三聚氰胺的性质及检测方法

三聚氰胺的性质及检测方法1 三聚氰胺的理化性质三聚氰胺（英文：Melamine）分子式为C3H6N6,分子量为126. 12,俗称密胺、蛋白精，IUPAC命名为“1,3,5-三嗪-2,4,6-三胺”，是一种三嗪类含氮杂环有机化合物，为白色单斜晶体,无毒、无味,不可燃烧,可溶于甲醇、甲醛、乙酸、甘油及吡啶等,微溶于水、乙醇,不溶于苯、乙醚、四氯化碳。相对密度为1. 573g/cm3,熔点为354高温下可分解产生含氢化氰、氮氧化物和氨等有毒和刺激性的烟雾。三聚氰胺呈弱碱性,在中性或弱碱性环境下能与甲醛缩合形成各种羟甲基三聚氰胺,但在微酸性(pH值5. 56. 5)环境下,可以与羟甲基的衍生物进行缩聚反应而生成树脂产物。另外,三聚氰胺三种同系物:三聚氰酸、三聚氰酸一酰胺和三聚氰酸二酰胺。三聚氰胺是一种用途十分广泛的有机化工原料，对身体有害，不可用于食品加工或食品添加物。 三聚氰胺部分物理性质： 熔点()：300（升华） 相对密度（水=1）：1.573 相对蒸气密度（空气=1）：4.34 饱和蒸气压(kPa)：6.66 水中溶解度(20)：0.33g2 三聚氰胺的毒性动物长期摄入三聚氰胺会造成生殖、泌尿系统的损害,膀胱、肾部出现结石,并可进一步诱发膀胱癌对于肾脏，短期高浓度接触后会引起肾结石、急性肾衰，长期接触还会造成肾脏组织损伤。三聚氰胺同系物具有三聚氰胺一样的毒性效应,很多研究都将它们作为三聚氰胺复合物(MCs)进行总体毒理学评价。3 第一法 高效液相色谱法（HPLC）3.1 原理 试样用三氯乙酸溶液-乙腈提取，经阳离子交换固相萃取柱净化后，用高效液相色谱测定，外标法定量。3.2 试剂与材料 除非另有说明，所有试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的一级水。甲醇乙腈氨水三氯乙酸柠檬酸辛烷磺酸钠甲醇水溶液三氯乙酸溶液（1）氨化甲醇溶液（5）离子对试剂缓冲液三聚氰胺标准品三聚氰胺标准储备液阳离子交换固相萃取柱定性滤纸海砂微孔滤膜氮气3.3 仪器和设备高效液相色谱（HPLC）仪分析天平离心机超声波水浴固相萃取装置氮气吹干仪涡旋混合器具塞塑料离心管研钵3.4 样品处理3.4.1 提取3.4.1.1 液态奶、奶粉、酸奶、冰淇淋和奶糖等 称取2 g（精确至0.01 g）试样于50 mL具塞塑料离心管中，加入15 mL三氯乙酸溶液和5 mL 乙腈，超声提取10 min，再振荡提取10 min后，以不低于4000 r/min离心10 min。上清液经三氯乙酸溶液润湿的滤纸过滤后，用三氯乙酸溶液定容至25 mL，移取5 mL滤液，加入5 mL水混匀后做待净化液。3.4.1.2 奶酪、奶油和巧克力等 称取2 g（精确至0.01 g）试样于研钵中，加入适量海砂（试样质量的4倍6倍）研磨成干粉状，转移至50 mL具塞塑料离心管中，用15 mL三氯乙酸溶液分数次清洗研钵，清洗液转入离心管中，再往离心管中加入5 mL乙腈，余下操作同3.4.1.1中“超声提取10 min，加入5 mL水混匀后做待净化液”。 注：若样品中脂肪含量较高，可以用三氯乙酸溶液饱和的正己烷液-液分配除脂后再用SPE柱净化。3.4.2 净化将3.4.1中的待净化液转移至固相萃取柱中。依次用3 mL水和3 mL甲醇洗涤，抽至近干后 ，用6 mL氨化甲醇溶液洗脱。整个固相萃取过程流速不超过1 mL/min。洗脱液于50下用氮气吹干，残留物（相当于0.4 g样品）用1 mL流动相定容，涡旋混合1 min，过微孔滤膜后，供HPLC 测定。3.5 高效液相色谱测定3.5.1 标准曲线的绘制用流动相将三聚氰胺标准储备液逐级稀释得到的浓度为 0.8、2、20、40、80 g/mL 的标准工作液，浓度由低到高进样检测，以峰面积-浓度作图，得到标准曲线回归方程。基质匹配加标三聚氰胺的样品HPLC 色谱图参见附录 A 中的图A1.3.5.2 定量测定 待测样液中三聚氰胺的响应值应在标准曲线线性范围内，超过线性范围则应稀释后再进样分析。3.5.3 结果计算试样中三聚氰胺的含量由色谱数据处理软件或按式（1）计算获得：A c V1000 X= f （1）As m1000 式中：X 试样中三聚氰胺的含量，单位为毫克每千克（mg/kg）；A 样液中三聚氰胺的峰面积；c 标准溶液中三聚氰胺的浓度，单位为微克每毫升（g/mL）；V 样液最终定容体积，单位为毫升（mL）；As 标准溶液中三聚氰胺的峰面积；m 试样的质量，单位为克（g）；f 稀释倍数。3.6 空白实验 除不称取样品外，均按上述测定条件和步骤进行。3.7 方法定量限 本方法的定量限为2 mg/kg。3.8 回收率 在添加浓度2 mg/kg10 mg/kg浓度范围内，回收率在80%110%之间，相对标准偏差小于10%。3.9 允许差在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。4 第二法 液相色谱-质谱/质谱法（LC-MS/MS）4.1 原理 试样用三氯乙酸溶液提取，经阳离子交换固相萃取柱净化后，用液相色谱-质谱/质谱法测定和确证 ，外标法定量。4.2 试剂与材料 除非另有说明，所有试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的一级水。乙酸。乙酸铵。