细胞培养技术第一讲.ppt

大连大学医学院 郑丛龙,细胞培养技术,绪 论,细胞培养技术,这是一个真核细胞模型 Can you describe it?,绪 论,细胞培养的基本概念 细胞培养的发展简史 细胞培养的优缺点 细胞培养的应用领域,绪论,细胞培养（cell culture),细胞培养技术是选用各种细胞的最佳生存条件对活细胞进行体外培养和研究的技术。 即：从活体中取出小块组织分离出细胞，在一定条件下进行培养，使之能继续生存、生长、增殖的一种方法。,体 外 培 养 种 类,细胞培养可分为群体培养和克隆培养两种。 群体培养（mass culture）：即将大量细胞置于培养瓶中，让其贴壁或悬浮生长，形成均匀的单层细胞或单细胞悬液。 克隆培养（clone culture）：即将少数细胞加入培养瓶中，贴壁后彼此间隔距离较远，经过繁殖每一个细胞形成一个集落，称为克隆。,绪论,群体培养（左）和克隆培养（右）,原代培养第4天，成纤维样细胞散布于培养瓶底，个别集落形成，细胞围绕中心漩涡状排列100,原代培养第7天，多个集落形成并融合100,组织培养常用术语,原代培养（primary culture）：从直接取自生物体细胞、组织或器官开始的培养。 传代培养（passage culture）：将细胞以一个培养瓶转移或移植到另一个培养瓶即称为传代培养。 注：传代（passage，subculture）,细胞系（cell line）：原代培养经首次传代成功后即成细胞系，由原先存在于原代培养物中的细胞世系所组成。 细胞株（cell strain）：通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得的特殊性质或标志，并能稳定保持这些特性的培养物。 克隆（clone）：指单个细胞通过有丝分裂所产生的遗传性状相同的细胞群体。,术语,细胞周期（cell cycle)：从上一次分裂结束至下一次分裂终了结束经历的时相过程，由分裂间期和分裂期构成。 二倍体细胞系或株（diploid cell line or strain)： 具有二倍体核型的细胞系或株。 有限细胞系或株：指仅能有限传代次数，通常50代左右，然后衰亡。 无限细胞系或株：具有无限增值能力的细胞系或株。 细胞凋亡：指体内外因素触发导致的程序性细胞自杀死亡。,术语,干细胞（stem cell）：指体内未分化的具有继续分化潜能的细胞。 细胞接触抑制（cantact inhibition）：贴壁生长的正常细胞一旦汇合、相互接触后变停止分裂。 细胞杂交（cell hebridization）：指2个或多个细胞融合导致一个多核细胞。,术语,有分化特性的细胞系和细胞株,细胞培养的发展简史,德国人Roux（1885）用温生理盐水体外培养鸡胚组织神经板并存活数天，被认为是组织培养的萌芽试验。 1903年Jolly用盖片悬滴培养法，培养蝾螈白细胞生活一月，提示组织或细胞离体后，在人工培养条件下，仍能生存。,1907年Harrison创建了“哈里森悬滴培养法”，将蛙胚原始脊髓节段，移到事先滴有从成体蛙淋巴囊吸取的新鲜淋巴的盖玻片上，淋巴很快凝固，使组织小块固定在一定的位置上。然后将盖玻片倒置于一块中央凹陷的厚载玻片上，盖玻片的周缘用蜡封固。蛙胚神经组织存活了数周，由此建立了体外培养组织和细胞的基本模式系统。,1923年，Carrel设计了卡式瓶培养法，扩大了组织的生存空间。,组织培养发展示意图,美国学者Lewis WH等人工合成培养基代替血浆和胚胎提取液等天然培养液的培养方法。 1957年Dulbecco 等采用胰蛋白酶消化处理和应用液体培养基的方法，获得了的单层细胞培养，单层培养成了组织培养普遍应用的技术。促进了细胞系(cell line)的建立。 近年各种条件已商品化系列化，应用冷冻技术，各国建立细胞库,发展简史,我国组织培养的发展,20世纪30年代传入我国。 20世纪50年代起步。 20世纪70年代，成为医学和生物学研究中普遍应用的手段。,细胞培养的优点,1、活细胞： 能长时间、直接观察、研究活细胞的形态、结构、生命活动。 2、可控制：,选择对象：均一性、重复性（类型、性质、阶段）,调节条件：各种因素（物理、化学、生物等因素）,利用方法：研究技术、记录方法,3、应用广： 领域多：医学研究、生物技术、基因工程等 对象广：各种动物（低等动物-高等动物-人类） 一种动物（不同年龄、不同组织） 正常或异常（肿瘤） 4、较经济： 可提供大量、同时、重复性好的、生物学性状相似的实验对象。,优点,细胞培养的缺点,人工模拟的培养环境与体内相比仍然存在一定差异，培养的细胞或组织，其形态或功能会发生不同程度的改变。,与体内主要不同 相对孤立、相对单一、缺乏体内的系统作用、失去神经体液的调节和细胞相互间的影响。 主要表现 失去原有组织结构和细胞形态、分化减弱、细胞趋向单一化。 提示 要正确认识体外培养细胞是一种特定条件下生长的细胞群体。,缺点,细胞培养的应用领域,一、在病毒学研究中的应用 二、在免疫学研究中的应用 三、在分子生物学研究中的应用 四、在遗传学研究中的应用 五、在药理学研究中的应用 六、在毒理学研究中的应用 七、在肿瘤学研究中的应用 八、在器官移植中的应用 九、细胞生物学的基础研究 十、细胞工程学的应用研究,病毒检验方法,病毒培养全程5-30天,病毒培养： 1.细胞培养 2.接种至细胞,细胞病变判定,荧光染色： 1. 病毒涂片 2. 血清型专一 抗体荧光染色,中和试验： 培养出的病毒与血清型专一性抗血清作用，再接种至细胞,病毒学,检测病毒,Hybridomas,杂交瘤技术,单克隆抗体制备,在分子生物学研究中的应用,1、 体外培养细胞的转化 2、 DNA转导技术 3、基因诊断和基因治疗,器官移植组织工程,种子细胞（干细胞） 支架材料,目前应用较多的主要有胶原(以I型胶原为主)、明胶、甲壳素、壳聚糖、 天然珊瑚及其衍生物等。 