沙棘叶总黄酮对AA肉鸡钙代谢及肠钙结合蛋白表达的影响

沙棘叶总黄酮对AA肉鸡钙代谢及肠钙结合蛋白表达的影响摘 要：（目的）本文旨在探讨沙棘叶总黄酮对AA肉鸡钙代谢及肠道钙结合蛋白基因表达的影响。（方法）选用健康的1日龄AA肉鸡（公）240只，随机分成4组：对照组（玉米-豆粕型基础饲粮）、基础日粮0.025%沙棘叶总黄酮组、基础日粮0.05%沙棘叶总黄酮组、基础日粮0.1%沙棘叶总黄酮组。每组设4个重复，每个重复15只。饲养试验共进行7周，在49 d时采集检测样本。在饲养7周后进行为期4天的代谢试验。（结果）结果表明：沙棘叶总黄酮对雌二醇和血钙含量影响不显著（P=0.173 7；P=0.500 9），但可以显著提高血清中活性维生素D3和CaBP的含量（P=0.012 1；P0.000 1）。沙棘叶总黄酮显著提高蛋白质的表观消化率（P=0.001 4）。利用实时荧光定量RT-PCR技术检测肠道中CaBP-D28K基因的表达，检测到添加沙棘叶总黄酮的各处理组CaBP-D28KmRNA相对表达量极显著高于对照组（P0.000 1）。（结论）综合分析认为，沙棘叶总黄酮可以通过提高血清活性维生素D3水平，上调十二指肠组织中CaBP-D28K基因表达，从而增加CaBP的合成，提高AA肉鸡肠钙吸收。关键词：沙棘叶总黄酮；钙代谢；钙结合蛋白基因；AA肉鸡中图分类号: 文献标识码:A 文章编号: Effects of Total Flavonoids of Sea buckthorn Leaves on Calcium Metabolismand Intestinal Calbindin-D28K mRNA Expression in Arbor Acres BroilersAbstract: (Objective) To study effects of total flavonoids of Sea buckthorn leaves on calcium metabolism and calbindin-D28K mRNA expression in intestine of Arbor Acres broilers. (Method) a total of 240 1-day-old health male Arbor Acre broilers were randomly used for 4 dietary treatments. Each treatment was replicated four times with fifteen broilers each. The four dietary treatments were basal diet, basal diet+0.025% flavonoids of sea buckthorn leaves, basal diet+0.05% flavonoids of sea buckthorn leaves and basal diet+0.1% flavonoids of sea buckthorn leaves. The experiment was conducted for 7 weeks. (Result) The result showed that there were no differences in the concentration of E2 and calcium in blood serum supplemented with flavonoids of sea buckthorn leaves and basal diet (P=0.173 7；P=0.500 9),Whereas the concentration of vitamin D3 and CaBP in blood serum was significantly increased (P=0.012 1；P0.000 1). Apparent digestibility of dietary protein was significantly increased (P=0.001 4). Real time RT-PCR was applied to detect Calbindin-D28K mRNA expression in