乙酸铵溶液（10 mmol/L）：准确称取 0.772 g 乙酸铵于1 L 容量瓶中， 用水溶解并定容至刻度，混匀后备用。其他同3.2。4.3 仪器和设备液相色谱-质谱/质谱（LC-MS/MS）仪：配有电喷雾离子源（ESI）。其他同3.3。4.4 样品处理4.4.1 提取 奶粉 称取1 g（精确至0.01 g）试样于50 mL具塞塑料离心管中，加入8 mL三氯乙酸溶液和2 mL 乙腈，超声提取10 min，再振荡提取10 min后，以不低于4000 r/min离心10 min。上清液经三氯乙酸溶液润湿的滤纸过滤后，做待净化液。4.4.2 净化 将4.4.1中的待净化液转移至固相萃取柱中。依次用3 mL水和3 mL甲醇洗涤，抽至近干后 ，用6 mL氨化甲醇溶液洗脱。整个固相萃取过程流速不超过1 mL/min。洗脱液于50下用氮气吹干，残留物（相当于1 g试样）用1 mL流动相定容，涡旋混合1 min，过微孔滤膜后 ，供 LC-MS/MS 测定。4.5 液相色谱-质谱/质谱测定4.5.1 标准曲线的绘制 取空白样品按照 4.4 处理。用所得的样品溶液将三聚氰胺标准储备液逐级稀释得到的浓度为 0.01、0.05、0.1、0.2、0.5 g/mL 的标准工作液，浓度由低到高进样检测，以定量子离子峰面积- 浓度作图，得到标准曲线回归方程。基质匹配加标三聚氰胺的样品 LC-MS/MS 多反应监测质量色谱图参见附录 A 中的图 A.2。4.5.2 定量测定 待测样液中三聚氰胺的响应值应在标准曲线线性范围内，超过线性范围则应稀释后再进样分析。4.5.3 定性判定 按照上述条件测定试样和标准工作溶液，如果试样中的质量色谱峰保留时间与标准工作溶液一致（变化范围在2.5%之内）；样品中目标化合物的两个子离子的相对丰度与浓度相当标准溶液的相对丰度一致，相对丰度偏差不超过表1的规定，则可判断样品中存在三聚氰胺。表1 定性离子相对丰度的最大允许偏差相对离子丰度50%20%至 50%10%至 20%10%允许的相对偏差20%25%30%50%4.5.4 结果计算 同3.5.4。4.6 空白实验 除不称取样品外，均按上述测定条件和步骤进行。4.7 方法定量限 本方法的定量限为0.01 mg/kg。4.8 回收率 在添加浓度0.01 mg/kg0.5 mg/kg浓度范围内，回收率在80%110%之间，相对标准偏差小于10%。4.9 允许差在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的15%。5 第三法 气相色谱-质谱联用法（GC-MS和GC-MS/MS）5.1 原理试样经超声提取、固相萃取净化后，进行硅烷化衍生，衍生产物采用选择离子监测质谱扫描模式（SIM）或多反应监测质谱扫描模式（MRM），用化合物的保留时间和质谱碎片的丰度比定性，外标法定量。5.2 试剂与材料 除非另有说明，所有试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的一级水。吡啶乙酸铅衍生化试剂：N,O-双三甲基硅基三氟乙酰胺（BSTFA）三甲基氯硅烷（TMCS）（9910)。乙酸铅溶液（22 g/L）三聚氰胺标准溶液氩气氦气其他同3.2。5.3 仪器和设备气相色谱-质谱（GC-MS）仪气相色谱-质谱/质谱（GC-MS/MS）仪：配有电子轰击电离离子源（EI）。电子恒温箱。其他同3.3。5.4 样品处理5.4.1 GC-MS法5.4.1.1 提取 奶粉 称取5 g（精确至0.01 g）样品于50 mL具塞比色管，加入25 mL三氯乙酸溶液，涡漩振荡30 s，再加入15 mL三氯乙酸溶液，超声提取15 min，加入2 mL乙酸铅溶液，用三氯乙酸溶液定容至刻度。充分混匀后，转移上层提取液约30 mL至50 mL离心试管，以不低于4000 r/min离心10 min。上清液待净化。5.4.1.2 净化 准确移取5 mL的待净化滤液至固相萃取柱中。再用3 mL水、3 mL甲醇淋洗，弃淋洗液，抽近干后用3 mL氨化甲醇溶液洗脱，收集洗脱液，50下氮气吹干。5.4.2 GC-MS/MS法 奶粉 称取0.5 g（精确至0.01 g）试样，加入 5 mL甲醇水溶液，涡 旋 混 匀2 min后，超声提取15 min 20 min，以不低于4000 r/min离心10 min，取上清液200 L用微孔滤膜过滤，50下氮气吹干。5.4.3 衍生化取上述氮气吹干残留物，加入600 L的吡啶和200 L衍生化试剂，混匀，70反应30 min 后，供GC-MS或GC-MS/MS法定量检测或确证。5.5 气相色谱-质谱测定5.5.1 标准曲线的绘制5.5.1.1 GC-MS法 准确吸取三聚氰胺标准溶液0、0.4、0.8、1.6、4、8、16 mL 于 7 个 100 mL 容量瓶中，用甲醇稀释至刻度。各取1 mL 用氮气吹干，按照5.4.3 步骤衍生化。配制成衍生产物浓度分别为0、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2 g/mL 的标准溶液。反应液供 GC-MS 测定。以标准工作溶液浓度为横坐标，定量离子质量色谱峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线。