可降解高分子材料 目前应用较多人工合成可降解高分子材料主要是聚乳酸(PLA)、 聚羟基乙酸(PGA)以及它们之间的各种共聚物。,细胞培养基本技术,洗刷,细胞培养,人基因猪等,细胞培养(cell culture)技术 即是选用各种细胞的最佳生存条件对活细胞进行培养和研究的技术，是广泛应用于医学研究领域的重要技术。,细胞培养的基本条件,无菌条件 细胞生长条件 细胞检测条件 细胞保存条件 实验室安全条件,一、细胞培养的无菌环境,无菌室的结构：一般由更衣间、缓冲间、操作间三部分组成。 （使用前）紫外照射（1小时） 每周甲醛、乳酸、过氧乙酸熏蒸（2小时）和每月新洁尔灭擦拭地面和墙壁一次的方式进行消毒,生物安全柜,使用前开启柜内紫外灯照射1030分钟， 预工作1015分钟，以除去臭氧和使用工作台面空间呈净化状态。 使用完毕后，要用70%酒精将台面和台内四周擦拭干净。 还要定期用福尔马林熏蒸。,常用培养器皿及清洗消毒,玻璃器皿的清洗 一般经过浸泡、刷洗、浸酸、和清洗四个步骤 新的橡胶制品洗涤方法 0.5M NaOH煮沸15分钟，流水冲洗，0.5MHCl煮沸15分钟，流水冲洗，自来水煮沸2次，蒸馏水煮沸20分钟，50烤干备用。,消毒前包装,常用的包装材料 牛皮纸、硫酸纸、棉布、铝饭盒、铝箔,火焰消毒,在无菌环境进行培养时，首先要点燃酒精灯。以后一切操作，如打开或封闭瓶口等，都需在火焰近处并经过烧灼进行。 培养瓶 滴管、试管、吸管,细胞培养的实验用品,细胞培养瓶 25平方厘米，正方斜颈 25平方厘米，三角斜颈 75平方厘米，正方斜颈 75平方厘米，三角斜颈 150平方厘米，正方斜颈,细胞培养板 6孔， 12孔， 24孔， 48孔 96孔,细胞培养皿 35mm 60mm 100mm,冻存管 1.2ml 2ml， 5ml,离心管 15ml 50ml 细胞刮,滤 器,大多数培养用液，如人工合成培养基、血清、酶液等均采用滤过法除菌。,液氮罐,何处购买细胞,ATCC 细胞库(www.atcc.org). 美国菌种保藏中心又称美国模式菌种收集中心(ATCC)是位于马里兰洲洛克菲勒的一家私营的，非赢利性组织。 目前它可以提供以下物品 细胞系3000种 细菌和噬菌体 15000种 动植物病毒 2500种 原生动物 1200种以及重组物品 欧洲动物细胞库(ECACC)和日本细胞库(RCB),国内细胞库,中国科学院细胞库 中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心 联系方法： 地址：上海市岳阳路320号，200031 电话：021-54920404， 54920405 Fax: 021-54920406 联系人：陈松华，徐惠均 e-mail: shchen, 中国典型培养物保藏中心 也称武汉大学保藏中心，是国家知识产权局指定的专利培养物/生物材料菌种保藏机构,订购程序,向中心订购培养物，可查阅CCTCC培养物目录，并向CCTCC提出订购培养物的名称、CCTCC保藏号等内容。 联系方式可通过电话、传真，信函，电子邮件等方式。 电话：027-87682319 传真：027-87883833 E-mail:cctcc 细胞系：500元/每株 菌种准备时间 一般情况CCTCC收到订购人的汇款后的3-4天寄出，每周寄送二次（周一，周五）。,二、细胞的生长条件 细胞的营养,碳水化合物、氨基酸和脂类三大类 也需要一定量的无机盐、维生素和微量元素,细胞培养常用液体,水 平衡盐溶液 pH调节液 消化液 抗生素溶液 培养基,水：新鲜制备的三蒸水或去离子水,细胞培养用液的配制,（一）水,平衡盐溶液,主要由无机盐和葡萄糖配制而成 作用 维持渗透压、缓冲和调节酸碱度 常用的缓冲液 生理盐水 PBS Hanks液 （D-Hanks常用于配制胰酶溶液）,pH调节液 (1) 碳酸氢钠液 (2) Hepes缓冲液 是一种可以保持细胞培养过程中pH值较长时间稳定的氢离子缓冲剂 通常使用浓度为1015mM,消化液 胰蛋白酶溶液 主要作用是使细胞间的蛋白质水解，从而使贴壁细胞从瓶壁上脱落并使细胞游离分散开来 常用浓度为0.25%或5%胰蛋白酶。 (2) EDTA溶液 作用机制是破坏细胞间的连接。 对于一些贴壁特别牢固的细胞，可用EDTA和胰酶的混合液 EDTA溶液的使用浓度为0.02%，配制时应加碱助溶 (3)胶原酶溶液 胶原酶在上皮类细胞原代培养时经常使用，胶原酶作用的对象是胶原组织，因此不容易对细胞产生损伤。,抗生素溶液 通常是青霉素和链霉素联合使用，俗称“双抗溶液”。 青霉素主要是对革兰阳性菌有效，链霉素主要对革兰阴性菌有效。加入这两种抗生素可预防绝大多数细菌污染。 培养基内青霉素、链霉素最终使用浓度为每毫升100单位。 庆大霉素：每毫升100单位,培养基,分天然培养基和合成培养基 天然培养基： 血清 血浆 组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）,合成培养基,根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。 