intestine. The result showed that the expression level of calbindin-D28K gene of the diet supplemented with flavonoids of sea buckthorn leaves was significantly higher than that of control group (P0.000 1). (Conclusion) In total, total flavonoids of sea buckthorn leaves could increase the concentration of vitamin D3 in blood serum so as to increase the expression level of calbindin-D28K gene in duodenum, which leaded to the concentration of CaBP increased. As a result, calcium absorption of AA broilers in intestine was increased.Key words: total flavonoids of sea buckthorn leaves; calcium metabolism; calbindin-D28K mRNA; Arbor Acre (AA) broilers沙棘(Hippophae rhamnoides L)属于胡颓子科沙棘属植物，分布广泛，且含有丰富的生物活性物质，其最主要的活性成分沙棘黄酮存在于沙棘的所有部位，尤以沙棘叶中含量最为丰富。大量研究表明大豆黄酮属于植物黄酮类物质大量研究表明植物黄酮类物质，具有弱的雌激素样活性，并能提高钙的吸收能力，预防骨质疏松，被称为“植物雌激素”1-3，如大豆黄酮。而 沙棘黄酮也属于植物黄酮类物质，并与大豆黄酮同属于多酚类化合物，化学结构和生理功能极为相似，提示：是否沙棘黄酮也应具有和大豆黄酮相似的弱的植物雌激素作用，并能在一定程度上提高钙的吸收能力呢。？据现有研究表明，大豆黄酮等植物雌激素对钙代谢的调控机制之一是其与雌激素受体相结合而发挥作用大豆黄酮等植物雌激素对钙代谢的调控机制是其与雌激素受体相结合而发挥作用4、5，但植物雌激素对骨组织强大的影响一定还应存在其他的调控机制但植物雌激素对骨组织强大的影响想必还应存在其他的调控机制。在家禽钙代谢的研究中还发现，钙结合蛋白（CaBP）对钙具有高度亲和力，在禽类肠道组织小肠上皮细胞内其含量与肠钙吸收的量呈正相关，故CaBP在禽类肠钙吸收代谢过程中起重要作用6、7。目前，关于沙棘叶总黄酮对钙代谢的影响及其作用机制的研究还未见报道。本试验旨在通过检测沙棘叶总黄酮对钙代谢相关指标的影响及肠道钙结合蛋白基因的表达，探讨沙棘叶总黄酮对钙代谢作用的另一潜在的机制，为沙棘成为功能性饲料添加剂提供一定的理论依据。1 材料与方法1.1 试验材料沙棘叶总黄酮（总黄酮含量为50%以上）由东北农业大学动物营养研究所提供。1.2 试验动物及试验设计选择健康的1日龄AA肉仔鸡240只。按体重相近的原则，随机分成4组：对照组（玉米-豆粕型基础饲粮）、基础日粮0.025%沙棘叶总黄酮组、基础日粮0.05%沙棘叶总黄酮组、基础日粮0.1%沙棘叶总黄酮组。每组4个重复，每个重复15只。饲养试验共进行7周。按常规免疫程序免疫，其它同常规肉鸡饲养管理。1.3 基础日粮基础日粮参照NRC肉鸡（1994）饲养标准，配制玉米豆粕型基础饲粮。饲料原料成分参照中国饲料营养成分（2001），其具体配方和营养水平见表1。表1 基础日粮组成及营养成分 Table 1 Composition and nutrient levels of basal diets 日粮组成 Compositions（%）13周（13week）47周（47week）营养水平 Nutrient level13周（13week）47周（47week）玉米Corn57.5062.30代谢能ME（MJ/kg）12.3312.50豆粕Soybean meal34.5030.00粗蛋白CP（%）21.7519.72豆油Soybean oil3.003.00赖氨酸Lys（%）1.181.04鱼粉Fish meal1.001.00蛋氨酸+胱氨酸Met+Cys（%）0.910.86蛋氨酸Methionine0.200.20钙Ca（%）页：3计算还是实测值？