高新技术论文

随着生命科学和化学的不断发展，人们对生物体的认知已经逐渐深入到微观水平。从 单个的生物体到器官到组织到细胞，再从细胞结构到核酸和蛋白的分子水平，人们意识到可 以通过检测分子水平的线性结构(如核酸序列)，来横向比较不同物种，同物种不同个体， 同个体不同细胞或不同生理(病理)状态的差异。这就为生物学和医学的各个领域，提供了 一个强有力的技术平台。目前，常用的分子生物学技术有如下几种1PCR单链构象多态性分析PCR-单链构象多态性分析(PCR- single strand conformation analysis,PCR- SSCP) 是近年来在基因突变检测中运用最广泛的方法之一PCR- SSCP技术凭借突变可引起单链 DNA三级构象改变，通过观察单链DNA在非变性聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率漂移来判断突 变。样品经PCR扩增后，其产物经变性后可以产生2条单链，如果存在基因突变，哪怕是 一个碱基的异常，单链的构象也会发生变化，正常与突变的DNA单链在聚丙烯酰胺凝胶电 泳(PAGE)中，可以显现出不同的带型，从而确定野生型和突变型，PCR- SSCP分析的主 要优点是简易且敏感性较高。但是该技术不能确定突变的部位和性质。PCR- SSCP突变检 测敏感性随PCR产物长度的增加而降低，一般用于检测较小外显子的突变。有时由于单个 核苷酸变化所引起的构象改变很小，用PAGE电泳就可能无法检出，在PCR产物或待测 DNA小于200 bp时，PCR- SSCP分析能够检测出70% 95%的突变。如果以毛细管电泳 代替PAGE，则可大为提高突变检测的效率。Wallace1997 年提出将 PCR- SSCP 和异源 DNA 双链分析(heteroduplex analysis,HA)相结合，称之为SSCP/ HA，部分PCR产物经变性进行SSCP分析以了解 是否具有突变，其余PCR产物直接用于电泳，以检出含有突变的异源DNA双链，电泳凝 胶经银染，单链DNA所形成的带为橘黄或棕色，而双链DNA则表现为灰黑色。该综合手 段可以单链构型多态性和异源双链构型分析两个不同的层次检出突变，是一种经济、迅速的 突变检测手段，但无法提供突变位置的信息。PCR- SSCP有许多改进技术，如RNA单链构象多态性法(PCR- rSSCP)、双脱氧测 序单链片段构象多态分析(PCR- ddF)、限制酶指纹技术(PCR- REF)等。PCR- rSSCP 法依据RNA构象对单个碱基替代更敏感的原理，在PCR引物上加上某类启动子，通过转 录的RNA构象体的电泳迁移差异进行突变鉴别。PCR- ddF法把PCR产物转录，将转录 物用反转录酶进行Sanger双脱氧终止测序反应，通过观察非变性胶上经解链处理所产生的 单链漂移、突变后终止片段的获得与缺失来判断突变。PCR- REF法将RFLP和SSCP 技术优势组合，将PCR扩增的待测片段用5 6种限制酶依次消化，混合并进行末端标记， 最后经变性处理并在非变性凝胶上电泳分离，从而获得来自片段长度和片段构象的双重突变 信息。变性梯度凝胶电泳变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)利用由碱基序列 所决定的DNA片段溶解度或变性度的差异，达到分离野生型与突变型DNA片段的目的， 该手段分辨率达一个碱基。当DNA双链沿变性剂浓度梯度增加的聚丙烯酰胺凝胶迁移时，DNA分子中解链温度(Tm)低的部分逐渐变性解链。一般总是错配碱基部分的异源双链Tm 最低，最容易解链，其次是富含AT碱基对的部位，富含GC碱基对的部位Tm值较高所以 解链较难。因此，正常DNA双链和异源双链在梯度变性胶中电泳时，异源双链总是先解链。 