硫酸软骨素总述

硫酸软骨素一、产品简介:硫酸软骨素是来自动物软骨组织的一类天然的酸性粘多糖（因其 具有粘稠性）糖胺聚糖（其中糖胺聚糖作为动物蛋白聚糖的代表 成分，在软骨组织中以蛋白多糖形式存在），不同动物体内所存在的 硫酸软骨素类型不同，主要是 CAS、CSC 及各种硫酸软骨素的混合 物，其中猪牛羊的骨中主要含有硫酸软骨素A,鲨鱼乌贼等海洋动物 的软骨中主要含有硫酸软骨素C。区别：蛋白多糖以蛋白为核心，糖蛋白以多糖为主体;或者说侧 重点不同，虽然组成成分是一样的，但是糖蛋白定义为蛋白,蛋白聚 糖定义为糖。糖胺聚糖： 1）蛋白聚糖由三部分组成-核心蛋白、糖胺聚糖、 连接区寡糖； 2）糖胺聚糖除了通过共价键与蛋白聚糖的核心蛋白连 接（糖肽键）外，糖胺聚糖还通过静电作用或立体化学效应与其他蛋 白质发生专一性程度不同的结合。而蛋白多糖的聚集体则通过次级键（氢键和盐键）形成，可见从软骨组织中提取硫酸软骨素仅依靠破坏 次级键的方法是不够的，而必须以降解蛋白质的方法，破坏多糖链与 蛋白的共价结合方能达到提取硫酸软骨素的目的；3）因为糖胺聚糖 具有粘稠性，所以蛋白聚糖也被称为粘蛋白。软骨中粘蛋白等中的糖 胺聚糖多由两种氨基己糖（氨基葡萄糖和氨基半乳糖）之一和两种己 糖醛酸（葡萄糖醛酸和艾杜糖醛酸）之一以各种糖苷键连接而成； 4） 除透明质酸（属于非蛋白多糖提取）外，糖胺聚糖分子中的氨基己糖 上均含有硫酸基，该硫酸基与己糖醛酸上的羧酸都会导致整个蛋白聚 糖分子显酸性，所以糖胺聚糖又被称为酸性粘多糖。二、理化性质:1、物理性质：硫酸软骨素，简称CS,分子式：（C14H21NO14S）,成品外观白色142114 n粉末状，无臭无味，易溶于水，不溶于乙醇和丙酮、冰醋酸等有机溶 剂，遇水后迅速膨胀，对热不稳定，需避光密封保存。其分子中含有大量的硫酸基和羧基，故呈酸性反应，可与钠钾钙 离子结合成盐，其盐类对热稳定。在高温、碱性、酸性环境溶液中易 水解成单糖或小分子量多糖，因而溶液粘度下降。（游离的硫酸软骨 素水溶液遇较高温不稳定，主要是乙酰基被水解，从其结构上脱落下 来。）2、化学性质： 硫酸软骨素是来自动物软骨组织的一类天然的酸性粘多糖 糖胺聚糖。硫酸软骨素是氨基己糖和葡萄糖醛酸交替连接而成的直链 分子，作为动物糖胺聚糖中的代表物质，硫酸软骨素由D-葡萄糖醛 酸和N-乙酰-D-氨基半乳糖（结构图如下所示）以1,3糖苷键连接形 成双糖，双糖单位之间以 1,4 糖苷键连接。一般硫酸软骨素约含有 50-70个双糖单位，动物组织中的硫酸软骨素平均分子量约为260000。 在分子结构上硫酸软骨素氨基己糖环的4 位或6 位可硫酸化。另子式 CeH1QOT图1OH OH OOH OH葡萄糖GkAGkNAc图2ff-=j：-图5注：乙酰不是一种物质，它是一种基团，或者说是官能团，是乙酸去掉羟基后 剩下的部分，写为-COCH3。硫酸软骨素常见化学反应有降解反应，硫酸软骨素不仅在高温强 酸条件下易发生降解反应，使其分子量降低，同时在硫酸软骨素裂解 酶等的作用下也可发生降解。其中硫酸软骨素可被浓硫酸降解成小分 子组分，并被硫酸化，降解的程度和硫酸化的程度随着温度的升高而增加，在30C-5OC温度下,2h可使平均分子量降至3000-4000；也可在稀盐酸溶液中水解而成为小分子产物，温度越高水解速率越快。硫酸软骨素是一种聚阴离子的高分子化合物，多数含有-so3h和根据糖胺聚糖双糖中单糖分子类型、羧基和硫酸基位置的不同，可将其分为透明质酸、硫酸软骨素A、硫酸软骨素C等几类。