1.070.96磷酸氢钙Calciumphosphate1.651.70总磷Total P（%）0.700.68石粉Limestone1.501.20有效磷Available P（%）0.460.45食盐Salt0.350.30维生素预混料Vitamin Premix0.030.03微量元素预混料Elements Premix0.200.20胆碱Choline0.100.10合计Total100100每kg饲粮中含：维生素A 1500 IU；维生素D 3200 IU；维生素E 10 IU；维生素K 0.5 mg；维生素B12 0.01 mg；生物素0.15 mg；叶酸0.55 mg；尼克酸30 mg；泛酸10 mg；吡哆醇3.5 mg；核黄素3.6 mg；硫胺素1.8 mg；铜8 mg；碘0.35 mg；铁80 mg；锰60 mg；硒0.15 mg；锌40 mg。Provided per kg of diet: VA 1500 IU; VD 3200 IU; VE 10 IU; VK 0.5 mg; VB12 0.01 mg;Biotin 0.15 mg; Folic 0.55 mg; Niacin 30 mg; Calcium pantothenate 10 mg; pyridoxine 3.5 mg; VB2 3.6 mg; VB1 1.8 mg; Cu 8 mg; I 0.35 mg; Fe 80 mg; Mn 60 mg; Se 0.15 mg; Zn 40 mg1.4 测定项目及方法1.4.1 血清生化指标测定肉鸡生长到49日龄，每组每个重复随机抽取3只，进行翅静脉采血，制备血清，检测指标：血钙（Ca）采用全自动生化分析仪测定；雌二醇（E2）采用放射免疫试剂盒测定（北京福瑞生物工程公司）；活性维生素D3（1,25-(OH)2D3）、钙结合蛋白（CaBP-D28k）采用酶联免疫法（ELISA）试剂盒测定（美国ADL公司）。具体测定方法均按试剂盒说明进行。1.4.2 代谢试验指标测定肉鸡生长到49日龄，预饲3天，采用全收粪法进行4天的代谢试验。以重复为单位准确记录采食量、粪样重，同期采集各试验组饲料样品。测定饲料与粪中粗蛋白和钙的含量，测定方法依据饲料分析与质量检测（杨胜，1998），并计算上述养分的表观消化率。1.4.3 肉鸡十二指肠组织CaBP-D28k基因表达量的测定 采用SYBR Green I实时荧光定量RT-PCR技术，利用18SrRNA作为管家基因测定肉鸡十二指肠组织中CaBP-D28k基因相对表达量。肉鸡生长至49日龄，每组每个重复随机抽取3只，宰杀后迅速剪取十二指肠组织，于冰浴上用生理盐水冲洗内容物，分装后放入液氮中快速冷冻，然后转入-70超低温冰箱冻存待测。按照Trizol reagent提取试剂盒说明进行总RNA提取（上海华舜生物工程有限公司）；使用随机引物和M-MLV反转录酶（Promega公司）对总RNA（2g） 进行反转录，合成cDNA 第一链；以cDNA为模板，采用SYBR Premix Ex Taq TM 试剂盒（TaKaRa公司），于ABI7500实时荧光定量PCR仪上对cDNA目的基因（CaBP-D28k）和管家基因（18S rRNA）进行实时荧光定量PCR扩增反应。扩增采用两步法：预变性95 10s，变性95 5s，退火/延伸60 34S，共40个循环。所用引物序列见表2，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。表2 引物序列及产物大小Table2 The sequences and product size of primers目的基因GenesGenBank 登录号Acession of GenBank No.