包括四大类物质：无机盐、氨基酸、维生素、碳水化合物 目前常用培养基：RPMI-1640、DMEM、TC199、MEM、 另有无血清培养基、无蛋白培养基,RPMI- 1640 Medium RPMI-1640 medium was developed by Moore et al., at Roswell Park Memorial Institute, hence the acronym RPMI. The formulation is based on the RPMI-1630 series of media utilizing a bicarbonate buffering system and alterations in the amounts of amino acids and vitamins. RPMI-1640 medium has been used for the culture of human normal and neoplastic leukocytes. RPMI-1640 when properly supplemented, has demonstrated wide applicability for supporting growth of many types of cell cultures, including fresh human lymphocytes in the 72-hour phytohemagglutinin (PHA) stimulation assay.,RPMI1640,最初是由G，E，Moore为培养小鼠白血病细胞而设计的。 开始的配方特别适合于悬浮细胞生长，主要是针对淋巴细胞，后经过改良，从RPMI1630、RPMI1634、直至RPMI1640。 其组分较为简单，适合许多种细胞生长，如肿瘤细胞、正常细胞、原代培养、传代培养等。 尤其适合人白细胞，如H9、T-15、HL-60、IM-9、Jurkat、 K-562 及KATOIII等细胞系的培养。,RPMI1640种类,RPMI1640（A） （不含谷氨酰胺、可高压灭菌） RPMI1640（A）无酚红 （不含谷氨酰胺、高压灭菌） RPMI1640 （含谷氨酰胺、除菌过滤灭菌）,DMEM,Many modifications of Eagles Medium have been developed since the original formulation appeared in the literature. Among the most widely used of these modifications is Dulbeccos Modified Eagles medium (DMEM). DMEM is a modification of Basal Medium Eagle (BME) that contains a four-fold higher concentration of amino acids and vitamins, as well as additional supplementary components. The original DMEM formula contains 1000 mg/L of glucose and was first reported for culturing embryonic mouse cells. A further alteration with 4500 mg/L glucose has proved to be optimal for cultivation of certain cell types.,DMEM细胞培养基,是在MEM培养基的基础上研制的 与MEM比较增加了各种成分用量，同时又分为高糖型（低于4500g/L）和低糖型(低于1000g/L)。 高糖型有利于细胞停泊于一个位置生长，适于生长较快、附着较困难肿瘤细胞等。 DMEM（A）【不含谷氨酰胺、可高压灭菌】 DMEM（H）【含谷氨酰胺、高糖型、除菌过滤灭菌】 DMEM（L）【含谷氨酰胺、低糖型、除菌过滤灭菌】。,干粉培养基的配制,认真阅读说明书。说明书都注明干粉不包含的成分，常见的有NaHCO3、谷氨酰胺、丙酮酸钠、HEPES等。这些成分有些是必须添加的，如NaHCO3、谷氨酰胺，有些根据实验需要决定。 配制是要保证充分溶解，NaHCO3、谷氨酰胺等物质都要等培养基完全溶解之后才能添加。 配制所用的水应是三蒸水，离子浓度很低。 所用器皿应严格消毒。 配制好的培养基应马上过滤，无菌保存于4度。,干粉培养基,商品培养液,血清的使用,血清质量好坏是实验成败的关键 常用血清 胎牛血清、新生牛血清、小牛血清、兔血清、马血清等，胎牛血清是品质最高的。 优质血清的标准 透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支原体、病毒污染。 血清的灭活（消除补体活性） 56 ，30 分钟。 血清的消毒 过滤除菌。,牛血清,胎牛血清应取自剖腹产的胎牛 新牛血清取自出生24小时之内的新生牛 小牛血清取自出生1030天的小牛 使用浓度： 一般为520，最常用是10,何谓FBS、FCS、 CS、HS ?,FBS (fetal bovine serum) 和FCS (fetal calf serum) 是相同的意思， 两者都是指胎牛血清， FCS 乃错误的使用字眼。 CS (calf serum) 则是指小牛血清 HS (horse serum) 则是指马血清,血清解冻步骤,逐步解冻法 20 或70 至4 冰箱溶解一天，至室温下全溶后再分装，一般以50 ml 无菌离心管可分装4045 ml。 勿直接由20 至37 解冻，因温度改变太大，容易造成蛋白质凝结而发生沉淀。,无机盐,CaCl2 、KCl 、MgSO4、 NaCl 、NaHCO3 、NaH2PO4 对调节细胞渗透压、某些酶的活性及溶液的酸碱度都是必须的。,氨基酸,缬氨酸、亮、异亮、苏、赖、色、苯丙、蛋、组、酪、精氨酸、胱氨酸(L型) 细胞用以合成蛋白质的必需原料，不能由其他氨基酸或糖类转化合成 谷氨酰胺具有特殊的作用，补加一定量的谷氨酰胺 。 L-谷氨酰胺的降解导致氨的形成，而氨对于一些细胞具有毒性 。,无血清培养基,血清中不仅存在促细胞生长因子，同对也存在细胞生长抑制因子或毒性因子，故在含血清培养基中培养的细胞所反映的生物学特性是细胞和复杂血清因子的综合反应。 