将PCR产生的双链DNA在浓度递增的尿素和甲酰胺变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳，当某一 DNA片段迁移到变性剂浓度与其最低Tm相当的位置时，该片段低温解链部分的双链打开， 部分解链导致DNA迁移速度明显下降，观察样品的迁移率变化即可判断是否存在变异。 DGGE敏感性高，即便异源双链中仅含一个错配碱基，在电泳时也可分辨其迁移率的改变。 DGGE方法的单碱基突变检出率在DNA片段长度600 bp以内可以达到95%。DGGE的成功有赖于双链DNA内部低温解链部分变性后迁移率的改变。但在相当于 最高Tm的变性剂浓度的位置，相应的DNA片段可能全部解链，使试验无法检出存在于高 Tm DNA片段中的碱基替换。为了解决此问题，可以在一个PCR引物的5 端设计一段富 含GC的尾巴，从而使PCR扩增产物的一端富含GC碱基对，保证了绝大多数DNA片段 不会发生完全解链，在最高变性剂浓度区域仍然可以分辨出部分解链的异源双链，这一改进 使DGGE的突变检出率接近100%，但DGGE只能检测突变是否存在而不能确定突变的位 置。DGGE方法需要设计特定片段最佳的PCR引物以及最佳变性条件，这一过程比较复 杂，梯度变性胶的制备需要的设备较昂贵，所以在常规实验室不易实施。双链构象多态分析法双链构象多态分析(double- strand conformation analysis,DSCA)是利用荧光标记引 物，通过PCR扩增出相关的研究片段作为荧光标记参照(fluorescence labeled reference,FLR)DNA分子。然后，用标记参照物FLR分子与待测PCR扩增片段进行杂交。 因为FLR和样本核苷酸序列相似，杂交反应液中所有DNA的正链和反义链之间将形成双 链结构。只有与带荧光标记的FLR分子正链匹配的DNA双链，经过电泳后方可被DNA测 序仪的激光检测系统所检测。所以，可检双链均有一样的FLR正链，杂交双链的电泳迁移 率可能相同，但是由于反义单链的差异双链变性程度的差异而最终造成电泳迁移率的不同。 不像SSCP技术，DSCA能够任意操纵变性双链的形成，选用不同的FLR可以达到难分样 本的最佳分离效果。另外，通过调整FLR和样本待测DNA分子的比例，可专一性增强杂 交异质双链信号并减弱纯合双链信号DSCA技术的优点还在于它依据样品经过固定检测仪 的时间差，而非相同电泳时间迁移的距离差来判断突变的有无，这样就避免了诸如SSCP 等技术分析中因迁移速率差异而降低的泳动速度慢的条带检测率。另一方面，DSCA的有效 检测片段长度可达1 kb。由于激光系统的介入，DSCA的灵敏度和上样量分别得以提高和降 低，不到1秒的泳动差异也足以检测。该技术已被成功地用于囊性纤维化基(cystic fibrosis gene)的4种突变，以及HLA Ñ型基因中131种等应基因的检测。变性-高压液相色谱分析变性-高压液相色谱(denaturing high- performance liquid chromatography,DHPLC)是利用DNA构型改变检测基因突变和遗传多态性的方法之一，其可以检测单核苷酸多态和 可遗传的突变。实验主要过程包括PCR扩增待测和正常DNA样品，将扩增产物变性后再 复性，若存在突变，在这一复性过程中可形成异源双链。在部分变性条件下，高压液相色谱 分析可以有效地区分由变异碱基与正常碱基形成的异源DNA双链和正常DNA双链。由于 DHPLC的分辨率可达到1bp/ kb，而且操作过程可以全部程序化、大规模化和自动化，使 得实验时间大大缩短，实验准确率提高，可作为大群体任何基因突变初筛的有力手段，比 SSCP有更多的优越性，具有广泛的应用前景，许多工作都已经证实了 DHPLC的敏感性、 有效性和准确性。特异性等位基因扩增等位基因特异性扩增法(allele- specific amplificarion,ASA)是基于PCR技术的一种单 核苷酸突变检测法，是分析已知碱基替代或微小片段缺失和插入型突变的常规技术。