荧光定量pcr的实验技巧

荧光定量PCR问题疑难解答（一）两天我做原则曲线，线性关系还行，R平方0.998。但是扩增效率只有80%，此外扩增曲线也不是太光滑。2.我用SYBR作为荧光染料，样品的荧光强度也挺低的，只有100-200左右。 A：曲线不光滑有时跟染料的量有关，可以加大看看，或者就是扩增产物太少了。1. PCR反映效率差：引物，试剂PCR条件的因素。做realtime-pcr优化体系很重要，你的扩增效率低。可以增长Mg离子的浓度，如果其她条件都好了，还不行，那就是引物的因素，那你就只能重新设计引物了。2. PCR中混入影响反映的物质：模板提取措施需要改善3. 样品稀释不精确：这很重要，做原则曲线诸多不好的时候，诸多都是倍比稀释的问题，正常状况10倍比稀释时，前后是相差3.32个循环。Q：荧光定量PCR的敏捷度A：对于染料法的荧光定量来说，Ct值在1330之间比较精确，3033之间需要再次确认，在以上范畴内的置信度比较差。Q：原则曲线要反复两三次吗?A：没有人说做定量PCR原则曲线要反复两三次，只是用来做原则曲线的梯度点最佳不要少于4个，否则原则曲线精确性不高。Q：有关荧光定量原则曲线的制作A：一般的仪器虽然声称能进行单拷贝检测，但如果不是特别设计的体系，很难做到100拷贝如下的精拟定量，一般用来做原则曲线的最小浓度为1000拷贝，再往下可靠性就减少了，这不是稀释或其她什么问题，而是自身你选作原则曲线的浓度以及定量浓度最佳不要低于1000拷贝，如果再低一点，100拷贝也勉强可以接受，否则虽然你做出来，承认度也不会太高。Q：溶解曲线高矮A：Tm值相似，而峰高下有差别是体现丰度不同，同样的扩增产物也会浮现Tm值有微小差别，一般差别在1度以内都可以接受。融解曲线的纵坐标表达荧光信号对温度的一阶负导数。Q：定量PCR没有扩增A：把定量PCR的产物跑个电泳，看看有无产物，如果电泳有条带，阐明PCR是成功的，只是荧光信号没有读取到，这时要调节染料或探针的浓度（看你是染料法还是探针法）；如果电泳没有条带，那么还要在定量PCR仪上优化实验条件。虽然你在一般PCR仪上优化过条件，但换了定量PCR仪，由于两台仪器的升降温速度及温度精密度等指标存在差别，同样的条件做不出PCR也是也许的。由于诸多因素的影响，扩增子的溶解温度会有一定变异。溶解温度会受特殊缓冲液的pH值，所用Taq聚合酶，SG和MgCl2浓度和其她因素的影响。要做溶解曲线的对比你一方面要保证所用的条件相似。Q：SG的稳定性如何？A：只要不进行稀释，SG是非常稳定的。一旦稀释，可以保存1周到3个月，这取决于冻融次数，推荐配备成一定浓度的贮存液，用时现用现配稀释液。为优化SG反映，有必要在所有的常规环节来拟定，优化扩增反映的条件（合适的MgCl2、dNTP和Taq酶浓度等）。成果应当在凝胶电泳上有唯一的条带。SG分析的优化重要涉及如下4个因素：a) SG 浓度 b) 引物浓度 c) MgCl2浓度 d) 温度和反映次数推荐的SG终浓度变动范畴是1：5000到1：100000。常常用到的浓度范畴是1：10000到1：70000。引物浓度的优化应当测试不同浓度的正向和反向引物。引物浓度的范畴应当是50nM到300nM，然而，也有例外的状况。Q：荧光定量污染解决措施A：几种月前我也有跟你同样的遭遇，当时跳楼的心均有。后来美国来人给培训，按照她们的规定，污染果真就给控制了，两个月来始终还较好。如下的经验但愿对你有用。1. 配反映体系和加模板要在不同的屋子进行；2. 配体系的屋子准备一件干净的白大衣，每次进去都要记得换白大衣，至少要把别的屋子穿的白大衣脱掉；3. 分装好体系后来把反映板/条放在一种有盖的干净的托盘中端到加样的房间；4. 配体系戴的手套可以带到加样的房间，反过来不可；5. PCR完毕后，反映产物拿到别的屋子扔掉；6. 最重要的就是不要把DNA带到配体系的屋子，以上几点也都是为了这一目的。Q：荧光定量real-timePCR反复性问题A：建议不要只加1ul，而是稀释10倍左右然后加10ul，这样有助于改善反复性。