在生长因子、蛋白质工程、基因表达调控等研究领域，迫切需要用无血清培养基培养细胞,1975年，Sato首次成功地用无血清培养基培养了垂体细胞株，近20多年来已报道了几十种细胞系在无血清培养基中成功地生长和增殖。 无血清细胞培养基的使用保证了实验结果的准确性、可重复性和稳定性，减少了细胞污染，简化了提纯和鉴定各种细胞产物的程序。,向无清培养液中能促进细胞系生长的补加物都是独特的。适用于某种细胞株的培养液，很可能不适合另一种细胞株的生长。即使同源组织的不同细胞株，所需补加物也不同。 商品化的无血清培养液供应。如： Sigma公司的MCDB131可用于培养内皮细胞Biofluids公司的LHC-9用于气管上皮细胞提高制品安全性和/或产量.,无血清培养基 替代血清的补充成分 优点：增加确定性； 性能更一致； 容易进行纯化和下游加工； 缺点：无血清培养基尚处于研究阶段难以推广。,基础培养基,三、细胞培养基本技术 原代细胞培养,基本操作技术和要求,由于体外培养的细胞没有抗感染能力， 因此防污染是决定培养成功的首要条件。 一切操作需要保证无菌和有条不紊。,1 培养室内的无菌技术,培养前的准备：按实验计划和程序 准备 物品，作到心中有数。 培养室和超净台：定期全面彻底消毒 洗手和着装：均按外科手术要求 实验中无菌培养操作：均在火焰近处进行，实验用品需火焰灭菌，冷却后接触培养细胞，以防烧死细胞。,2 培养细胞的取材,基本要求： 取材组织用培养液浸泡，4度运送，24h内尽快培养。 取材无菌操作，避免对组织的机械损伤，尽量去除脂肪、神经、结缔、坏死组织，污染组织可用青链霉素和制霉菌素漂洗。 原代取材同时保留组织学和电镜标本，对供体来源、部位及一般情况做记录。,2.1 皮肤和粘膜的取材,皮肤和粘膜是上皮细胞培养的重要来源。 取材方法似断层皮片手术，面积2-3mm2. 尽可能去除皮下和粘膜下组织。 因分布在体表，故细菌、霉菌很多，需严格消毒，可用较高浓度抗菌素漂洗。,2.2 内脏和实体瘤的取材,内脏除消化道和泌尿管道外基本是无菌的，明确取材部位，去除结缔组织。 肿瘤组织取材避免坏死液化和结缔组织， 标本应按污染组织处理。,2.3 血细胞的取材,血细胞培养可用于造血干细胞移植、免疫活性细胞的治疗和染色体分析等。 取血抗凝剂量过大易导致溶血，肝素常用浓度为20U/ml, 针管用较高浓度肝素500U/ml湿润。,2.4 鼠胚组织的取材,无菌消毒方法 小鼠置于75%酒精的烧杯中5分钟 固定于消毒的小木板上 剪开皮肤解剖取材 取材的组织放置于平皿内培养,3. 组织材料的分离,欲从组织中获得大量生长良好的细胞，须将组织分散开，使细胞解离出来。 常用方法有机械法和化学法。,3.1 细胞悬液的分离方法,离心法：血液和体液等细胞悬液500-1000rpm 转速 5-10分钟。离心速度过大、时间过长，会造成细胞损伤和死亡。 密度梯度离心法：用离心法将细胞分到不同密度的梯度介质中，再分别吸出各层细胞。适于分离密度不等的的细胞。常用介质有Ficoll 400, Percoll, 泛影葡胺等。,3.2 机械分散法,适于较柔软的组织，如脑、肝、脾、淋巴结、胸腺、胚胎组织和肿瘤组织等。 剪切组织为1mm3碎块 后，置于组织匀浆研磨，或用吸管反复吹打分散组织细胞 组织液放在注射器内通过针头压出。 注射器针芯挤压后，用PBS液洗涤，分别通过不锈钢筛网80,150,400目孔径筛网。 记数活细胞数，制成细胞悬液接种。,3.3 消化分离法,消化法是结合生化和化学手段把已剪切成较小体积的组织进一步分化，获得细胞悬液直接进行培养,胰蛋白酶法,主要作用是对细胞间的蛋白质水解，使细胞离散。 活性以消化酪蛋白的能力测定，常用1：250 消化效果与pH值、温度、酶浓度和组织块大小与硬度有关， 对细胞的分离作用与细胞的类型与性质关系密切 钙镁离子和血清抑制活性 常用剂量为0.25% （0.1-0.5%），pH值 8（8-9）温度 37。,胶原酶法,只对细胞间质胶原组织起消化作用，使上皮细胞与胶原成份分离 产品有I-V VII -IX等型，分别适用于分离肝细胞、胰岛、脂肪细胞肾及纤维组织 钙镁离子和血清不影响活性, pH.6.5-7 常用剂量为200单位/ml或0.1g/ml 0.3 g/ml,EDTA法,EDTA（二乙烯四乙酸二钠）作用较缓和。 主要作用：能从组织生长环境中吸取维持组织完整的钙镁离子。 单独使用不能使细胞完全分散， 常用1:1的EDTA（0.02%）和胰蛋白酶0.25%混合液,4.原代细胞培养方法,也称初代培养, 是从供体取得组织细胞后在体外进行的首次培养。 细胞保持原有的基本性质，仍具二倍体遗传物性。最接近和反映体内生长特性。适合作药物测试，细胞分化研究。 原代培养细胞部分生物学特征尚不稳定，供体和细胞间有很大差异。,1） 组织块培养法,将组织剪成小块后，接种于培养瓶，24小时贴壁后，细胞就从组织周围长出。 培养瓶底预先涂以胶原薄层，以利上皮细胞的生长。 如需做组织染色或电镜检查，可将组织可放入小盖玻片上后再放进培养瓶培养。 换液需轻巧，以免组织块漂起，细胞死亡,2 ） 消化培养法,采用前述的组织消化分散法。将妨碍细胞生长的细胞间质去除，使细胞分散，形成悬液，按不同浓度接种培养瓶培养。,原代细胞培养 鸭胚成纤维细胞原代实例,掌握无菌操作； 掌握原代细胞培养的方法和步骤； 了解培养成纤维细胞的形态。,细胞培养(Cell culture)是模拟机体内生理条件，将细胞从机体中取出，在人工条件下使其生存、生长、繁殖和传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程等问题的研究。由体内直接取出组织或细胞进行培养叫原代培养。原代培养细胞离体时间短，性状与体内相似。一般说来，幼稚状态的组织和细胞，如：动物的胚胎、幼仔的脏器等更容易进行原代培养。,实验原理,实验器材与试剂,1. 器具 显微镜、电热恒温水浴锅、天平、CO2培养箱、蒸汽灭菌器、超净工作台、解剖刀、 眼科剪、眼科镊、培养皿 、锥形瓶、容量瓶、纱布、培养瓶、移液枪。 