免疫组化流程

石蜡切片免疫组化流程、实验器材及试剂1、实验器材名称厂家型号脱水机武汉俊杰电子有限公司JJ-12J包埋机武汉俊杰电子有限公司JB-P5病理切片机上海徕卡仪器有限公司RM2016冻台武汉俊杰电子有限公司JB-L5组织摊片机浙江省金华市科迪仪器设备有限公司KD-P烤箱上海慧泰仪器制造有限公司DHG-9140A载玻片江苏世泰实验器材有限公司盖玻片江苏世泰实验器材有限公司10212432C微波炉格兰仕微波炉电器有限公司P70D20TL-P4移液枪DragonKE0003087/KA0056573组化笔Gene techGT1001显微镜CICXSP-C2042、主要实验试剂试剂厂家货号稀释比无水乙醇国药集团化学试剂有限公司二甲苯柠檬酸（PH6.0）抗原修复液国药集团化学试剂有限公司福州迈新生物技术有限公司苏木素Sigma041M0014V中性树胶上海标本模型一抗：CD31arigobioARG527481:50二抗：山羊抗兔二抗组化试剂盒DAB显色剂福州迈新KIT9707北京中衫金桥生物技术有限 公司二、石蜡切片免疫组化实验步骤1、石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯I 15min-二甲苯II 15min-二甲苯III 15min- 无水乙醇I 5min-无水乙醇II5min-85%酒精5min-75%酒精5min-蒸馏水洗。2、抗原修复：组织切片置于盛满柠檬酸抗原修复缓冲液(PH6.0)的修复盒中于微波炉内 进行抗原修复，中火8min至沸，停火8min保温再转中低火7min，此过程中应防止缓 冲液过度蒸发，切勿干片。自然冷却后将玻片置于PBS (PH7.4)中在脱色摇床上晃动 洗涤3次，每次5min。3、阻断内源性过氧化物酶：切片放入3%双氧水溶液，室温避光孵育25 min，将玻片置于 PBS (PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。4、血清封闭:在组化圈内滴加3%BSA均匀覆盖组织，室温封闭30min。(一抗是山羊来 源的用兔血清封闭，其他来源的用BSA封闭)5、加一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒 内4C孵育过夜。(湿盒内加少量水防止抗体蒸发)6、加二抗：玻片置于PBS (PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩 干后在圈内滴加与一抗相应种属的二抗(HRP标记)覆盖组织，室温孵育50min。7、DAB显色：玻片置于PBS (PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍 甩干后在圈内滴加新鲜配制的DAB显色液，显微镜下控制显色时间，阳性为棕黄色， 自来水冲洗切片终止显色。8、复染细胞核：苏木素复染3min左右，自来水洗，苏木素分化液分化数秒，自来水冲洗， 苏木素返蓝液返蓝，流水冲洗。9、脱水封片：将切片依次放入75%酒精5min-85%酒精5min -无水乙醇I 5min -无水乙醇 II5min -二甲苯I 5min中脱水透明，将切片从二甲苯拿出来稍晾干，中性树胶封片。10、显微镜镜检，图像采集分析。三、石蜡切片免疫组化结果判读苏木素染细胞核为蓝色，DAB显出的阳性表达为棕黄色