标准溶液的 GC-MS 选择离子质量色谱图参见附录 A 中的图 A.3，三聚氰胺衍生物选择离子质谱图参见附录 A 中的图 A.4。5.5.1.2 GC-MS/MS法 准确吸取三聚氰胺标准溶液0、0.04、0.08、0.4、0.8、4、8 mL分别于7个100 mL容量瓶中 ，用甲醇稀释至刻度。各取1 mL用氮气吹干，按照5.4.3步骤衍生化。配制成衍生化产物浓度分别为0、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1 g/mL的标准溶液。反应液供GC-MS/MS测定。以标准工作溶液浓度为横坐标，定量离子质量色谱峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线。标准溶液的GC-MS/MS多反应监测质量色谱图参见附录A中的图A.5。5.5.2 定量测定 待测样液中三聚氰胺的响应值应在标准曲线线性范围内，超过线性范围则应对净化液稀释，重新衍生化后再进样分析。5.5.3 定性判定5.5.3.1 GC-MS 法 以标准样品的保留时间和监测离子（m/z 99、171、327 和 342）定性，待测样品中 4 个离子（m/z 99、171、327 和 342）的丰度比与标准品的相同离子丰度比相差不大于 20%。5.5.3.2 GC-MS/MS 法 以标准样品的保留时间以及多反应监测离子（m/z 342327、342171）定性，其他定性判定原则同 4.5.5。5.5.4 结果计算同3.5.4。5.6 空白实验 除不称取样品外，均按上述测定条件和步骤进行。5.7 方法定量限 本方法中，气相色谱-质谱法（GC-MS法）的定量限为0.05 mg/kg，气相色谱-质谱/质谱法（GC-MS/MS 法）的定量限为0.005 mg/kg。5.8 回收率 GC-MS法：在添加浓度0.05 mg/kg2 mg/kg浓度范围内，回收率在70%110%之间，相对标准偏差小于10%。 GC-MS/MS法：在添加浓度0.005 mg/kg1 mg/kg浓度范围内，回收率在90%105%之间，相对标准偏差小于10%。5.9 允许差 在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的15%。6 表面活性剂增敏荷移反应紫外分光光度法测定三聚氰胺6.1 原理CTMAB 对三聚氰胺与四氯对苯醌( TCBQ) 荷移反应产物具有显著的紫外光谱增敏作用，反应产物的吸光度值与三聚氰胺的浓度之间具有良好的线性关系。据此建立了一种三聚氰胺的紫外光谱测定新方法。三聚氰胺分子中-NH2上的氮原子有一对孤对电子，空间阻碍又小，是良好的电子供体，而 TCBQ 是一个很强的平面型 电子受体，因此，在乙腈溶液中 MEL 与 TCBQ 形成了 n- 型荷移配合物。用摩尔比法测得配合物的组成为 1 3，表明是一个三聚氰胺分子中通过三个-NH2上的氮原子与三个 TCBQ 分子进行荷移反应，形成了 n-型荷移配合物( TCBQ)3MEL，结构稳定，新出现的309nm 吸收峰正是该荷移反应产物的特征吸收峰。其形成原理可表示如下:当向该体系加入 CTMAB 后，MEL + TCBQ +CTMAB 溶液的特征吸收峰位不变，但峰高明显增强，反映出表面活性剂 CTMAB 对 MEL 与 TCBQ 的荷移反应具有增敏效应.6.2仪器与试剂UV-2550 型紫外分光光度计; PB-21 型精密酸度计。奶粉；三聚氰胺( sigma 试剂， 99%) 溶液四氯对苯醌( TCBQ) 乙醇溶液( 1.0 10-3mol / L) ; 十六烷基三甲基溴化铵( CTMAB) 溶液( 0.2g/L) ; Tris-HCl 缓冲溶液 pH = 7.55;Tween-20; 十二烷基苯磺酸钠(SDBS) ; 十二烷基硫酸钠(SDS) ; 乙腈。三聚氰胺分子印迹聚合物固相萃取柱: 自制。所用试剂均为分析纯。实验用水为二次蒸馏水。6.3 实验方法三聚氰胺分子印迹固相萃取柱的制备：以三聚氰胺为模板分子，以-甲基丙烯酸为功能单体，乙二醇二甲基丙烯酸酯为交联剂，以乙醇-水(5:1，V/V) 为溶剂，60 聚合 24 h，制备三聚氰胺分子印迹聚合物。取适量聚合物粉末装入固相萃取空柱中，两端分别用滤膜垫片堵住，备用。奶粉样品的制备：参照国标法处理样品: 在离心管中分别准确移取 1 mL 或 1. 0g 牛奶样品，加入 5 mL1% 三 氯 乙 酸 ( pH = 3. 0 )和乙腈混合液（3: 1，V/V) ，超 声 10 min，振 荡 10 min，以8000r / min离心 10 min，转移合并上清液，将上清液减压蒸干，水溶，用0. 45m微孔滤膜过滤得样液。吸光度的测定：于 10 mL 比色管中，依次加入一定量 MEL 工作液、TCBQ 溶液 1.8 mL、CTMAB 溶液 0.5 mL 和 Tris-HCl 缓冲溶液1.2mL；再取一10ml比色管，依次加入一定量的奶粉样品、TCBQ 溶液 1.8 mL、CTMAB 溶液 0.5 mL 和 Tris-HCl 缓冲溶液1.2mL。所有比色管摇匀，用乙腈定容至5mL，于30水浴中反应40min后，取出冷却至室温，用1cm 吸收池，以试剂空白为参比，在309nm 处测其吸光度。6.4 数据处理用所得的吸光度值做线性回归方程，求出样品中的三聚氰胺含量。