2. 材料 9 - 12 日龄发育良好的鸭胚。,3. 主要试剂 双蒸水、Hanks液、0.25%胰蛋白酶、EDTA、NaHCO3 、台盼蓝、洋红。 营养液：DMEM培养基（含8%小牛血清、1万单位/ml青、链霉素）。 维持液： DMEM培养基（含5%小牛血清、1万单位/ml青、链霉素）。,原代培养的方法,1.酒精棉球消毒鸭蛋，剥出鸭胚，去头、翅、爪和内脏， 加Hanks 液，剪碎为0. 5 -1mm3 的小块， Hanks 液洗涤2 - 3 次。 2. 组织块移入培养瓶，间距0.5cm摆放后倒置培养瓶，加少量营养液，保持湿润，37 培养，2hr后翻转培养瓶，添营养液继续培养。 3. 定期观察细胞贴壁生长状况，如颜色变黄，说明细胞生长，3-5天后更换培养液。 4 .倒置显微镜下观察拍照。 5.单层细胞用Hanks 液洗涤后，加入维持液，用于原代细胞维持。,传代培养,当培养细胞接近汇合成片时，倾去培养液。 加入0. 25 %（含0. 02 %EDTA ）消化2-3分钟，倾去大部分消化液，留少量消化液浸润细胞。发现细胞层出现裂痕或空洞后，加入Hanks 液洗去残留消化液，终止消化。 加适量营养液吹打分散，补加营养液后，1：2分装培养。 汇合后挑取少许细胞，染色，观察拍照。,原代培养的绍鸭成纤维细胞，相差显微镜照片,正常细胞,凋亡细胞,分裂中期细胞,传代培养的绍鸭成纤维细胞形态（DAPI染色）,DAPI染色 1原理 DAPI为4，6二脒基-2-苯吲哚(4，6diamidino-2phenylindole)能与双链DNA小槽，特别是AT碱基结合，也可插入少于3个连续AT碱基对的DNA序列中。当它与双链DNA结合时，荧光强度增强20倍，而与单链DNA结合则无荧光增强现象，因此是一种简易、快速和敏感地检测DNA的方法。DAPI的荧光强度虽较Hoechst低，但荧光稳定性优于Hoechst；其特异性较溴化乙啶(ethidlium bromide，EB)和碘化丙啶(propidium iodide，P1)高。,鼠肾细胞原代培养,幼鼠肾脏,单个细胞,原代细胞,传代培养,洗涤、稀释、分离,常用的原代细胞培养,成纤维细胞的原代培养 肝细胞的原代培养 肾细胞的原代培养 心脏细胞的原代培养 血管平滑肌细胞的原代培养 肿瘤细胞的原代培养 干细胞原代培养,心脏细胞的原代培养,心脏组织的获得与处理 制备小组织块 胰酶消化 制备单细胞 计数、分装和培养（细胞跳动）,肿瘤细胞的原代培养,肿瘤组织的处理 制备小组织块 胰酶消化 制备单细胞 计数、分装和培养,传代培养和细胞系的维持,培养细胞增殖长满瓶壁时，既达到所谓的饱和密度。此时正常细胞则不再生长；恶性细胞重叠生长，易于从瓶壁上成片脱落,，为此传代势在必行。,1 原代细胞培养的传代,细胞由培养瓶内分离再培养称之为传代, 进行一次分离再培养称之为传一代。 原代培养的首次传代是建系的关键时期，细胞需覆盖大部分瓶底后再传代。 首次传代时细胞接种数量要多一些，使细胞能尽快适应新环境而利于细胞生存和增殖。,2 细胞传代方法,贴壁生长的细胞用消化法传代； 部分贴壁生长的细胞用直接吹打即可传代； 悬浮生长的细胞采用离心分离后传代，,1) 贴壁细胞传代步骤,吸除瓶内旧培养液；加入1ml消化液；37C或室温25 C消化2 5分钟 显微镜下进行观察，发现胞质回缩、细胞间隙增大后； 直接加少许含血清的培养液，终止消化； 细胞脱离瓶壁后形成细胞悬液计数，分别接种在新的培养瓶内。,2) 悬浮细胞的传代,直接传代即让悬浮细胞慢慢沉淀在瓶底后，将上清洗掉1/2 1/3，然后用吸管吹打形成细胞悬液后，再传代。 离心法：离心800 1000rpm，5min，除上清，加新的培养液，然后传代接种。 部分贴壁生长细胞直接吹打传代或需消化后传代,3) 细胞系的维持,是通过换液、传代和细胞冻存实现的： 建立档案：记录组织来源，生物学特性，培养液要求、传代、换液时间和规律，细胞的遗传学标志，生长形态，常规病理染色的标本等。,细胞系的维持,防细胞之间的交叉污染，传代时所用器械要编号或做好标记 每一种细胞系都应有充足的冻存储备，以防绝种； 另外二倍体细胞等有限细胞系如果暂时不用最好冻存以免传代太多，造成细胞衰老或发生改变,培养细胞的纯化,自然纯化 自然纯化 即利用某一种类细胞的增殖优势，而排除其它细胞生长，靠自然的增殖潜力最后留下生长优势细胞，去除其它细胞，达到细胞纯化的目的。,2. 人工纯化,利用人为手段造成对某一细胞生长有利的环境条件，抑制其它细胞的生长，从而达到纯化细胞的目的。,1) 酶消化法,酶消化法：由于上皮细胞和成纤维细胞对胰蛋白酶的耐受性不同,，成纤维细胞先脱壁，而上皮细胞要消化相当长的时间才脱壁，利用这种差异采用多次差别消化方法将上皮细胞和成纤维细胞分开。,2 ) 机械划除法,机械划除法：上皮细胞和成纤维细胞多数都同时出现，混杂生长常常分区呈片，采用机械的方法去除不需要的细胞区域，而保留需要的细胞。,3) 反复贴壁法,成纤维细胞和上皮细胞相比，其贴壁过程快，大部分细胞常能在短时间内大约10 30min完成附着过程（但不一定完全伸展）；而上皮细胞大部分细胞在短时间内不能附着或附着不稳定，稍加振荡即浮起，这样可以利用此差别来纯化细胞,4) 克隆法,将细胞分成单个细胞，使之分别生长成克隆，然后对每一克隆进行测试，选择出所需要的克隆。,5) 培养基限定方法,某些细胞在生长过程中必须存在或必须去除某种物质，否则将无法生长。而其它细胞与之相反，可以利用这种技术来纯化细胞。如杂交瘤技术常用的HAT培养液，就用来筛选杂交瘤细胞而抑制其它细胞。,细胞的冻存,冻存细胞要缓慢冷冻。 减少细胞内冰晶的形成是减少细胞损伤的关键。 冷冻保护剂的使用，可使细胞免受冰晶形成和渗透压改变而致的损伤。常用二甲基亚砜和甘油。 冻存细胞最好每三个月复苏一次，检测细胞原特性是否改变。