如果你测的是拷贝数，反复性不好是很难避免的。我感觉用SYBR green作realtime的误差还是比较大的，它的优势在于敏捷度高，但如果想精拟定量，还是比较困难的，只得反复诸多次，或者多花钱买标记的引物，那个特异性最佳。Q：各位高手，今天第一次做完8个基因的相对荧光定量（ddct法），扩增时忘了做融解曲线了，目前是不是没法再做融解曲线了？（ABI7500）对于每个基因都作了NTC对照，成果显示NTC无扩增，这样能否阐明引物设计得还可以，没有引物二聚体的产生？至于与否有非特异性产物，就必须得做融解曲线了？请帮忙指教一下啊A：把你的定量PCR产物重新作融解曲线，只是新建立一种反映，反映条件按照融解曲线的条件设定就可以了，没必要重新作定量。Ct值25-29，融解曲线单峰；ntc无CT值，融解曲线无峰，就不用电泳了，可以肯定。模板量增长10倍，Ct值减小3.32Cycles。Q：荧光阈值高，怎么改善？A：阈值取决于基线，基线是313cycles左右的荧光信号值原则偏差10倍，也许是背景高，把模板纯化一下看看。要调节一下你的基线的起止循环数。一般开始的循环为2或3，中断循环为一次实验最早起峰的Ct-3，即如果一条曲线在第13个循环就已经起峰了，那么基线的中断循环可以设立为13-3=10。如果你的体系不存在问题，就也许是你的那次实验模板浓度较高，起峰早，导致的阈值线过高。Q：荧光定量PCR检测敏捷度和线性范畴的关系A：一般人们觉得的检测敏捷度即检测下限，可以理解为能检测到和精拟定量的最低浓度(拷贝数)，而线性范畴为可以检测的区间，即可以检测及辨别的最低浓度到最高浓度的数量级。但两者都与荧光定量PCR仪器及试剂体系有关。Q：real time PCR CT值一般在多少后觉得模板没扩增？A：当进入对数期的循环数不小于35个时，RealTime RT-PCR检测无效，基因没有体现；当进入对数的循环数在32-35个循环时，需要有至少3个反复才干判断与否能检测到基因的体现。Q：正常状况NTC是不应当浮现CT值的吗？A：如果是探针法，应当没有Ct值，所谓的没有，也是针对不同算法而言的。NTC一般没有明显的指数扩增，因此一般软件不计算Ct。如果是染料法，也许在30个循环后有单薄起峰，并且软件计算出Ct值，这时还要观测溶解曲线，看扩增产物与否是引物二聚体。大多状况是二聚体，这时也可以优化条件，例如提高退火温度等。如果是探针法，阴性对照起峰肯定是污染，如果是染料法，还要看溶解曲线：如果溶解曲线的Tm值在80度如下，那么很也许是引物二聚体；如果溶解曲线是双峰或更多峰，其中有与加模板后的扩增产物的Tm值相似的峰，那么就意味着存在污染。Q：real time PCR无成果，而用产物跑电泳条带很清晰，什么问题？A：我也浮现过此状况，后来发现是由于加样的时间太长了，荧光染料暴露时间太长了，荧光基团淬灭了，浮现上述问题尚有一种状况，那就是荧光PCR仪的荧光采用信号值太低，有时也不稳定。如果你使用探针法，有荧光信号而没有求出Ct值，那么也许你的探针浓度有问题，也许太高或者太低了，也许变化探针浓度看看。Q：最佳荧光采集温度A：采集荧光的时机不是决定于温度，而是决定于采用的措施。如果采用染料法，一般要在延伸阶段的末点进行检测，而72度延伸的效率最高，因此采用染料法时大多在72度检测。如果扩增产物中存在引物二聚体，也有采用更高的读板温度，例如76度、80度等，这时的读板温度与引物二聚体的Tm值有关。如果采用TaqMan探针法，由于TaqMan探针是累积荧光，理论上说在任何环节检测都可以，但目前TaqMan大多采用两步法，因此在退火的末点进行检测即可。如果采用分子信标的措施，就要在退火的末点进行检测。如果采用FRET探针法，要在退火时进行荧光检测。Q：原则曲线的讨论A：有一点可以告诉你：样品浓度太高，beta-actin都是很高的，要美丽就稀释1000倍后再做。浓度高，很容易导致污染。并且第一二个梯度没有分开啊。