6.5 共存物质的干扰 当三聚氰胺溶液浓度为 1.010 6mol/L，测定的相对误差在5% 范围内时发现，牛奶中一些常见物质对三聚氰胺测定的最大允许倍数分别是:Mg2+( 200) K+(200) 、Fe3 +(100) 、Ca2 +(50) 、Zn2 +(10) 、蔗 糖 ( 50) 、葡 萄 糖 ( 200) 、麦 芽 糖(200) 、维生素 C(100) 。2.2.6 样品加标回收率采用两种方法测定样液，均未检出三聚氰胺。对样品进行三个浓度水平的加标回收率测定，结果见表2.1。可见新建分光光度法测定三聚氰胺结果满意; 用两种方法进行样品预处理时，方法 2 的加标回收率优于方法 1，反映自制固相萃取柱预处理样品效果更好。表2.1方法 1编号 加入量c / ( mol / L) 测量值c / ( mol / L)回收率/ %RSD/ %10.40.474118.51.920.80.70588.12.131.61.41688.51.5方法 2编号 加入量c / ( mol / L) 测量值c / ( mol / L)回收率/ %RSD/ %10.40.413103.21.320.80.78898.50.731.61.57998.71.17 表面解吸常压化学电离质谱法7.1 实验原理由于三聚氰胺呈碱性,在正离子模式下易质子化形成M+H+的分子离子,因而在质谱中获得很强的信号峰(m /z127)。选择m /z127分子离子峰进行二级质谱研究,主要得到特征离子m /z110,85,68和60(如图2所示),分别为母离子丢失NH3、NH2CN、NH2CN及NH3、HNCNCN所致,另外,二级质谱碎片离子m /z85的三级质谱中,可产生m /z68的碎片离子,为二聚氰胺质子化离子进一步丢失NH3所致。为了确保结果的可靠性,实验还采用ESI-MS方法对三聚氰胺进行了MS/MS谱对照分析,并且通过氘代三聚氰胺的SDAPCI-MS/MS谱图对有关特征离子的结构式(如图2及图3所示)进行了确认。如果在实际样品中能够检测到信号峰m /z127,并且在MS/MS谱中观察到主要特征离子m /z110、85(基峰)、68和60,则可以判断该样品中含有三聚氰胺,如图3所示。7.2 仪器与试剂SDAPCI离子源:如图1所示。LTQ-XL型线性离子阱质谱仪。三聚氰胺,使用时配置成100. 0 mg/kg水溶液备用;奶粉样品。7.3 实验方法线性回归方程建立：配制0.010、0.10、1.0、10.0和100.0 mg/kg的三聚氰胺标准溶液,分别取100uL滴在不含三聚氰胺的奶粉样品中,按前述实验方法进行SDAPCI-MS实验。7.4 数据处理将二级质谱中获得的信号扣除背景后以m /z85的净响应信号强度表示,每个浓度的标准样品测定6次,测定净响应信号强度平均值及相应相对标准偏差。信号强度与样品浓度分别取对数,绘制工作曲线。在0. 01100 mg/kg范围内,离子强度的对数(Y)与浓度的对数(X)具有较好的线性关系。对0. 10 mg/kg标准样品进行测定,获得净响应信号强度为72(n=6)。本方法三聚氰胺的检出限为8. 8Lg/kg。7.5 线性范围、检出限、回收率和精密度配制0.010、0.10、1.0、10.0和100.0 mg/kg的三聚氰胺标准溶液,分别取100LL滴在不含三聚氰胺的奶粉样品中,按前述实验方法进行SDAPCI-MS实验。将二级质谱中获得的信号扣除背景后以m /z85的净响应信号强度表示,每个浓度的标准样品测定6次,测定净响应信号强度平均值及相应相对标准偏差(括号内)依次为: 58(9.2% )、72(3.9% )、98(5.6% )、145(8.3% )、205(5.8% )。信号强度与样品浓度分别取对数,绘制工作曲线。在0. 01100 mg/kg范围内,离子强度的对数(Y)与浓度的对数(X)具有较好的线性关系。线性回归方程Y=0.1402X+2.0168,相关系数r=0. 990。对0. 10 mg/kg标准样品进行测定,获得净响应信号强度为72(n=6),并测得空白样品的3倍标准偏差为6. 336(S/N=3, n=20),计算得本方法对三聚氰胺的检出限为8. 8Lg/kg。回收实验时,在9份0. 1 g奶粉样品中, 3份加入100LL水, 6份分别加入100LL 1. 0 mg/kg和5.0 mg/kg(各3份)三聚氰胺的标准溶液,按照实验方法进行测定。获得样品中三聚氰胺含量为2. 2 mg/kg(n=6),加标回收率分别为: 93. 1%、105. 4%、112. 8%、97. 5%、86. 7%、10312%。这可能是由于手动进样时的不稳定性(如抖动等原因)和样品表面不均匀性造成的,如果采用自动进样则可能克服此问题,进一步提高其分析性能。8 超高效液相色谱-串联质谱法8.1原理 三聚氰胺是一种弱碱性化合物,微溶于冷水,可溶于甲醇、乙腈、甲醛、乙酸、三氯乙酸、热乙二醇、甘油、吡啶等。本实验以含5%乙酸铅的三氯乙酸的溶液做为提取液,能够有效沉淀样品基质中的蛋白。样品经过甲基叔丁基醚的液液萃取,能有效地除去基质中的油脂。采用混合阳离子交换固相萃取柱能进一步除去样品基质干扰,提高方法的回收率及灵敏度。8.2 实验仪器与试剂Agilent1200超高效液相色谱仪离心机涡旋混合器固相萃取仪氮吹仪乙腈(HPLC级),甲醇(HPLC级),乙酸铵(HPLC级),超纯水,三聚氰胺标准品(纯度99%),三氯乙酸(分析纯),乙酸铅(分析纯),氨水(分析纯),水(超纯水), PCX混合阳离子交换柱(60 mg/3 mL)。