引物序列Primer sequence产物大小/ bpProduct sizeCaBP-D28kM14230F：5- TGA TGC AAA CAA TGA TGG AAA -3R：5- GCC AGT TCT GCT CGG TAA AG -329818S rRNAAF173612F：5-TAG ATA ACC TCG AGC CGA TCG CA- 3R：5-GAC TTG CCC TCC AAT GGA TCC TC-3312利用CaBP-D28k基因Ct值和18S rRNA基因Ct值的差，即Ct Ct =Ct（CaBP-D28k基因）-Ct（18Sr RNA基因）进行显著性统计分析。用2-CT值表示CaBP-D28k基因在十二指肠组织中相对表达量。1.5 数据处理采用SAS 8.2统计软件ANOVA模块进行单因素方差分析，Duncans进行各处理组间多重比较，检验误差为5%。采用REG过程进行测定指标与试验因素之间的回归分析，CORR相关过程进行检测指标间相关性分析，从而确定各试验因素对各指标的调控效应。2 结果与分析2.1 沙棘叶总黄酮对AA肉鸡血清生化指标的影响表3 沙棘叶总黄酮对AA肉鸡血清生化指标的影响Table 3 Effects of flavonoids of sea buckthorn leaves on serum biochemical indexes in AA broilers项目Items对照组Control group沙棘叶总黄酮水平（%）Level of flavones of sea buckthorn leavesSEMP值P value0.0250.050.1处理效应Treatment一次Linear二次Quadratic雌二醇E2(pg/mL)6.866.978.698.742.000.173 70.136 10.434 9血钙Ca(mmol/L)2.202.212.222.490.330.500 90.071 80.355 3活性维生素D3VD3(pg/mL)199.30b258.30ab276.57ab289.04a53.930.012 10.130 50.136 0钙结合蛋白CaBP(ng/mL)6.76d9.14c11.74b14.12a2.120.000 10.024 90.033 3SEM表示标准误的平均数，同行肩标不含相同字母表示差异显著（P0.05）。下表同。SEM means the average of standard error. In the same row, different lowercase letter superscripts mean significant difference (P0.05). The same is as follow.由表3可知，添加不同水平沙棘叶总黄酮对血清雌二醇（E2）和钙（Ca）含量无明显影响（P=0.173 7）。但回归分析结果表明，随沙棘叶总黄酮添加水平的增加，血清钙含量呈一次线性升高趋势（P0.071 8），即添加沙棘叶总黄酮0.1%组的血钙含量最高。沙棘叶总黄酮对活性维生素D3含量影响显著（P=0.012 1），其中添加沙棘叶总黄酮0.1%组显著高于对照组，其他各组有高于对照组的趋势。添加沙棘叶总黄酮的各处理组CaBP含量均极显著高于对照组（P0.000 1）。回归分析结果表明，随沙棘叶总黄酮添加水平的提高，CaBP含量呈显著的一次线性或一元二次曲线升高（P0.024 9；P0.033 3）。2.2 沙棘叶总黄酮对AA肉鸡钙和蛋白质表观消化率的影响由表4可知，添加不同水平沙棘叶总黄酮对钙表观消化率无明显影响（P=0.249 7）。但回归分析结果表明，随沙棘叶总黄酮添加水平的增加，钙表观消化率呈一次线性升高趋势（P0.057 0），即添加沙棘叶总黄酮0.1%组较高，较对照组的钙表观消化率提高了27.62%。添加沙棘叶总黄酮的各处理组的蛋白质表观消化率均显著高于对照组（P=0.0014）。表4 沙棘叶总黄酮对AA肉鸡钙和蛋白质表观消化率的影响Table 4 Effects of flavones of sea buckthorn leaves on apparent digestibility of calcium and protein in AA broilers（%）项目Items对照组Control group沙棘叶总黄酮水平（%）Level of flavonoids of sea buckthorn leavesSEMP值P value0.0250.050.1处理效应Treatment一次Linear二次Quadratic钙calcium37.1038.2444.8747.358.530.249 70.057 00.300 1粗蛋白Crude protein45.31b62.88a64.20a61.43a5.420.001 40.385 60.270 02.3 AA肉鸡肠道CaBP-D28k基因表达扩增效率分析图1 CT方法的有效性Fig. 