,细胞冻存步骤,取生长对数期的细胞消化成细胞悬离心 细胞记数 2.5x106/ml冻存液 加含10%DMSO冻存液熔封 置4度数小时，负20度过夜 或 -70C放置2-3h 移入液氮罐中 记录,细胞复苏步骤,取出安瓶立即放入37C水中 消毒安瓶开封后将细胞 移入离心管中加培养液离心 记数 接种培养瓶培养,培养细胞的运输,冷冻储存运输，即利用特殊容器内盛液氮或干冰冻存 充液法：（1）选择生长状态良好的细胞。一般以生长1/3 1/2瓶底壁为宜，换新液，保留微量空气，拧紧瓶盖（2）用棉花等做防震防压处理,细胞培养中污染于防护,凡混入细胞培养环境中对细胞生存有害的成分和造成细胞不纯的异物都应视为污染 细胞污染不能完全被消除，但能减少其发生的频率和后果的严重性,细胞污染的分类 物理污染 化学污染 生物污染（支原体污染） 控制污染 掌握良好的无菌操作技术 建立细胞库 合理应用抗生素 保持工作区清洁 建立良好的规章制度 检测细胞污染,一、污染途径,空气：每立方米含菌数不应超过15个 器材：器材：CO2温箱 操作： 血清： 组织样本：,二、对细胞的影响,生长缓慢，分裂相减少，细胞变粗糙，轮廓增强，胞浆多颗粒状物。重者细胞增殖停止，分裂相消失，胞质中出现大量堆积物，细胞变圆或崩解，从瓶壁脱落。,细胞污染的种类和判定 细胞培养中常见的污染物有细菌、酵母菌、真菌、支原体和病毒等。在出现以下情况时培养的细胞可能有污染： 培养液的酸碱度发生异常的改变。 培养液出现混浊。 光镜观察到菌丝和颗粒。 细胞出现死亡或增殖缓慢等。,三、污染物的检测,1. 真菌污染 常见真菌种类：多为烟曲霉、黑曲霉、毛霉菌、孢子霉、白念珠菌、酵母菌等 真菌污染判断： 肉眼可见培养液中见白色或黄色漂浮物， 倒置镜下见细胞间纵横交错，丝状、管状、 树枝悬浮飘荡的菌丝或形态呈卵形，散在细胞周边和细胞之间生长， 培养液多不混浊。,白色念珠菌,2.细菌污染 常见细菌种类：大肠杆菌、白色葡萄球菌、假单孢菌等 细菌污染判断： 培养液颜色变黄，出现混浊 镜下观察，大量圆球状颗立漂浮，细胞表面和周围有大量细菌 细胞生长停止，并有中毒表现,洋葱伯克霍尔德菌（小黑虫）,洋葱佰克霍尔德菌 原属假单胞菌属，是植物病原菌，因引起洋葱患病而得名，是医院感染病原菌之一。 洋 葱伯克霍尔德菌是一种广泛存在于土壤及水中，与医院感染密切相关的革兰阴性杆菌，尤其为免疫缺陷及肺囊性纤维化患者易感染细菌之一。它可以在无糖的培养基 中生长。在医院环境中常可污染自来水、体温表、喷雾器、静脉导管、导尿管、静脉输液管等，造成院内传播，导致多种医院感染，如败血症、心内膜炎、肺炎、伤 口感染、深部脓肿和眼结膜炎等，尤其采用导管植入进行治疗者，更容易引起感染。洋葱伯克霍尔德菌对多种抗菌药具有天然的耐药性。耐药现象严重，治疗可选择 复方磺胺甲繟唑、哌拉西林,三唑巴坦、哌拉西林和头孢他啶等抗菌药物。,细菌和真菌污染的检测： 涂片染色镜检； 接种培养：Trypticase大豆肉汤、BHI、Thioglycocollate肉汤和血琼脂板适于广泛的细菌检测；Sabouraud肉汤、YM肉汤和营养肉汤适于检测真菌。 检测到阳性结果后，应高压灭菌处理污染的培养物及其用具,3.支原体: 常见而棘手。 支原体污染细胞后，能抑制细胞代谢和生长，改变核酸合成，影响细胞的抗原性，引起细胞染色体改变，干扰病毒的复制，以及具有类病毒作用。在培养细胞初期，由于支原体对细胞的繁殖影响较小而往往被忽略。,支原体污染 煎鸡蛋样,荧光染色法(33258)显示染色体，细胞周围亮点为支原体,Giemsa染色法，附于胞质上黑点为支原体,扫描电镜法显示支原体，附于细胞表面众多的圆形颗粒为支原体,支原体检测方法和处理： 荧光技术检测：支原体含有DNA，能与荧光染料Hoechest33258特异性的结合，可根据细胞表面的荧光来显示细胞是否污染有支原体。 相差显微镜：相差油镜下呈暗色微小颗粒。 电镜观察：SEM，TEM。 DNA分子杂交：检出率高但复杂。 检测完毕后，所有实验用具均应经过高压消毒处理。,污染支原体后的处理： 抗生素处理：如加入泰乐菌素等。 共培养法：与巨噬细胞共培养。 重新克隆法：抗生素处理后，将细胞稀释后传代，每周换2次含抗生素的新鲜培养液，4-5周后，重复克隆2次。 过滤法：0.22m孔径滤膜正压过滤。,4.污染病毒的检测 致细胞病变效应（CPE）或集落的检测：采用相差显微镜检测 血细胞吸附试验； 鸡胚接种。,四、细胞间交叉污染,为避免细胞间交叉污染，应注意： 了解各细胞系的特征； 培养各细胞系的操作手续要快速； 培养各细胞系不用同一瓶的培养液和酶等； 吸过培养液和细胞悬液的吸管，不能放回储存培养液和酶的瓶内； 经常检查培养物特征，注意任何突然的形态学改变，通过染色体或同工酶谱分析，检查是否有交叉污染。,五、微生物污染的防治,抗生素:联合应用,常用量的510倍,用药2448小时,对早期污染有效. 加温处理:针对支原体污染, 41度510小时,最长不超过18小时. 动物体内接种:将受到污染的细胞接种在同种动物皮下或腹腔,借动物体内的免疫系统消灭微生物.,思考题 1.简述原代细胞培养的方法及注意要点 2.简述细胞冻存和复苏的方法及要点,四、细胞培养污染的检测和排除,培养细胞的污染概念包括所有混入培养环境中对细胞生存生存有害的成份和造成细胞不纯的异物（真菌、细菌、病毒和支原体）、化学物质及细胞,微生物污染的途径,空气：一般培养室环境中每立方米含菌数不应超过1 5个 器材：CO2温箱 操作 血清 组织样本,微生物污染的检测,真菌污染 细菌污染 支原体污染：可做如下检测 （1）相差显微镜检测 （2）荧光染色法 （3）电镜检查 （4）DNA分子杂交检查或支原体培养等方法,微生物污染的防治,防止的关键在于严格无菌操作，把好每一个关口，尽可能禁止其它污染的物品进入培养操作环节：,微生物污染的防治,抗生素：一般用常用量的5 10倍作冲击疗法。