三聚氰胺标准储备液(1 mg/mL),三聚氰胺标准工作液(5Lg/mL)。三聚氰胺标准溶液(11000 ng/mL)。8.3 实验步骤 样品提取： 准确称取2.00.01 g待测样品于50 mL离心管中,加入20 mL提取液(含5%乙酸铅的三氯乙酸溶液),液体样品加提取液定容至20mL,涡旋2 min,超声提取25 min,静置2 min,10000 rPmin离心10 min。 样品净化： 将离心液倒入装有20 mL甲基叔丁基醚的分液漏斗中,剧烈震荡2 min,静置10 min,收集下层液。分别用3 mL甲醇, 3 mL水活化混合型阳离子交换固相萃取柱,准确移取10 mL收集液分次上柱,控制过柱速度在1 mLPmin以内,再用3 mL水和3 mL甲醇洗涤混合型阳离子交换固相萃取柱,抽近干后用3 mL氨化甲醇(V(氨水)BV(甲醇)=5B95)洗脱,收集洗脱液于50e氮吹下吹干。精确量取90%乙腈1 mL溶解残留物,涡旋1 min,过0.45Lm滤膜,上机测试。 8.4 方法的线性范围和检出限分别配制浓度为1, 10, 50, 100, 200, 500,1000 ngPmL的三聚氰胺标准溶液,在此范围内考察该方法的线性,以浓度与峰面积的对应关系,绘制标准曲线,线性方程为y= 1519110x-2413492,R2=019998,线性关系良好。以信躁比3：1确定检出限为0.101 mg/kg。8.5 方法的回收率和精密度以空白样品为测试样品,加标水平在10, 30,45ug/kg上。在相同的条件下每个水平做4个平行,回收率及相对标准偏差见表4.1。 表4.1 回收率和精密度实验(n=4)化合物加入量/(Lg/kg)测定量/(Lg/kg)回收率/%RSD/%三聚氰胺108.1 7.9 8.5 6.978.58.63025.2 24.3 26.8 27.486.55.54541.3 43.2 42.4 39.892.63.59 高效毛细管电泳法9.1 原理 三聚氰胺呈弱碱性(pKb=8),在酸性环境下带正电荷,选择在pH2.6的环境下分离。9.2 仪器、试剂与材料毛细管电泳仪高速冷冻离心机pH计。 三氯乙酸、柠檬酸(Cit)、Na2HPO4、甲醇。三聚氰胺标准品(纯度大于99% )。用甲醇溶液溶解三聚氰胺标准品,配成500mg/L的储备液。用甲醇溶液稀释储备液,配制成质量浓度分别为1,5,10,20,40,50,80,100mg/L的工作液。奶粉。9.3 样品前处理 奶粉的前处理方法 称取2g奶粉样品,加入20mL2%三氯乙酸,涡旋1m in,超声20m in,于9000r/m in速率下离心5min。取10mL上清液过MCX小柱,(预先用3mL甲醇、3mL水活化)。分别用3mL水和3mL甲醇洗涤,抽干SPE柱,用4mL5%氨化甲醇(5mL氨水和95mL甲醇混匀)洗脱,收集洗脱液,并于50下用氮气吹干。残留物中加入500uL甲醇溶液复溶,过滤后上机测定。9.4 电泳条件 毛细管(有效长度50cm,内径75Lm);分离电压25kV;温度25;进样3.5kPa(35mbar)*8s;检测波长232nm。使用前依次用0.1moL/LNaOH冲洗5m in、超纯水冲洗5m in、缓冲溶液冲洗20m in;两次进样间用缓冲溶液冲洗3min。9.5 数据处理在1100mg/L范围内,三聚氰胺的峰面积(Y)与质量浓度(X,mg/L)之间呈线性相关，求出线性回归方程，带入求的三聚氰胺含量。9.6 方法的准确度和精密度 在空白牛奶和奶粉样品中添加三聚氰胺工作液,牛奶的添加水平为0.5,20和50mg/kg;奶粉的添加水平为1.0,20,50mg/kg,每个添加水平测定5个平行样,计算回收率和日内测定的相对标准偏差(RSD);连续测定3d,计算日间测定的RSD,结果见表5.1。 表5.1 牛奶和奶粉中添加的三聚氰胺的回收率及日内、日间测定的RSD样品 添加量/(mg/kg)回收率/%日内RSD /% (n=5)日间RSD /% (n=3)牛奶0.597.02.1 2.12094.43.03.95091.43.02.4奶粉1.077.12.63.12073.82.83.65073.13.63.610 金纳米粒子作探针共振瑞利散射光谱法测定牛奶中三聚氰胺10.1 原理 在PBS缓冲体系中, 金纳米粒子与三聚氰胺形成粒径较大的聚集体, 导致共振瑞利散射(RRS)强度显著增强, 在一定条件下, 散射强度(IRRS)与三聚氰胺浓度成正比, 由此建立了以金纳米粒子作光谱探针检测鲜牛奶中三聚氰胺的新方法. 在优化的实验条件下, 当三聚氰胺的浓度为 3.31084.7107mol/L 时, 其线性关系为: IRRS106.98C28.279, R20.9971, 检出限为 2.7108mol/L. 本方法金纳米粒子无需修饰, 在体系中仅加入一定量的单链寡聚核苷酸(T10), 实验表明该方法具有简便、快速、灵敏度高及选择性好等特点。10.2 试剂与仪器 试剂柠檬酸三钠、氯金酸、三聚氰胺、Na2HPO412H2O、NaH2PO42H2O、乙腈、正己烷、三氯乙酸, 系列单链寡聚核苷酸, 碱基均为胸腺嘧啶。