猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型和猪瘟病毒混合感染的诊断与防制分析

猪繁殖与呼吸综合征、圆环病毒2型和猪瘟病毒的 混合感染的诊断与防制分析 夏伟1、2 李鹏1 危艳武3 张宇辉2 罗玉均2 冯春复21、 黑龙江八一农垦大学 黑龙江 大庆 163319 2、哈尔滨维科生物技术开发公司 黑龙江 哈尔滨 150001 3、中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 猪传染病研究室 哈尔滨150001摘要:12月，南方某大型猪场爆发以母猪流产，死胎，弱仔，哺乳期仔猪发生体温升高，皮肤发绀，呼吸衰竭，顽固性腹泻；保育仔猪发热，聚堆，皮肤红，昏睡，腹股沟淋巴结肿大为重要症状的疾病，死淘率高。剖杀3头发病哺乳仔猪，3头死亡保育猪取淋巴结、脾、肺脏病变组织用PCR，RT-PCR措施分别检测猪繁殖与呼吸综合征病毒，圆环病毒2型，猪瘟野毒为阳性，结合本病的临床症状和病理剖检确诊为猪繁殖与呼吸综合征，圆环病毒2型，猪瘟的混合感染。核心词:猪繁殖与呼吸综合征病毒；圆环病毒2型；猪瘟病毒；混合感染；诊断猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是世界范畴内一种重要的猪传染病,1996年哈尔滨兽医研究所郭宝清初次证明国内有PRRS存在1，并从繁殖障碍猪群分离到PRRSV2。近几年对国内发病猪群的血清检测成果表白，该病现已存在于国内大部分地区3，并且呈爆发式流行，给养猪业导致了极大的经济损失。特别自“猪高热病”流行后，据有关研究表白，猪繁殖与呼吸综合征变异毒株是由一般猪繁殖与呼吸综合征病毒的NSP2段基因发生了缺失变异而来，其临床症状重要是浮现“三高一低”即高热（40 以上）、高发病率、高死亡率、低治愈率；猪群浮现皮肤发红，个别有神经症状，能导致母猪流产甚至死亡，给养猪业的发展带来重创。猪圆环病毒2型（PCV2)感染已经是威胁目前世界养猪业的一种重要疾病，1991 年PMWS 初次在加拿大被发现，目前已证明呈世界性流行。PCV2 感染引起的有关疾病在国内的流行状况也十分严重， 给养猪业导致巨大的经济损失4,5。国内学者在国内许多地方都分离出了这种病毒,且和其她病毒混合感染的状况日益明显，PCV-2感染病例在临床上常常可见。猪瘟(CSF)是由猪瘟病毒(CSFV)引起的一种高致死性、烈性传染病。近几年随着国内规模化养猪业的发展,猪瘟的发生浮现某些新特点,体现为发病年龄小、散发流行、混合感染以及非典型性或隐性等特点6，这又给本病的防治带来了很大的困难。生产实践中，PRRSV、PCV-2混合感染7，PRRSV、CSFV混合感染8，CSFV、PCV2混合感染9最为常用。本实验应用PCR，RT-CR措施结合临床症状和病理剖检对上海某猪场猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV），圆环病毒型（PCV2)，猪瘟病毒（CSFV）混合感染进行了确诊,从而为猪场防制本病，制定合理的免疫程序提供科学根据。1 材料与措施1.1病料来源来自上海某猪场的6份发病猪和死亡猪的肺脏、脾脏、淋巴结等脏器，编号，3、4、5号为哺乳仔猪，6、7、8号为保育仔猪。冷冻运送，-20保存备用。1.2 酶和其她试剂PCR扩增试剂盒、饱和酚、Taq DNA聚合酶、dNTPs、EB、DEPC、提取总RNA用TRIzol,BioFlux公司产品，Cycle-Pure Kit,OMEGA公司产品。DL Marker，TaKaRa RNA PCRKit(AMV)Ver.3.0购自大连宝生物有限责任公司；其她试剂均为分析纯试剂。1.3引物设计及合成根据GenBank上刊登的PRRSV基因序列(AY032626;AY262352),用Oli-go6.0软件设计引物，上游引物5-AGAACTGTGACAACAACGCTG-3，下游引物： 5-GAGTCGATGATGGCTTGAGCT-3，扩增缺失株（高致病性PRRSV毒株）和非缺失株（典型PRRSV毒株）预期扩增产物长度分别约263bp和350bp。