用药24 48h后，再换常规培养液。 加温处理：根据支原体对热敏感的特点，将受支原体污染的细胞放置在41 C作用5 10h，最长不超过18h，以杀灭支原体。 动物体内接种：将支原体污染的细胞接种在同种动物的皮下或腹腔，借动物体内的免疫系统消灭支原体。待一定时间后取出细胞，做原代培养再进行繁殖。,细胞交叉污染,有效防止细胞交叉污染： 所有器具要严格区分 不要触及培养液瓶瓶口 细胞系都要在早期留有充足的冻存储备，可以复苏早期冻存细胞使用。,细胞培养污染的检测和排除,培养细胞的污染概念包括所有混入培养环境中对细胞生存生存有害的成份和造成细胞不纯的异物（真菌、细菌、病毒和支原体）、化学物质及细胞,微生物污染的途径,空气：一般培养室环境中每立方米含菌数不应超过1 5个 器材：CO2温箱 操作 血清 组织样本,微生物污染的检测,真菌污染 细菌污染 支原体污染：可做如下检测 （1）相差显微镜检测 （2）荧光染色法 （3）电镜检查 （4）DNA分子杂交检查或支原体培养等方法,微生物污染的防治,防止的关键在于严格无菌操作，把好每一个关口，尽可能禁止其它污染的物品进入培养操作环节：,微生物污染的防治,抗生素：一般用常用量的5 10倍作冲击疗法。用药24 48h后，再换常规培养液。 加温处理：根据支原体对热敏感的特点，将受支原体污染的细胞放置在41 C作用5 10h，最长不超过18h，以杀灭支原体。 动物体内接种：将支原体污染的细胞接种在同种动物的皮下或腹腔，借动物体内的免疫系统消灭支原体。待一定时间后取出细胞，做原代培养再进行繁殖。,细胞交叉污染,有效防止细胞交叉污染： 所有器具要严格区分 不要触及培养液瓶瓶口 细胞系都要在早期留有充足的冻存储备，可以复苏早期冻存细胞使用。,思考题,1、简述原代细胞的培养方法及注意事项 2、简述细胞的传代方法 3、简述细胞冻存与复苏原作者与方法 4、简述细胞污染的来源与控制 5、简述细胞培养所需的设备器材,流式细胞仪分离法,流式细胞仪可根据细胞核酸含量、某些物质含量或细胞结构大小等参数来将细胞分离成不同的群体。,鼠肾细胞原代培养,幼鼠肾脏,单个细胞,原代细胞,传代培养,洗涤、稀释、分离,体外培养细胞的分型,贴附型,大多数培养细胞贴附生长，属于贴壁依 赖性细胞，大致分成以下四型： 成纤维细胞 上皮型细胞 游走细胞型 多型细胞型,1、成纤维细胞型,名称：凡在培养中形态与成纤维细胞类似的 来源：由中胚层间充质组织起源的组织如： 真正的成纤维细胞，心肌，平滑肌，成骨细胞， 血管内皮 形态：胞体梭形或不规则三角形，胞质向外伸出23个长短不等 的突起，中有卵圆形核 生长特点：排列成放射状，漩涡状 细胞细胞接触易断开而单独行动，游离的单独的成纤维 样细胞，常有几个伸长的细胞突起,成纤维细胞,HUVECs人脐静脉内皮细胞 1.细胞种类：人脐静脉内皮细胞； 2.培养的天数：4d；原代培养； 3.放大倍速：倒置显微镜 X20； 4.培养基种类：DMEM+15胎牛 血清； 5.细胞状态与特征简述：细胞呈梭 形，扁平形或多角形，贴壁生长。,骨髓间充质干细胞 1.细胞种类：人骨髓间充质干细胞原代； 2.培养天数：7天； 3.放大倍数：200倍，倒置显微镜； 4.培养基种类：DF12+10FBS； 5.细胞状态与特征简述：使用percoll密度梯度离心法分离人骨髓细胞。首次换液48h，这是7天后的骨髓间充质干细胞扩增情况。,2、上皮型细胞,名称：仅形态上似体内，实际上不完全相同 来源：来源于外胚层、内胚层细胞, 如： 皮肤及其衍生物,消化道，乳腺，肺泡, 上皮性肿瘤 形态：类似体内的上皮细胞扁平，不规则多角形，中有圆 形核 生长特点：易相连成片，相靠紧密相连成薄层铺石状 生长时呈膜状移动，很少脱离细胞群而单个活动,上皮型细胞,SKOv3 （卵巢癌细胞） 1.细胞种类：SKOv3（卵巢癌细胞） 2.培养的天数：传代后3d； 3.放大倍速：倒置显微镜 X10； 4.培养基种类：DMEM+5%胎牛血清； 5.细胞状态与特征简述：细胞贴壁生 长，生长速度较快。,CCL-149 1.细胞种类：大鼠肺泡上皮细胞； 2.培养的天数：1d（种在48孔板中）； 3.放大倍速：倒置显微镜 X20； 4.培养基种类：F12K+10%胎牛血清； 5.细胞状态与特征简述：细胞呈梭形，透亮贴壁生长，34天传代一次，Giemsa染色。,3、游走细胞型： 呈散在生长，一般不连成片，胞质常突起，呈活跃游走或变形运动，方向不规则。此型细胞不稳定，有时难以和其他细胞相区别。,CNE1 1.细胞种类：高分化鼻咽癌细胞系； 2.培养的天数：3d； 3.放大倍速：相差100； 4.培养基种类：PMI1640+10%CS； 5.细胞状态与特征简述：贴壁细胞， 梭型成团生长。,4、多型细胞型,有一些细胞，如神经细胞难以确定其规律和稳定的形态，可统归于此类。,SD大鼠神经元 原代 1.细胞种类：脑皮质细胞； 2.培养的天数：4-5天； 3.放大倍速：电镜 20000； 4.培养基种类：DMEM+10%小牛血清+10%马 血清； 5.细胞状态与特征简述：贴壁细胞，有多量轴 突和树突。,悬浮型,概念：培养时不贴附于底物而呈悬浮状态生长 来源：自血，脾或骨髓，尤以血中白细胞癌肿细胞 特点：在悬浮中生长良好细胞圆形，单个或小细胞团 优点：生存空间大，提供数量大，传代方便(不需消化)， 易于收获，可获得稳定状态 缺点：观察不方便，很多细胞不能悬浮生长(尤以正常细 胞),HL-60 分化细胞Giemsa染色 1. 细胞种类：HL-60； 2. 培养的天数：ATRA 1微摩尔作用5天； 3. 放大倍速：倒置显微镜 X10； 4. 培养基种类：1640+8胎牛血清； 5. 细胞状态与特征简述：悬浮细胞，分化的细胞核浆比例减小，核仁减少或 消失，胞核呈杆状或分叶状。,KU812 1.细胞种类：人嗜碱细胞性白血病细胞系； 2.培养的天数：5d； 3.