仪器荧光分光光度计紫外可见分光光度计电子天平酸度计微量离心机 高速离心机 旋转蒸发器10.3 实验过程 配制金纳米溶液、三聚氰胺(Melamine)标准工作液 共振散射光谱测定：在 1000 L EP 管中加入 50 L, 5.0106mol/L 寡聚核苷酸 T10(以 0.3 mol/L PBS, pH7.4 缓冲溶液配制)及 50 L 三聚氰胺标准溶液(105107mol/L). 静置孵化 15 min 后加入 500 L, 1.72109mol/L 金纳米溶液.利用荧光分光光度计对反应体系的共振散射光谱扫描.设定的激发与发射波长相同(0), 激发狭缝和发射狭缝宽度均为 5 nm, 扫描范围为 220800 nm, 灵敏度设置为低档, 根据所记录570nm处的散射光强度, 进行结果分析。10.4 牛奶中的测定取按国标法制备的样品储备液, 按以上优化的实验条件, 采用标准加入法检验方法检测三聚氰胺的回收率和相对标准偏差(RSD), 结果列于表6.1。表6.1 牛奶中三聚氰胺的测定结果(n5)样品加入量/(107mol/L)测定值/(107mol/L)回收率/%RSD/%10.6250.664106.21.920.8330.80596.65.131.0400.96292.44.242.0801.92092.12.554.1704.180100.23.3 实验结果表明, 本方法有较好的准确度和精密度,回收率分别为 92.1%106.2%, RSD 在 1.9%5.1%, 且样品前处理简单, 分析时间短, 不需使用大型仪器, 可用于牛奶样品中三聚氰胺的快速检测。11 微波消解-流动注射化学发光法测定奶粉中的三聚氰胺11.1 原理根据Cr3+对 luminol-H2O2化学发光体系的线性催化作用，首次将K2Cr2O7在强酸性介质中被有机物三聚氰胺还原成Cr3+的反应与 luminol-H2O2- Cr3+化学发光反应偶合，并结合微波程序消解高效前处理技术和流动注射分析技术，建立了一种灵敏、准确、成本低廉的测定乳粉中三聚氰胺的新方法。11.2 实验仪器离子分析仪电子天平石英亚沸高纯水蒸馏器电热恒温鼓风干燥箱微波消解-萃取仪温控消化炉固相萃取装置低速台式离心机氮吹仪。11.3 实验试剂三聚氰胺标准品鲁米诺三氯化铬双氧水重铬酸钾浓硫酸氢氧化钠乙二胺四乙酸二钠盐盐酸奶粉。11.4 实验方法按图 3.1 所示安装好管道，启动仪器，在设定的工作参数下预热和走基线，待基线稳定后，注入待测定溶液，进行化学发光强度测定，以相对峰高定量。11.5 奶粉样品的前处理及测定 提取样品： 称取 2 g（精确至 0.0001 g）乳粉试样于 50 mL 具塞塑料离心管中，加入 15 mL1%三氯乙酸溶液和 5 mL 乙腈，超声提取 10 min 后，以 4000 r/min 离心 10 min。上清液经 1%三氯乙酸溶液润湿的滤纸过滤后，用 1%三氯乙酸溶液定容至 25.00 mL，移取 5.00 mL 滤液，加入 5.00 mL 水混匀后做待净化液。 SPE 净化及样品消解： 用 3 mL 甲醇、3 mL 重蒸水水活化阳离子交换固相萃取柱，移取 3.00mL 待净化液至固相萃取柱中，用 3 mL 水和 3 mL 甲醇淋洗，弃去淋洗液并将小柱抽至近干后，用 6 mL5%氨化甲醇溶液洗脱，收集洗脱液。固相萃取过程流速不超过 1 mL/min，洗脱液于 50下用氮气吹干，残留物用 5mL 热重蒸水溶解并转移至容样杯中，加入 2.010-3mol/L K2Cr2O7溶液 3.00mL、(1+1) H2SO42.00mL 后，在表9.1 的消解程序下进行消解。表9.1 微波消解程序步骤压强（MPa）时间（min）功率（w）10.3340020.6360031.0380041.210600 样品的测定： 上述消解液于 300下在温控消化炉上排酸 10min，冷却后定容于 50mL 容量瓶，取 5mL调至 pH2.50，并加入 1.010-3mol/L EDTA，定容于 100 mL 容量瓶，在与绘制标准曲线的相同条件下测定即可。 标准曲线的绘制：在设定仪器工作条件下，取不同浓度的Cr3+标准溶液经浓度为0.01 mol/L 1 mol/L的盐酸溶液调至pH2.50后，用pH2.50的盐酸溶液定容为50.00mL，混匀，与510-4mol/L的luminol溶液（pH11.70）及6.010-2mol/L过氧化氢溶液依次进机测定其发光值，根据相对化学发光值与标准溶液浓度绘制的标准曲线如图3.2，可知，Cr3+在一定的浓度范围（5.010-7mol/L1.010-5mol/L）内与其相对化学发光强度有良好的线性关系。11.6 化学发光反应条件的选择510-4mol/L的luminol；鲁米诺溶液的最佳pH为11.70；Cr3+分析试液的最佳测定pH为2.50；6.010-2mol/L 的过氧化氢溶液进行测定；选用K2Cr2O7+ H2SO4体系进行样品的消解；样品的最大消解压力为1.2 MPa；样品的最大消解功率为800W；样品的最长消解时间为10min；K2Cr2O7溶液的浓度为2.010-3mol/L；加入(1+1) H2SO4的体积为2.00mL。11.7 回收率加标回收率实验，样品测得的回收率在 99.5%100.9%之间。