1 The efficiency of amplificationCT计算的有效性是在于目的基因与管家基因扩增效率必须大约相等。其中一个敏感的方法是判断CT随模板稀释度的变化规律。本试验对同一样本的cDNA模板进行1、10、100、1 000、10 000倍稀释，分别扩增目的基因（CaBP-D28k）和管家基因（18SrRNA），得到相应的扩增曲线。计算不同稀释倍率下的CT值，对CT值与相应稀释倍率对数进行最小二乘线性拟和，得到斜率为0.092的拟合曲线（图1），表明此线斜率趋近于0，因此认为目的基因与管家基因的扩增效率基本相同8，用2-CT表示目的基因的相对表达量可行。2.4 沙棘叶总黄酮对AA肉鸡十二指肠组织中CaBP-D28k基因表达的影响表5 沙棘叶总黄酮对AA肉鸡十二指肠组织中CaBP-D28k基因表达的影响Table 5 Effects of flavonoids of sea buckthorn leaves on relative expression of CaBP-D28k gene of duodenum in AA broilers项目Items对照组Control group沙棘叶总黄酮水平（%）Level of flavones of sea buckthorn leavesSEMP值P value0.0250.050.1CT(CaBP-18SrRNA)6.67a3.66b3.44b2.49b1.740.000 1由表5可知，添加沙棘叶总黄酮各处理组CaBP-D28k mRNA相对表达量显著高于对照组（P0.000 1）。图2 十二指肠CaBP-D28kmRNA相对表达量Fig. 2 CaBP-D28kmRNA relative expression of duodenum以对照组肉鸡十二指肠组织为对照样品，即对照组2-CT值为1，其他各处理组的2-CT值的含义为对照组十二指肠组织中CaBP-D28k基因表达量的倍数。由图2 可知，添加沙棘叶总黄酮0.025%组、0.05%组和0.1%组的十二指肠组织中CaBP-D28k基因表达量分别是对照组的8.06倍、9.38倍和18.13倍。3 讨 论3.1 沙棘叶总黄酮对AA肉鸡钙代谢相关生化指标的影响Setchell等9研究认为植物雌激素既可发挥雌激素效应也可发挥抗雌激素效应。两者的表现取决于植物雌激素和内源性雌激素之间的平衡。本试验结果表明，各处理组对雌二醇（E2）无显著影响（P=0.173 7），与多数植物雌激素的作用相似10、11，表明本试验结果中沙棘叶总黄酮对钙代谢的作用并非通过改变内源性雌激素的水平而发挥的。孟婷等12研究大豆黄酮对初产蛋鸡试验结果显示，试验组蛋鸡的血清总钙水平和碱性磷酸酶活性有所提高，无机磷水平呈下降趋势，表明大豆异黄酮可改变蛋鸡的钙磷代谢。本试验中也得到了相似的结果。由于血钙的含量是受多种因素调节的，提示沙棘叶总黄酮对血中的钙浓度有影响，但不是直接作用的因素。肠钙吸收主要有两条路线13：一种是按照电化学梯度，由低浓度到高浓度，非饱和的被动转运吸收方式；另外一种就是逆着电化学梯度，由高浓度到低浓度，需要能量的主动转运吸收方式。多数情况下，钙的主动转运状态是决定钙吸收的重要因素。主动转运受钙激素控制，主要是活性维生素D3（1,25-(OH)2D3）、甲状旁腺激素（PTH）。其中活性维生素D3是重要的骨代谢调节激素之一，1,25-(OH)2D3经血液抵达肠道和骨骼组织，能够促进肠道的钙、磷吸收而促进骨骼的钙化过程。本试验中观测到添加沙棘叶总黄酮对血清活性维生素D3含量有显著影响（P=0.012 1），其中添加沙棘叶总黄酮1%组显著高于对照组。表明沙棘叶总黄酮提高血清中活性维生素D3含量，能促进钙的主动转运，调节骨钙的内环境稳定。钙的主动转运除需要活性维生素D3外，还需要钙结合蛋白（CaBP）的协助作用。CaBP受活性维生素D3水平的调节，故又称维生素D依赖性钙结合蛋白(CaBP-Ds)，是机体内钙的重要转运蛋白，其含量高低直接影响到钙、磷吸收代谢，进而影响骨骼发育。