在PCR 的引物设计中，根据已知突变位点性质在引物3 端或中间设计一错配碱基，使之仅能与突 变型或野生型基因互补而只扩增突变型或野生型基因。ASA技术只需一步PCR反应，甚至无需电泳和标记技术。因其快速，重复性强，耗资 少，无同位素污染以及高效性等特点，将成为有前途的适应于人群大规模突变筛查的方法。 应用该方法最好避免错配碱基为G: T，这种错配可能引发扩增反应。化学裂解错配碱基法化学裂解错配碱基法(chemical cleavage mismatch,CCM)通过化学修饰并切割异源 DNA双链中错配碱基，达到检测点突变的目的。其原理是末端标记的DNA片段暴露于可以 识别并修饰异源双链中错配碱基的化学试剂中(如错配的胞嘧啶可被羟胺修饰，错配的胸腺 嘧啶可被四氧化锇修饰)，被修饰的位点随即可被杂氮环已烷等化学物质裂解。DNA修饰裂 解后，电泳观察DNA片段长度即可知道突变是否存在。该技术较其他突变检测系统有更多 的优越性，可以扫描1 2 kb的大片段DNA并在随后的顺序分析中定位突变位点，其效率 可达100%。该手段通常首先对目标DNA和野生型DNA进行PCR扩增，然后对野生型 DNA扩增片段进行末端标记，标记片段作为探针与目标序列复性形成异源双链，用四氧化 锇(OsO4)或羟胺(hydroxylamine)修饰并用哌啶(piperidine)切割，聚丙烯酰胺电泳 分离不同长度的片段。近年来，有人采用碳化二亚胺作为错配修饰剂，进一步提高了该方法 的敏感性。CCM方法最初采用同位素DNA片段，用荧光标记代替同位素后，称之为荧光 化学裂解错配碱基法(FCCM)，该方法依然比较敏感并且安全，可检出95% 100%的错配。 化学裂解错配碱基法的不足之处在于工作量大，需要使用有害化学物质作为试验用试剂。应用分子生物学技术：可应用于遗传性疾病的研究和病原体的检测及肿瘤的病因学、发病 学、诊断和治疗等方面的研究提高到了基因分子水平。生物学定义：生物学是研究生命现象和生物活动规律的科学。据研究对象分为动物学、植物学、微生物学、古生物学等；依研究内容，分为分类学 解剖学、生理学、细胞学、分子生物学、遗传学、进化生物学、生态学等；从方法论分为实 验生物学与系统生物学等体系。参考资料1.现代分子生物学技术简介分子生物学与中医药【摘要】近年来世界掀起了分子生物学研究热，各个领域都试图借由分子生物学技术在自身领域能有进一步的发展，中医药也不例外。本文概述了中医的整体观与分子生物学的相似之处，介绍了分子生物学技术在中医药领域的应用以及发展。【关键词】分子生物学；中医药；分子生物学技术；现代中医药应用中医药学在几千年的历史长河中，为中华民族的繁衍生息，为人民群众的生命健康作出了不可磨灭的贡献。中医药学以其辩证的整体观、构成论的研究方法、辨证论治的治疗模式以及属于天然植物药的中药所特有的低毒性、确切疗效、无耐药性并具整体调节和双向调节效应等方面的优势，在国际上引起了持续升温的中医热。但中医药要真正走上国际的舞台，除了要不断完善自身所拥有的优势之外，更要在中医的诊断方面规范化，并在微观辩证研究方面取得更大的突破。分子生物学作为一门新兴学科，因其既反映了细胞的微观分子结构， 研究了生命物质基础，又反映了人的整体水平的功能规律，而成为当前生命科学中最重要和最具活力的学科。自人类基因组计划的提出到完成，分子生物学以空前的力度正在改变人们的疾病观、健康观、生命观。伴随着这一研究热点的兴起和深入，各相关学科都以此为契机寻求进一步的拓展。作为正在探索研究现代化的中医学，也积极利用了这一成果，以求进一步的发展。一、中医学的整体观与分子生物学中医整体观是中医学最具特色的理论之一，认为构成人体的各个组成部分之间在结构和功能上相互协调，相互为用，在病理上相互影响，同时认识到人体与外部环境相反成性。