放大倍速：倒置显微镜 X20； 4.培养基种类：RPMI1640+10%新生牛血清； 5.细胞状态与特征简述：细胞呈圆形，悬浮生长。,HeLa细胞 1.细胞种类：人HeLa细胞传代培养； 2.培养的天数：7d； 3.放大倍速：倒置显微镜 X200； 4.培养基种类：DMEM+10%小牛血清； 5.细胞状态与特征简述：细胞呈多角形，贴壁生长。,K562细胞 1.细胞种类：K562（人慢性红白血病细胞株）； 2.培养的天数：传代后2天； 3.放大倍数：倒置显微镜 X10； 4.培养基种类：RPMI1640+10%胎牛血清，4mM Glutamine； 5.细胞状态与特征简介：悬浮生长，少数贴壁，喜爱成团悬浮。,每代贴壁细胞的生长过程,游离期 贴壁期 潜伏期 对数生长期 停止期（平台期）,游离期 悬浮，胞质回缩，全部细胞变为圆球形。 吸附期 贴附底物，一般24小时内贴壁。 潜伏期 此时细胞有生长活动，基本无增殖。 细胞株潜伏期一般为624小时。 对数生长期 细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进 行实验研究。 停止期（平台期） 细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂 机制：接触抑制、密度依赖性,根据细胞生长的恃点，传代方法有3种： 1悬浮生长细胞传代 离心法传代：离心（1000转/分）去上清，沉淀物加新 培养液后再混匀传代。 2半悬浮生长细胞传代（Hela细胞） 此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用 直接吹打法使细胞从瓶壁脱落下来，进行传代。 3贴壁生长细胞传代 采用酶消化法传代。 常用的消化液有0.25的胰蛋白酶液。,细胞传代方法,首次传代注意事项,细胞生长密度不高时，不能急于传代 原代培养的贴壁细胞需控制消化时间 吹打已消化的细胞应减少机械损伤 首次传代时细胞接种数量要多一些 首次传代培养的pH应偏低些 小牛血清浓度可加大至15%20%左右,细胞计数,计数结果以每毫升细胞数表示 细胞计数的原理和方法与血细胞计数相同 血细胞计数器：手工计数细胞 Coulter计数仪：人工计数,细胞计数步骤,1、将血球计数板及盖片擦拭干净，并将盖片盖在计数板上。 2、将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间。 3、静置3分钟。 4、镜下观察，计算计数板四大格细胞总数。 细胞数/ml4大格细胞总数/ 4104 注意：压线细胞只计左侧和上方的。 镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团占10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液。,培养细胞活力测定,细胞活力： 总细胞中活细胞所占的百分比 由组织中分离细胞一般也要检查活力，以了解分离的过程对细胞是否有损伤作用。 复苏后的细胞也要检查活力，了解冻存和复苏的效果。,测定方法,台盼蓝法 活细胞不被染色，死细胞染成蓝色。 流式细胞仪 细胞活性指标通常包括细胞膜对核酸染料的通透性，代谢活性，膜电位等。,3四唑盐（MTT）比色法,四唑盐（MTT）商品名为噻唑蓝； MTT比色法的原理： 活细胞中琥珀脱氢酶能将四唑盐还原成不溶干水的蓝紫色产物甲臢 （formazan)，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。 二甲亚砜（DMSO）能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与所含的formazan量成正比。 甲臢染料在A570nm处产生吸收值，用酶标仪测定OD值；,细胞冻存和复苏,细胞深低温保存的基本原理是： 在70以下时，细胞内的酶活性均己停止，即代谢处于完全停止状态，故可以长期保存。 细胞低温保存的关键： 在于通过020阶段的处理过程。在此温度范围内，水晶呈针状，极易招致细胞的严重损伤。,冻存和复苏的原则：慢冻快融,慢冻程序 4 10 分钟 20 30 分钟 80 16 - 18 小时(或隔夜) 液氮罐长期储存。,细胞复苏方法,（1）从液氮中取出冷冻管，迅速投入37 38水浴中，使其融化（1分钟左右）； （2）5分钟内用培养液稀释至原体积的10倍以上； （3）低速离心10分钟； （4）去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。,低温保护剂的应用,在细胞冻存时加入低温保护剂，能大大提高冻存效果。 常用的低温保护剂是DMSO，它是一种渗透性保护剂。 也有用甘油的 冻存液： 含20%血清培养基 10% DMSO（或10甘油） DMSO液用培养液配好，避免因临时配制产热而伤害细胞。,细胞欲冷冻保存时，细胞浓度应该多少？,冷冻管内细胞数目一般为1x106 cells/ml 融合瘤细胞则以5x106 cells/ml 为宜。,细胞培养的污染和检测,细胞污染的种类 细菌、酵母菌、霉菌和病毒 污染源 无菌操作技术不当 操作室环境不佳 污染之血清 污染之细胞,细菌培养液被洋葱佰克霍尔德菌污染了。 洋葱佰克霍尔德菌（Burkholderiacepacia）原属假单胞菌属，是植物病原菌。,白色念珠菌污染,真菌感染,支原体污染电镜照片, 煎蛋状和其他形状,细菌和真菌的污染和检测,肉眼直接观察法 培养检查法 显微镜观察法,支原体的污染和检测,Hayflick培养基直接培养法 DNA荧光染色法 PCR方法 相差显微镜观察法 测出细胞株有支原体污染时， 应直接灭菌后丢弃，以避免污染其它细胞株。,病毒的污染和检测,细胞的直接观察 动物接种检查 电子显微镜观察 免疫学检查 PCR技术,