由宝生物工程(大连)有限公司合成。根据已刊登的PCV-2核酸全序列合成了1对特异性的PCR引物。上游引物:5-CAGCAAGAAGAATGGAAGAAGCGGA-3:下游引物:5-CCAGGACTACAATATCCGTGTAACT-3。扩增目的基因片段长为1057bp，引物由宝生物工程(大连)有限公司合成。参照GenBank 中发布的猪瘟病毒（CSFV），石门（shimen）株基因组，设计合成了1对CSFV特异性的引物Csfv-F：5-AAGTAACAGAGACATGAATGG-3Csfv-R：5-CCAAAAGGATAGGTAGGGT-3由宝生物工程(大连)有限公司合成。1.4病料解决及 DNA 的提取 将组织样品称量、研磨，制成匀浆后反复冻融 3 次，取上清液按照常规措施提取样品总 DNA 参照文献101.5RNA的提取及cDNA合成 参照文献111.6PRRSVRT-PCR反映按下列构成配制PCR反映体系25L：RnaseFree ddH2O 10.5L，MgCL2(25mmol/L) 5L，dNTPMixture：2.5L，10One Step RNA PCR buffer2.5L，引物(20pmol/L)F2923 0.5L、R3272 0.5L，AMV Reverse Transcriptase XL 0.5L，AMV-OptimizedTaq0. 5L，Ranse Inhibitor0.5L，模板2L。反映条件为：5030 min，942 min。9430 s，5830 s，7245 s，共40个循环；72延长10 min。1.7PCV-2PCR反映按下列构成配制PCR反映液：10PCR Buffer 1.5L，ddH2O 10.4L，MgCL2(25 mmol/L)1.5L，dNTPs(10 mmol /L)0.3L，Taq DNA聚合酶0.2L，上下游引物(20mol/L)各0.3L，DNA模板0.5L；共15L。将上述反映液加入到PCR反映管中，轻轻混匀。PCR反映条件为：94 5 min；94 30 s、55 30 s、72 45 s，35 个循环；72 10 min。1.8 CSFVRT-PCR反映按下列构成配制PCR反映液：10PCR Buffer 1.5L，ddH2O 10.4L，MgCL2(25 mmol/L)1.5L，dNTPs(10 mmol /L)0.3L，Taq DNA聚合酶0.2L，上下游引物(20mol/L)各0.3L，cDNA模板0.5L；共15L。将上述反映液加入到PCR反映管中，轻轻混匀。反映条件：94预变性12 min；然后9445 s、5545 s、721 min，扩增35个循环；最后72延伸10min。1.9PCR产物鉴定用1%琼脂糖凝胶电泳,紫外检测仪下观测成果，以PCR产物中浮现以PCR产物中浮现263bp，1057 bp，602bp条带的样品为阳性。 2 防制措施2.1对发病较重的猪及时裁减，病死猪深埋解决。流产母猪，同窝发病仔猪进行隔离饲养观测。圈舍及用品彻底消毒。2.2对全群未发病猪用哈兽研牌猪瘟兔化弱毒疫苗（4000RID/头份）进行紧急免疫接种，剂量为2头份/头（配种至妊娠85天母猪不免）。2.3猪瘟疫苗免疫7天后全群未发病猪实行哈兽研牌猪蓝耳病弱毒疫苗（CH-1R株）紧急免疫接种，保育猪2头份，育肥猪、后备猪3头份，种公、母猪3头份（妊娠80天后重胎母猪不免）。待疫情稳定后，种母猪配种后40天免疫蓝耳病灭活疫苗4毫升/次，间隔21天再肌注一次。种公猪一年2次，每次肌注4毫升。此外定期监测公猪精液蓝耳病野毒感染状况，野毒感染的公猪及早裁减。2.4用哈兽研牌猪瘟兔化弱毒疫苗（4000RID/头）对初生仔猪实行超前免疫，剂量为0.5头份/头，50日龄进行第二次免疫2头份。2.5全群种公、母猪，商品猪接种哈兽研牌猪圆环病毒2型灭活疫苗（LG株）2毫升，哺乳仔猪14日龄免疫2毫升，疫情稳定后14日龄免疫1毫升，35日龄1毫升。2.6经实验室诊断后，对该场除采用常规隔离、消毒、抗继发感染，提高饲料营养等综合防制措施外，对未发病猪群进行猪瘟疫苗，蓝耳病弱毒疫苗及圆环病毒2型疫苗紧急免疫接种，使疫情不久得到缓和。