而自本世纪五十年代建立起来的分子生物学，从分子水平辩证地研究整体的功能和联系，即应用还原方法对生命进行研究，从细胞超微结构及分子水平阐明生命的物质基础，再经综合分析过程，利用现代系统论、控制论、信息论和协调论等学说，把“孤立”的物质与组成整体的所有器官联系在一起， 把局部的作用和整体的功能联系在一起，把局部的病变和整体的健康状况联系在一起，把人体与自然界联系在一起1，这种建立在大量实验基础上的辩证的整体观不仅与中医的整体观有相似之处。引入分子生物学方法研究中医，既不会脱离中医的整体观，又能使中医从客观化、定量化上与综合一一演绎的方法联系在一起，填补中医缺乏微观还原分析的空白，使中医的抽象思维建立在深刻的实验科学研究的基础上;同时，分子生物学的辩证的整体观、系统论等方法论，有利于中医从朴素的方法论尽快地转到现代辩证的方法论上来。二、分子生物技术在现代中医药发展中的应用随着国家中医药现代化战略的实施，运用现代科技技术对重要的作用机理、质量控制和量效关系进行研究受到了广泛重视。近年来，分子生物学技术在中药质量评价领域的应用逐步扩大，方法也日趋完善，在中药的分子鉴定、中药质量控制、作用机理研究、新药研发等 方面均展示出很好的应用前景。2.1在中药有效成分的提取方面的应用中草药有效成分的提取和鉴定是中药研究的重要工作之一。一种中药材要经过一系列繁琐而艰辛的分离提取过程，鉴定测定后才得知其所含的有效成分及含量，然而有效成分往往是微量的， 如长春花碱等。如何获得更多的有效成分一直是中草药研究的一个奋斗目标。生物技术的快速发展为这一研究提供了新方法、新思路，如转基因器官培养技术等。2.2在中药作用机制方面的应用2.2.1核酸分子杂交技术核酸分子杂交技术是分子生物学的基本技术之一，在中药作用机理研究中较早常用的有印迹杂交、点杂交和原位杂交。廖柏松等3采用Northern blot对用中药二仙汤灌胃同等学力分子生物学考试G蛋白偶联受体氨基酸的类型、18月龄雌性大鼠下丘脑内阿片肽的基因表达水平进行研究，结果显示，二仙汤组8-啡肽前体阿黑皮素原和脑啡肽原的mRNA水平明显升高，达到未衰老前水平。2.2.2 PCR技术PCR是美国科学家Mullis于1983年发明的一种体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，是目前中药机理研究中最常用的分子生物学技术。魏小龙4利用PCR衍生技术即RT-PCR和mRNA差异显示技术对小鼠进行研究，结果提示，小老鼠的中枢学习记忆过程中与海马多种基因表达存在密切关系。2.2.3电泳技术淫羊藿甙（ICA）是从淫羊藿中提取的中药单体，李贵新等5从形态学、DNA电泳以及抑制基因blc-2和c-myc表达等方面深入研究发现，ICA在体外诱导HL-60细胞凋亡呈典型的细胞凋亡形态学和生化特征，并且有时间和剂量的依赖性，S1期细胞减少和CO/C期增多。2.3在中药鉴定方面的应用近年来分子生物技术与植物学、动物学研究的结合，是中药品种研究进入了一个新的高度。中药材（不含矿物药）所依赖的生物资源的多样性是基于其基因的多态性结果，而基因的多态性可自分子水平上检测，它是比在形态、组织、化学水平上的检测更能代表其变异类型的遗传标记。2.3.1鉴定近缘中药品种日本的山崎等6研究了甘草属4种药用植物光果甘草、甘草、刺甘草和刺果甘草的DNA指纹图发现富含甘草甜素的品种光果甘草和甘草之间遗传关系非常相近,这两者与不含甘草甜素或含量极低的刺甘草和刺果甘草的遗传关系则较远,与传统植物分类研究结果吻合。DNA分子标记技术已经应用于如对木蓝属7、铁线莲属8等属的原植物或药材的鉴别。2.3.2鉴定动物类中药品种DNA分子标记技术不仅能对有形的动物药整体而且可以对破碎部分器官组织进行准确的鉴定,王义权等9将RAPD标记技术用于蛇类动物的分类学研究和鉴定,结果表明RAPD标记技术不仅能够用于蛇类动物种间系统演化、种内个体间遗传多样性,并且可以用于蛇类药材的鉴定。