表9.2 回收率测定结果样品编号 123456本底值 (g/g m)1.810-21.710-21.810-21.810-21.910-21.910-2测定值 (g/g m)1.0131.0151.0211.0180.0281.026加标量(g/g m)1.0001.0001.0001.0001.0001.000回收率% 99.599.8100.3 100100.9100.712 固相萃取流动注射化学发光法测定奶粉中的三聚氰胺12.1 原理 三聚氰胺可显著抑制鲁米诺-高锰酸钾体系的化学发光强度，建立了流动注射-化学发光快速测定三聚氰胺的方法。用于奶粉中微量三聚氰胺的测定，具有简便、快速、灵敏、准确的显著优点，结果令人满意。12.2 实验仪器离子分析仪流动注射化学发光分析仪石英亚沸高纯水蒸馏器，电热恒温鼓风干燥箱低速台式离心机氮吹仪。 12.3 实验试剂三聚氰胺标准品甲醇乙腈鲁米诺 高锰酸钾三氯乙酸氨水碳酸钠氢氧化钠碳酸氢钠盐酸奶粉。12.4 标准溶液的配制0.1mol/L高锰酸钾溶液：称取 1.5803g 高锰酸钾，定容于 100 mL 容量瓶中，用时稀释即可。8.010-3mol/L 三聚氰胺标准储备液、5.010-2mol/L 鲁米诺储备液、1%三氯乙酸溶液、5%氨化甲醇溶液的配制同0.1mol/L高锰酸钾溶液。所有玻璃器皿用5%的硝酸浸泡5h以上，用去离子水和石英亚沸重蒸水洗净后投入使用。12.5 奶粉样品的前处理及测定 提取样品：称取2 g（精确至0.0001 g）乳粉试样于50 mL具塞塑料离心管中，加入15 mL1%三氯乙酸溶液和 5 mL 乙腈，超声提取10 min后，以4000 r/min 离心10 min。上清液经 1%三氯乙酸溶液润湿的滤纸过滤后，用 1%三氯乙酸溶液定容至25.00 mL，移取 5.00 mL 滤液，加入5.00 mL 水混匀后做待净化液。SPE 净化：用3 mL甲醇、3 mL重蒸水水活化阳离子交换固相萃取柱，移取3.00mL待净化液至固相萃取柱中，用3 mL水和3 mL甲醇淋洗，弃去淋洗液并将小柱抽至近干后，用6 mL5%氨化甲醇溶液洗脱，收集洗脱液。固相萃取过程流速不超过1 mL/min，洗脱液于 50下用氮气吹干，残留物用热重蒸水溶解，并调 pH 至 2.50，冷至室温后定容于50 mL容量瓶，此为样品待测液，供流动注射化学发光仪测定。标准曲线的绘制：在设定工作条件下，不同浓度的三聚氰胺标准溶液经浓度为0.01 mol/L 1 mol/L 的盐酸溶液调至 pH2.50 后，用 pH2.50 的盐酸溶液定容为50.00mL，混匀，与 610-4mol/L 鲁米诺溶液（pH12.50）及 110-5mol/L 高锰酸钾溶液依次进机测定其发光值，根据相对化学发光值与标准溶液浓度绘制的标准曲线。样品的测定：市售奶粉样品经过提取、净化，用盐酸调节pH至2.50后，用pH2.50的盐酸溶液定容为50.00mL，混匀，在与绘制标准曲线的相同条件下测定即可。 实验方法： 按图 4.2 所示安装好管道，启动仪器，在设定的工作参数下预热和走基线，待基线稳定后，注入待测定溶液，进行化学发光强度测定，以相对峰高定量。12.6 化学发光反应条件的选择鲁米诺的pH值为12.50试液pH 2.50，高锰酸钾浓度210-5mol/L，鲁米诺浓度 610-4mol/L；高锰酸钾溶液的浓度为 110-5mol/L；三聚氰胺分析液的最佳 pH 值为2.50。12.7 回收率 以市售奶粉品牌一为样品，进行加标回收率实验，结果如表10.1所示。由此可知，样品测得的回收率在 96.1%102.2%之间。表10.1 回收率测定结果样品编号 1 2 3 4 5 6本底值(g/g m) 1.510-2 1.510-2 1.610-2 1.510-2 1.510-2 1.510-2测定值(g/g m) 1.028 1.006 1.009 1.001 0.977 1.037加标量(g/g m) 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000回收率% 101.3 99.1 99.3 98.6 96.1 102.213 三聚氰胺的ELISA检测13.1 原理 戊二醛法将三聚氰胺(Melamine)与载体蛋白进行偶联制备免疫抗原Melamine-BSA及包被抗原Melamine-OVA。对人工合成抗原进行紫外扫描,其紫外扫描谱图与载体蛋白及三聚氰胺的图谱有明显的差异,初步显示载体蛋白与三聚氰胺偶联成功。进一步分析Melamine-BSA中Melamine与BSA的摩尔比,复合物中三聚氰胺与BSA的摩尔比为8156B1。用免疫抗原Melamine-BSA腹腔免疫BALB/c小白鼠,获得抗三聚氰胺的多克隆抗体,间接非竞争ELISA分析所得抗血清的效价达10000以上。间接竞争ELISA显示所制备的抗血清能有效识别三聚氰胺,与氰脲酸、三聚氰酸酰胺、三聚氰酸二酰胺无交叉反应。利用自制抗体建立牛奶中三聚氰胺的间接竞争ELISA检测方法,对奶样作0.1Lg/mL, 1Lg/mL, 10Lg/mL, 100Lg/mL, 500Lg/mL和1000Lg/mL六个加标浓度的回收率在70.30% 113.59%。13.2 材料仪器材料与试剂：40孔酶标板;三聚氰胺标准品;戊二醛(浓度为75% );牛血清白蛋白(BSA)和卵清白蛋白(OV);弗氏完全和非完全佐剂,;卡介苗;羊抗小鼠Ig。 