3 讨论与分析3.1根据该场临床症状，病理剖检，PCR及RT-PCR技术最后确诊为PRRSV，PCV2，CSFV混合感染。调查其发病因素，我们发现本场11月1日之前猪群生产始终稳定，但是猪场分别在9月下旬，10月下旬从外场引进体重平均100斤左右的后备猪106头，未经隔离直接与本场后备猪混群饲养。外引后备猪最先发病，本场后备猪后发病从体重150斤以上的开始蔓延到初产母猪，而本次疫情初产母猪流产比例很高，也许是疫情发生的因素。3.2 本场过去几年后备猪配种前始终没有进行过蓝耳病疫苗的免疫，也没有采用其她避免措施，配过种的后备猪抗体与否转阳不清晰。与否获得坚实免疫保护不得而知。后备猪与外引猪，后备猪与经产母猪等不同猪群混群恰恰增长PRRSV交叉感染的机会。如果母猪接种疫苗前就存在PRRSV持续感染，病毒血症。再使用蓝耳弱毒疫苗采用“一刀切免疫”，就会增长母猪发病的风险，近来几年有关给妊娠后期母猪接种蓝耳病活疫苗导致猪群发病的病例屡见不鲜。因此笔者建议待猪群稳定后给种猪群接种蓝耳病灭活疫苗，更安全，3-4周龄健康仔猪接种蓝耳病活疫苗，可有效减少仔猪水平感染发病的风险。3.3 检测6头仔猪中，3头哺乳仔猪日龄均在10日龄以内。检测出PRRSV可见母猪通过胎盘垂直感染的也许性最大。经胎盘垂直感染新生仔猪，导致新生仔猪肺脏，脾脏等器官受损严重12。因此要高度注重猪场种猪群选留和免疫。3.4 临床上浮现一定比例哺乳仔猪、保育仔猪肌肉震颤，并伴有一定比例死亡，活下来的猪到保育阶段仍有肌肉震颤现象，通过诊断为猪瘟野毒感染（2/6)，本场尽管免疫了猪瘟疫苗但浮现免疫失败，笔者觉得也许有两个因素：一是本场是蓝耳病，圆环病毒阳性场，PRRSV，PCV2持续感染，导致猪免疫克制，影响疫苗效果。二是本场始终采用猪瘟普免的方式来免疫疫苗，一年3次免疫，如果不定期监测猪瘟抗体水平，依托经验无法判断猪群的免疫水平。3.5 从本场检测成果（3/6)，PCV2感染阳性率相称高，特别是保育仔猪阶段最严重，阐明这个病毒在猪群中普遍存在和流行。带毒猪长期排毒，威胁其她猪的健康，单一感染猪缺少典型的临床症状与病理变化，与PRRSV共同感染能引起仔猪断奶后多系统消耗性综合征，体现为淋巴组织肿大、出血，肉芽肿性炎症，坏死性肝炎，仔猪消瘦、生长缓慢等特性性病变；混合感染能加重PRRSV对仔猪引起的间质性肺炎的严重限度13，此外学者研究表白PCV-2的感染会对猪的免疫系统导致损害从而克制猪瘟疫苗的免疫效果14。而应用PCV2疫苗是避免圆环病毒2型感染，减少免疫克制的重要手段之一，哈尔滨兽医研究所刘长明15对国内部分猪场研究表白疫苗接种猪群与空白对照组对比，免疫母猪成果显示，出生时死胎率下降了2.3%，初生仔猪成活率提高了7.6%，断奶时成活率提高了7.5%，积极免疫仔猪，保育阶段猪发病率下降了15.1%，死淘率下降了3.6%。并且猪场药物保健费用明显下降，提高了饲料转化率。这与疫苗免疫后机体产生能中和野毒的高水平抗体有关。4 综上所述： 诊断成果表白本次疫情的确由PRRSV感染所致，PCV2和CSFV感染加重了疫情,其重要因素是猪场从外地频繁引种有关,因此猪场引种过程要谨慎。由于PRRSV抗原具有多样性,个体和群体可水平持续感染,使防治变得较为困难,世界各国都制定了某些防治措施,重要是避免病毒的侵入和扩散,如严禁从疫区引种、裁减感染猪群、限制带毒猪的移动等措施。在目前,采用全进全出的饲养制度,改善饲料营养和猪舍环境,减少猪群应激,疫苗合理免疫是避免该病爆发的可行措施。从检测成果看猪场要避免疫情的再次爆发,猪场必须注重猪蓝耳病、猪瘟和猪圆环病的避免和监测16。 参 考 文 献1郭宝清，陈章水，刘文兴，等.应用间接免疫荧光法从国内生殖障碍综合征猪群中检出生殖与呼吸综合征病J.中国兽医科技，1996,26（3）;3-5.2郭宝清，陈章水，刘文兴，等.从疑似PRRS流产胎儿分离PRRSV的研究J.中国畜禽传染病，1996.18（2）:1-4.3李华，杨汉春，张晓梅，等. 猪血液和淋巴组织中淋巴细胞亚群表型分布J. 农业生物技术学报，(1)：834-838.4Chae C. 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