2.3.3鉴定药材道地性道地药材与非道地药材物种来源一致或十分相近在形态、生药性状及化学成分等特征上具有高度相似性因而道地药材的鉴别往往不容易,近年来,研究人员从DNA分子水平上来研究中药材道地性取得了许多进展。如利用RAPD技术研究了冬虫夏草的不同地理群体间的遗传分化现象,结果表明来自同一地方的样品遗传差异甚微,同一区域不同地方的样品间遗传差异较大不同区域的样品间遗传差异最大这为冬虫夏草的药材道地性研究提供了分子水平的支持依据。2.3.4鉴定野生与家种（养）药材栽培品和野生品都来自同一个物种,植物形态、药材性状、化学成分、生物活性等往往无明显差异。DNA分子遗传标记技术因不受药材的生境条件等因素的影响,在野生药材与其栽培品的比较研究方面具有良好的应用前景如野山参与园参的DNA分子标识鉴别、栽培姜黄与野生姜黄的鉴别、野生天麻与栽培天麻等。三、分子生物学在中医药方面的发展与展望3.1促进中药毒理学研究中药的安全性问题一直是近几年来国内外普遍关注的问题。如何准确、快速、高效地评价中药复方及其组成药物是否有毒?如何确定有毒中药、中药的有毒成分、中药的有毒总部位?基因表达谱检测技术在中药领域的应用为我们提供了有利的手段。可以用基因表达谱分析研究某种中药或其提取物作用于细胞后基因表达mRNA的变化如发现一些重要的功能基因表达有明显改变,则提示此物质在研究剂量下有一定毒性。有关毒理学方面基因芯片已有不少报道,一种名为TOXCHIP的装置,其实质是通过检测化合物作用于细胞后基因改变研究其毒性。3.2基因芯片鉴别中药基因芯片技术是指采用原位合成或显微打印手段,将数以万计的DNA探针固化于支持物表面上,产生二维DNA探针阵列,然后与标记样本杂交,通过检测杂交信号来实现对生物样品的快速、并行、高效地检测或医学检测。基因芯片鉴别中药材这一技术的前提是获取不同的中药样本的特异性基因序列即基因分型,现在常用的基因分型方法有直接测序荧光能量转移探测,动力PCR及荧光偏振等研究者找出某种中药品种的特定基因或DNA序列后,将这些特定序列作为探针固定于玻片上制成基因芯。当一个来自植物或动物的中药样本中含有与之互补的特定基因片段时,基因芯片可将其测试出来由单片芯片就可用于多种中药样品鉴别。不同中药样品特异性基因序列可理解为广义的中药指纹图谱四、结语分子生物学的理论和技术已渗透到现代医学分子生物学作为一门新兴学科，和中国传统医药学的许多领域,使得中药的发展有了更广阔的前景，使得传统的研究方法和诊治手段有了质的更新,经典科学概念得以延伸和升华,更深层次更本质地认识生命现象内在的基本规律。日新月异的分子生物学理论和技术的发展将推动中药的鉴定、生产、机理研究和新药开 发各个方面的理论和技术更加完善和科学使中药为世界所接受成为可能。我们可以预见现代分子生物学技术与传统中药的完美结合将给中药带来一次发展的契机。参考文献1汪建.试论中医.西医与分子生物学的方法论及三者的辨证关系.医学与哲学，1984，(12)14范秀娟，郭姣，杨国柱，等.分子生物学技术在中药作用机理研究中的应用J.广东药学院学报，2007,23（5）592-5953廖柏松，胡燕，鞠躬，等.二仙汤对18月龄雌性大鼠下丘脑EOP含量及其mRNA水平作用的实验研究J.山东中医学院学报，1996,20(6)399-4014魏小龙.海马学习记忆功能有关基因及六味地黄汤益智作用于基因表达关系的研究J.生理学进展，2000,31）227-2305李贵新，张玲，王芸，等.淫羊藿甙诱导白血病细胞凋亡及其对癌基因表达的影响J.中华血液杂志，2002,23（6）322-3236郑俊华.DNA分子遗传标记技术在生药学研究中的应用J.生药学,2003,3(3):75.7张荣,张步振,叶浩.用RAPD分析法鉴定木蓝属生药J中国中药杂志,1996,22(2):72.8张荣邵建平用RAPD分析法对铁线属7种生药的鉴定研究.中草药,1996,27(11):686.9王义权,周开亚.蛇类药材分子遗传标记鉴别的初步研究J.药学学报,1997,32(5):384.