研究表明，CaBP（CaBP-D28k）对钙具有高度亲和力，与肠钙吸收的量呈正相关。本试验结果表明，沙棘叶总黄酮对血清中CaBP含量影响显著（P0.000 1），各处理组均显著高于对照组。Wasserman等14研究证实患佝偻病小鸡用活性维生素D3治疗后，肠道内有特异性的CaBP的形成。Tohmon等15的研究结果指出，小鸡采食维生素D缺乏的日粮时，十二指肠、回肠、盲肠、肾脏组织中CaBP含量显著降低，补加维生素D后，其含量显著增加。本试验相关分析结果表明，血清活性维生素D3和CaBP含量的相关系数达0.932 07，正相关性趋于显著（P=0.067 9）。提示沙棘叶总黄酮通过提高血清中活性维生素D3的含量，进而显著提高血清中CaBP的含量，从而提高肠道钙的吸收，影响钙代谢。3.1 沙棘叶总黄酮对AA肉鸡钙和蛋白质表观消化率的影响本课题组前期关于沙棘黄酮对AA肉仔鸡生产性能和内分泌功能影响的研究中发现，在肉鸡生长各阶段添加不同比例的沙棘黄酮可明显提高蛋白质和钙的表观消化率，且添加量0.1%比0.2%的效果好16。除此之外，未见其他报道。在本次对钙代谢研究的试验中也得到了基本一致的结果，添加不同水平沙棘叶总黄酮对钙表观消化率虽无显著影响，但回归分析结果表明，随沙棘叶总黄酮水平的增加，钙表观消化率呈一次线性升高趋势（P0.057 0），添加沙棘叶总黄酮0.1%组的钙表观消化率最高。添加不同水平沙棘黄酮显著提高了蛋白质消化率（P=0.001 4），各沙棘叶总黄酮处理组显著高于对照组。本试验相关性分析结果表明，血清中CaBP含量和钙表观消化率呈显著正相关（r=0.969 70，P=0.030 3），推断沙棘叶总黄酮可以提高钙消化率的原因可能是沙棘叶总黄酮提高了活性维生素D3的含量，进而提高CaBP含量，因CaBP与钙的高度亲和力作用，促进肠钙吸收，进而提高了肠道对钙的利用率。但有关沙棘叶黄酮促进蛋白质吸收的机制目前还不明确，本课题组正在进一步研究中。3.2 沙棘叶总黄酮对AA肉鸡肠道CaBP-D28k基因表达的影响有许多因素影响肉鸡CaBP的合成与分泌，其中，CaBP基因表达量的高低直接影响CaBP的合成。另外，Mayel-Afshar等17研究指出，维生素D缺乏显著降低小肠与肾脏CaBP浓度与CaBP基因表达水平，影响钙磷代谢。由此推测，沙棘叶总黄酮对钙代谢影响可能是与活性维生素D3的调控、CaBP的合成及CaBP的基因表达有关，但关于该领域的研究报道较少，本试验检测了与肠钙吸收相关的钙结合蛋白基因表达水平，试图阐明沙棘叶总黄酮影响钙代谢的作用机制。本试验结果表明，添加沙棘叶总黄酮各处理组CaBP-D28k mRNA相对表达量显著高于对照组（P0.000 1），提示沙棘叶总黄酮可以上调肠道CaBP-D28k基因的表达。相关分析结果表明，血清中活性维生素D3与肠道中CaBP-D28k基因相对表达量趋于显著正相关（P=0.091 8），相关系数达0.908 18；血中CaBP与肠道中CaBP-D28k基因相对表达量相关系数达0.963 37，呈显著正相关（P=0.036 6）。Clemens等18利用鸡CaBP-D28k mRNA合成的寡核苷酸互补片段作为杂交探针，进行Northern分析，发现维生素D缺乏鸡的肠道检测不到CaBP-D28k mRNA，静脉注射1,25-(OH)2D3后，CaBP-D28k mRNA水平增加，因此1,25-(OH)2D3可调节CaBP-D28k基因在肠道、肾脏中的表达，并通过转录和转录后发挥作用。从本试验结果推测，沙棘叶总黄酮对钙代谢的作用是通过提高血清1,25-(OH)2D3水平，上调肠道中CaBP-D28k基因表达，从而增加了CaBP的合成，促进肠钙吸收，提高了钙的利用率，减少钙流失，增加体内钙滞留。4 结 论沙棘叶总黄酮可以调节钙代谢，提高钙和蛋白质表观消化率，其机制之一是沙棘叶总黄酮通过提高血清活性维生素D3水平，上调小肠CaBP-D28K基因表达，从而增加CaBP的合成，提高AA肉鸡肠钙吸收，在一定程度上维护骨健康，是一种具有开发潜力的功能性饲料添加剂。参考文献1. 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