成为临床运用20。Yasuo Imai等认为，植物性雌激素（phytoestro2gens）可以 逆转BCBP介导的MDR，研究中发现，植物性雌激素/黄酮类化合物可增强SN - 38和米托蒽醍 对BCRP转导的K562细胞的细胞毒性。糖基化的黄酮类化合物对P - gp介导的长春新碱抗药 性和MRP1介导的VP - 16的抗药性均无影响，然而二者可以增加拓扑替康在K562 /BCRP细 胞的积聚21。研究者认为，黄酮类化合物和糖基化黄酮类化合物可能会成为克服由BCRP介导 的肿瘤细胞多药耐药的有效药物，如果将黄酮类化合物与BCRP底物的抗肿瘤药物联用，可能 会改变药物动力学，从而提高特异抗肿瘤药物对肿瘤细胞的细胞毒性。Ahmed - Belkacem等 在研究中发现，6 - Prenylchrysin和Tectochrysin是BCRP的特异抑制剂。与GF120918相 比,这两种化合物对P- gp和MRP均无影响，表现出更低的细胞内毒性，且不改变ATP酶活性。 Nakamura等23发现Gefitinib可以直接逆转BCRP介导的MDR。研究中，发现10umol Gefitinib 可以逆转肿瘤细胞对拓朴替康、SN - 38和米托蒽醍的抗药性，提高拓朴替康在耐药细胞内的 蓄积Gefitinib直接抑制拓朴替康转运到囊泡。双嘧哒莫被发现是一种新的BCRP的底物， 同时一些钙离子阻滞剂如尼卡地平、尼群地平和尼莫地平可有效抑制米托蒽醍在BCRP过度表 达的HEK （ human embryo kidney,人胚胎肾）细胞的外排现象，而同为钙离子阻滞剂的地尔硫 廿卓和维拉帕米无此效果。近年来中药逆转肿瘤耐药的研究也得到了广泛的开展。对于中药的活性成分对药物代谢酶和转 运体影响的研究很多，并且发现其中一些植物多酚、黄酮、萜类等对P-gp都有一定的抑制作 用25-27。有研究证实五味子醇甲A能够增强VCR对耐药肝癌细胞HepG2/ADR的细胞毒作用， 其机制是通过影响P-gP底物复合物的形成及功能而实现逆转P-gP介导的多药耐药28。白花蛇舌草提取物对多药耐药白血病细胞HL260/ADR的生长也具有极强的抑制作用，诱导MDR 其凋亡是其主要机制或。在K562/ADM裸鼠移植瘤多药耐药模型中，张姚庆华等普。】发现复方 藤梨根制剂可以增加肿瘤细胞内ADM蓄积浓度，实现部分逆转移植瘤的多药耐药性，其机制之 一是通过抑制P-gp增加的而实现的。中药复方的研究也在同时进行，有研究发现由黄芪、白 术、北沙参等组成的益气养阴方能显著提高顺铂对耐药细胞株A549/DDP的增殖抑制作用，具 有协同增效的作用，逆转A549/DDP细胞的凋亡抵抗可能是其逆转MDR的作用机制之一汇。 中药在逆转肿瘤耐药的同时，往往还具有抗肿瘤、调节免疫等功能，有利于提高肿瘤的整体治 疗水平，这是一个颇具临床应用前景的新的研究领域。为临床抗肿瘤药物的研发以及抗肿瘤治 疗新方法的发现带来了新的希望。从G418筛选，转染到单克隆化的总结筛选之前确定 G418浓度：1. 由于每种细胞对G418的敏感性不同，而且不同的厂家生产的（438有效成分的比重不同， 一般1g的粉剂中有效的（438含量大约为0.722g。2.G418是新霉素的类似物，两者都是通过抑制核糖体的功能和蛋白质的合成而杀死细胞的。但是 新霉素对真核细胞无作用而G418对细菌和真核细胞都起作用。此就是编码3 磷酸转移酶 的基因，它表达的蛋白能够分解新霉素和G418。在进行转染时细胞膜受影响，抗生素可能 对细胞产生较大影响，加上G418有杀菌作用，所以有人主张转转染时不加其它抗生素。3.汇合度对G418筛选结果的影响很大，一般筛选时汇合度不宜超过 50%4.G418的活性不尽相同，所以在筛选之前，一定要确定G418的最佳筛选浓度。具体如下：将 细胞稀释到1000个细胞/ml，在100ug/ml1mg/m|ft G48浓度范围内进行筛选，选择出在1014 天内使细胞全部死亡的最低G18浓度来进行下一步的筛选试验。一个具体试验：3*106个细 胞电转后，分别接种1/4000，1/1000，1/300细胞到孔板中，48h后加药筛选，此时1/300细 胞孔内大约50%汇合度。理论止1/4000孔内有!%的汇合度。筛选9天后，观察1/4000孔内有两 三个克隆，按比例1/300孔内应该有几十个克隆，事实上，它们几乎全死光了，只有几个克 隆加药时间和维持浓度1. 由于基因转染到细胞内之后要一段时间才能表达出蛋白质。所以筛选不能太早；但是也不能太晚，因为转染了外源基因的细胞代谢负荷较大，增值较慢，时间长了就会被没有外 源基因转入的细胞所淹没，最终导致筛选不出阳性克隆，一般要在转染24小时之后才开始加G418筛选随着细胞猷谢G418的浓度和活性都回下降，所以每3天都要更换一次含有G418 的筛选液。这时药物浓度可以降至200ug/ml。2. 加抗生素的时机，主要是考虑插入到细胞基因组的抗性基因是否已经得到表达。一般是转染48小时后加入抗生素。挑出单克隆后就可以用维持浓度，一般是筛选浓度1/2。关于维持浓度，有人说细胞会出现对抗生素的抗性，应 不断提高其浓度。而且，如果你要挑 选到几个阳性克隆中较高表达的克隆的话，可以调整抗生素的浓度。当然，抗性基因高表 达，目的基因不一定就跟着高表达。筛选时的培养液 加药筛选约6天左右，细胞会大量死亡，孔中只剩下的细胞寥寥无几。这时会出现两个问题：1.死亡的细胞会裂解释放出有害物质，导致那些有 neo表达的阳性细胞死亡，即非选择性 死亡，因此要及时换液2 .孔中细胞数目很少，细胞之间的信号会变得很弱，也会导致阳性细胞的状态不佳甚至 死亡。这个时候需要一种特殊的培养液：假如你要转染细包在细胞汇合度达到80%的时候， 换液，培养过夜之后收集培养液，通过滤器消毒，和新鲜的培养液按1： 1混合备用。再转染后筛选过程中就可以应用这种培养基。3. 适当增加血清浓度。筛选时出现的问题及其解决办法：1.问题1。做hela细胞的筛选，现在已经筛选刷6孔板中已经长出一些细胞簇，想把它挑到 96孔板中， 就用U夷酶消化，在消化过程中，胰酶扩散，细胞已经四散开，和人体内代谢药物的主要酶是细胞色素P450超家族(Cytochrome P450 proteins, CYP)，它们是一类主要存 在于肝脏、肠道中的单加氧酶，多位于细胞内质网上，催化多种内、外源物质的(包括大多数临床药物) 代谢。P450酶能通过其结构中的血红素中的铁离子传涕电子，氧化异源物，增强异源物质的水溶性，使它 们更易排出体夕卜。CYP有多个亚家族，包括CYP3A4，CYP3A5, CYP2D6，CYP2C9，CYP2C19等。