主要仪器：UV-265FW分光光度计ZFQ-85A型酶联免疫检测仪。 实验动物： BALB/c小白鼠,健康雄性, 4周龄, 20g左右。13.3 试验方法 （1）抗原的合成： 50mg BSA溶于5mL PBS ( 0.01mol/L、pH714磷酸缓冲溶液生理盐水)中, 5mg三聚氰胺溶于10mL甲醇中。将5mL GA (浓度稀释到25% )溶液和三聚氰胺溶液同时缓慢边搅拌边滴加至BSA溶液中,室温搅拌反应24h, 4000r/min离心5min,上清以PBS于4透析3d,即得三聚氰胺-BSA复合物。 （2）抗原的紫外扫描分析： 将BSA、三聚氰胺以及它们的复合物适当稀释后, BSA和复合物物以PBS为空白、三聚氰胺以甲醇为空白,在190nm 500nm波长范围内扫描,分析扫描图谱。 （3）复合物中三聚氰胺与载体蛋白的摩尔比分析： 取一定量的复合物溶于PBS, 280nm处测吸光值,计算BSA的摩尔数;同时取定量的复合物溶于甲醇中, 205nm (三聚氰胺的特征吸收波长)处测吸光值,计算三聚氰胺的摩尔数,然后计算复合物中BSA与三聚氰胺的摩尔比。 （4）抗血清的制备 免疫方法: BALB/c小白鼠先饲养、观察一周,无异样,断尾采血,制备阴性血清,与抗原三聚氰胺-BSA进行琼脂双向扩散,未出现沉淀带。然后,腹腔注射卡介苗刺激小鼠免疫系统, 1周后,分别于第1、15、30和45d各腹腔注射抗原一次,每次用量011mL (抗原浓度6181mg/mL)。第一次注射时,抗原和等量的完全弗氏佐剂混合均匀,以后各次均和等量的非完全弗氏佐剂混合; 抗血清的分离:从注射抗原后的第15d开始,每隔7d断尾采血样,血样于室温放置23h凝血,然后4过夜, 3000r/min离心5min,取血清,测效价,分装后-20e保存备用。 （5）间接非竞争ELISA测抗血清效价： 抗原包被:用011mol/L pH9.5的碳酸盐缓冲溶液稀释三聚氰胺-OV复合物(三聚氰胺-OV是三聚氰胺与卵清白蛋白的复合物,制法同三聚氰胺-BSA)至10Lg/mL,每孔100uL包被40孔微孔, 4过夜至恢复至室温,倾去包被液, PBST (0105% Tween20pH712 0.1mol/L磷酸缓冲溶液生理盐水)满孔洗涤三次,每次5min,扣干; 封阻:每孔200LL 5%脱脂奶(溶于PBST), 37保温保湿2h至恢复至室温,倾去封阻液, PBST满孔洗涤3次,每次5min,扣干; 抗原抗体反应:每孔加入100uL以PBST倍比稀释的抗血清和阴性血清,同时以PBST代替血清作为空白对照, 37保温保湿2h至PBST洗涤扣干3次; 酶标二抗与抗体抗原复合物反应:每孔100uL的羊抗鼠IgG: HRP酶标二抗(以PBST作1B1000稀释), 37保温保湿1h至PBST洗涤扣干5次; 底物显色反应:每孔加反应底物100uL(40mg邻苯二胺溶100mL pH510 0.1mol/L的柠檬酸)0.2mol/L磷酸氢二钠缓冲溶液,再加入150uLH2O2,现配现用),37避光反应30min,每孔50LL 2mol/LH2SO4终止反应, 5min后以空白对照孔调零, 490nm测吸光值。以抗血清的吸光值两倍于阴性血清的吸光值时,抗血清的最大稀释倍数作为抗血清的效价。 （6）抗血清特异性分析：抗原包被、封阻、酶标二抗与抗体抗原复合物反应及底物显色反应操作均同（5）,不同之处是在第三步抗原抗体反应中,每孔加倍比稀释的竞争抗原10uL (参试抗原分别为氰脲酸、三聚氰酸酰胺、三聚氰酸二酰胺、三聚氰胺),同时加入以PBST适当稀释的抗血清90uL混匀,37保温保湿1h。设置空白对照及阳性对照,空白对照以100uL的PBST代替90uL抗体+10uL的竞争抗原;阳性对照为100ul的抗体,不加竞争抗原。竞争抑制率(% ) =有竞争抗原孔的OD490值/阳性对照孔OD490值100竞争抑制率超过10%即初步表明该血清有特异性反应。 （7）牛奶中三聚氰胺的加标回收： 将不同浓度的三聚氰胺标准品添加到不含三聚氰胺的牛奶样中,使样品中的三聚氰胺含量分别为0.1ug/mL, 1ug/mL, 10ug/mL, 100ug/mL, 500Lg/mL和1000Lg/mL,然后利用自制抗体间接竞争ELISA分析三聚氰胺含量,计算其回收率。13.4 牛奶中三聚氰胺的ELISA加标回收将不同浓度的标准三聚氰胺添加到不含三聚氰胺的奶样中,间接竞争ELISA分析三聚氰胺含量以研究其回收率,每个浓度重复6次,结果如表11.1。表11.1 三聚氰胺加标回收实验的测定结果编号 0.1ug/mL 1ug/mL 10ug/mL 100ug/mL 500ug/mL 1000ug/mL 1 70.30 84.26 101.40 75.50 103.20 100.39 2 89.26 96.50 97.39 100.49 99.43 99.45 3 88.02 88.98 94.96 83.71 98.60 90.06 4 95.82 90.46 90.38 91.39 92.94 89.08 5 90.33 89.26 86.46 72.86 113.59 87.15 6 87.79 80.05 90.08 87.60 106.90 90.08 X 86.92 88.25 93.45 85.26 102.44 92.70CV 9.96 6.36 3.22 12.02 6.80