其中透明质酸又称玻璃酸,组成单糖为D-葡萄糖醛酸和N-乙酰氨基葡萄糖;硫酸软骨素A组成单糖为D-葡萄糖醛酸和N-乙酰-D-半乳糖-4-硫酸;硫酸软骨素C组成单糖为D-葡萄糖醛酸和N-乙酰-D-半乳糖-6-硫酸;由此可见透明质酸为糖胺聚糖中唯一的非硫酸化多糖,其他糖胺聚糖的硫酸化位置和数量与其生理功能密切相关。三、分离提纯原理及方法简介: 1、制备原理硫酸软骨素属于酸性粘多糖，目前酸性粘多糖的提取方法主要有 降解法和非降解法。非降解法仅用于非蛋白多糖的粘多糖 -透明质 酸。降解法适用于包括透明质酸在内的所有酸性粘多糖，其主要包括 碱盐法、碱提取法、酶提取法、超声波法等。1）碱提取法：是基于硫酸软骨素与蛋白质结合的O-糖苷键可在碱作用下发生消去反应，使糖肽键断裂，硫酸软骨素从蛋白多糖中释放出来，但在强碱作用下硫酸软骨素也易发生降解。2）盐法提取：基于一定离子强度下软骨中的某些蛋白质会产生 沉淀，从而实现硫酸软骨素与蛋白质分离的目的。3）碱盐法：利用碱性条件下，连接硫酸软骨素和蛋白质的糖肽键发生断裂，使硫酸软骨素以游离态释放，并且通过控制一定的离子强度，使软骨中的某些蛋白质沉淀析出，便于滤除。一定范围内，提取物中硫酸软骨素的含量和得率是随着碱液浓度的增加而提高。4）超声辅助法：是利用超声波的空化作用，使物料周围形成空 穴，从而有利于硫酸软骨素提取的方法。原理是在碱性条件下蛋白质 易离解和超声波的热学机制可促进蛋白质快速解离而达到去杂蛋白 质的目的，升温（85-90C ）均可使解离的蛋白质变性吸附到白陶土 上，从而使硫酸软骨素与蛋白质分离，提高产品质量。采用超声辅助 的碱提酶解法提取硫酸软骨素，其提取物中硫酸软骨素的含量和得率 并无明显提高，但可大大缩短提取时间。5）酶法：软骨中的胶原蛋白和粘蛋白等在中性或弱酸性条件下是可溶的，不易被分离除去。酶法是利用不同蛋白酶水解蛋白质的特异性，使蛋白质水解成氨基酸，再利用硫酸软骨素与氨基酸的溶解性不同将其提取出来的方法。酶法条件温和，不易引起硫酸软骨素的降解，常用的酶制剂有胰酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和链霉菌蛋白酶等 提取物含氮量越低，表明提取物中的杂质蛋白含量越少。2、纯化方法溶剂法：是利用软骨中不同化学成分的溶解性差异，而将硫酸软 骨素与其它杂质相互分离的纯化方法。硫酸软骨素含有的硫酸基、羧 基和羟基等亲水性基团，使其易溶于水，不溶于乙醇、甲醇、丙醇和丙酮等有机溶剂。超滤膜法：是利用滤膜孔径的不同使硫酸软骨素与其它非多糖类杂质分离，而得到分子量范围较窄且纯度较高的硫酸软骨素的方法。季铵盐沉淀法：硫酸软骨素在溶液中以聚阴离子形式存在，与季 铵盐类化合物形成水溶性很小的季铵盐络合物，这些络合物在低离子 强度的水溶液中不溶解，但当其增大到临界离子强度时，可发生解离 并溶解，利用该性质可使硫酸软骨素得到分离纯化。离子交换色谱法：是依靠库仑力的作用将物质吸附在交换剂上, 然后选用合适的洗脱剂进行洗脱，达到其纯化的目的。常用于硫酸软 骨素纯化阴离子交换剂有树脂、纤维素和葡聚糖凝胶等。电泳法：根据化合物所带电荷类型和数量的不同，采用电泳法可 将硫酸软骨素和其他杂质分离开。电泳法具有分辨率、目标纯度和回 收率较高的特点。四、酶法制作工艺实验流程：劄鱼头訂一枕骨粉一一如入堆形瓶八 放入攜床忸湍反应 一 中K肢蛋门幅、木恐蕴门幅一落液 时劇调phjjhrJrifVj -反応完全:后况活一澗卩口fi为屮忸 -离心取沽枚 乙巒沉淀一龄磴过枚一离心取沉淀一卡嫌 称虫 -袒粗皿一质冷分桁 一1、具体提取方法：章闩喷香分析帑j罚祉醉瘦擒分析捉取率分析脂脑、水井、pIH自薄足从鲟鱼头中取出软骨，洗净，切成小块，置于大烧杯中100C水 浴加热12h,中途换水两次以除去表层油脂，冷却后漂洗，沥干水后 送入60C干燥箱干燥约5h，干燥完全后粉碎得到软骨粉。称取一定量软骨粉，根据一定的固液比加蒸馏水溶解酶，放入摇 床恒温反应，反应时间中间时刻调加入胃蛋白酶直至反应完全。反应 液水浴加热进行酶灭活处理，冷却后调至中性，离心取清夜，并加入 清液体积的两倍乙醇进行沉淀， 边加入乙醇边搅拌， 放入冰箱静置 24h,离心取沉淀，沉淀送入50C干燥箱干燥约3h,得硫酸软骨素粗 品。酶反应温度过高会引起酶失活，温度过低酶活性不高，木瓜蛋白酶最适温度50C60C，胃蛋白酶不耐低温，胰蛋白酶最适温度为 45C .本实验综合三种酶最适温度，设定反应温度为38C，故温度不 作为单因素考虑。1）酶浓度因素：酶浓度不同，其他因素相同，随着酶浓度的提 高，粗品提取率随之升高，但酶浓度升高到一定值（15mg/g）,提取率 不再增大。2）时间因素：反应时间不同，其他因素相同，随着反应时间的 增长，粗品提取率随之升高，但反应时间超过50h，提取率虽然有所 增长，但增长空间不大。另外，提取时间过长，得到的产品颜色加深， 提取时间应以软骨全部溶解为准。3）固液比因素： 固液比不同，其他因素相同，随着固液比的增高，粗品提取率随之升高，但固液比升高到一定值（1:12），提取率不再增大。原理：硫酸软骨素分子具有很高的吸湿性，因为其中的硫酸软 骨素分子是以多聚阴离子的形式存在的羧基和硫酸基可吸附带正电 荷的水分子，吸附相当于自身重量的数百倍的水分。在反应体系中， 大部分水分子和硫酸软骨素因静电作用结合，并非游离态，因此反应 溶液的粘度大，结合酶动力学说，底物分子与酶分子的碰撞概率减小， 反应速率低。故高固液比，可使溶液变稀，降低溶液的粘度，从而提 高提取率。2、硫酸软骨素各项指标测定方法1）葡萄糖醛酸含量测定采用咔唑比色法，绘制葡萄糖醛酸标准曲线2）样品纯度测定采用咔唑比色法，绘制硫酸软骨素标准曲线3）蛋白质的标定取不同浓度牛血清白蛋白，采用考马斯亮蓝法，测其595nm处吸光度，绘制标准曲线。4）脂肪含量测定依据GB50009.6-85，索氏抽提法测定硫酸软骨素中脂肪含量。5）PH测定五、综述1、原料中除含有蛋白多糖外，还有大量的蛋白质、无机盐、脂肪、 结缔组织及残留的肌肉。为了提高硫酸软骨素的纯度，首先应尽量去 除软骨上的肌肉、脂肪、结缔组织；其次，应将软骨尽量粉碎，以提 高提取率和降低浸提时间；另外，硫酸软骨素的提取率和纯度高低与 所采用的原料部位有关。2、酶法反应条件温和，操作简单，不会引起硫酸软骨素的降解 固液比越高，得率越高，最后达到平衡。但快速反应也可能使反应体 系升温，弓I起蛋白质和粘多糖的分解并产生副反应，产品颜色加深， 不符合质量要求，因此注意放入恒温箱反应。同时提取时间过长也会 使产品颜色加深，应以软骨全部溶解为准。乙醇量选择为清夜体积的 2倍，在进行除杂质等的处理时因浓度高造成较大的损失，溶剂量大 使成本增加。3、在制备硫酸软骨素时，由于是粗提工艺，得到的是硫酸软骨 素同分异构体（对映异构体属于同分异构体的一种）的混合物,如果 想得到高纯度的各个组分，需要进一步分离制备，并进行分子结构的 定性检验。