原则曲线的落点局限在15个循环此前，那样你得到的反映有效线性范畴太窄，就是说要很高浓度的样品才合用你这原则曲线。Q：定量PCR中，质粒作为原则分子为什么要线性化A：由于你要检测的目的基因如果不出意外的话，应当是线性的吧，而你用来定原则曲线的目的基因确是连接在环状的质粒上的。我想单从变性和复性的难易上就会有很大的区别，固然会对引物的结合等各方面导致影响，何况环状的空间构象和线性的空间构象上的差别了。做原则曲线时的基本原则之一就是要尽量的模仿需要定量的基因所在的自然条件，因此说，如果做原则曲线时你可以有条件做到用和你要检测的基因同样的原则品做原则曲线的话，就不要选择把一段基因克隆到质粒上。但是一般状况下是很难做到的。楼上说的没有酶切效果还行，那只是还行。荧光定量本来就是很容易受到诸多因素影响的实验，固然是规定严点好了，固然如果你检测的基因自身就是环状的，那固然不用线性化了，那样反而不好了！线性化比较麻烦：一方面要酶切，保证完全酶切，才干所有线性化。然后要回收，质粒酶切后再回收容易被破坏，并且回收率也不是很高。第三，线性化的质粒不容易保存，相对于环状质粒来说。因此，如果有实验证据证明不线性化的质粒可以用，那就可以省去诸多事情了。Fig. 6 also shows the efficiency of the PCR reaction is not altered by using circular plasmid DNA in place of linearised plasmid DNA.线形化与环状质粒比较文章评论：这篇文章用这个质粒对线性化和非线性化做了比较，从实验成果看线性化并没有对原则曲线产生任何变化。但是这篇文章只是摆出了实验成果，并没有从原理上分析这个实验成果的因素，因此线性化对于原则曲线的作用并不能以这篇文章的成果来外推。就是说也许需要更多的实验成果，或者从原理上分析了这篇文章的成果，才干得出结论来阐明，线性化的确对于所有,或大部分的质粒原则分子是不必要的。荧光定量PCR问题疑难解答（二）Q：realtime pcr不同基因之间的阈值(threshold)是不是要同样啊?A：如果做原则曲线或者相对定量，建议阈值还是同样比较好。并且阈值一般要放置于扩增曲线的指数段，即荧光数据对数坐标轴下的线性段。如果扩增曲线的效率接近，阈值线的位置对于定量成果的影响是微乎其微的。Q：扩增曲线本底不断升高是什么因素?A：我近期也遇到过这种现象，目前基本解决了，因素也许如下：1、试剂质量差是重要因素，我用ABI的SYBR试剂做了一年历来没有遇到过类似问题，而近期换成东洋纺的试剂就浮现了这个问题，因此最佳不要贪便宜用小鬼子的试剂！2、模板不纯是一种重要因素，我用东洋纺的试剂浮现问题后，用ddH2O稀释10倍以上（一定不要用TE稀释，要否则也许会更差），问题基本解决；3、如果模板稀释后基线尚有一定的上升，成果分析时可以将基线从6以上设，避开初始的几种上升厉害的循环；建议：要主线解决此问题请用质量可靠的试剂，便宜没好货！Q：分子信标做的阴性对照，曲线为一条斜线，什么因素？A：和我此前做得没消除背景的曲线挺相像。很也许是试剂的问题，我用东洋纺的试剂也得到过类似的曲线，换了试剂就好了！探针设计的问题！尚有反映液体试剂酶离子调节。Q：原则曲线检测限A：这是由于ABI仪器采用半导体加热，其边沿效应致使96孔加热模块的中央温度高，周边温度低。由于定量原理是通过已知浓度的原则品和未知样本之间的比较来进行的，因此各孔位的反映参数可比性决定了定量的精确性。在模板浓度低的时候ABI的仪器各孔位热循环不均导致的误差通过多种循环后被放大，最后影响定量成果的精确性。因此ABI仪器只能辨别5000个拷贝和10000个拷贝的差别，并且必须用ABI的原装试剂才干达到此效果，如果将模板再稀释，就无法辨别这2倍浓度差别了。你加入起始模板数分别是1000、100、10copy/ul 的反映孔，模板浓度太低了，ABI7000仪器不能检测出来，建议用高浓度模板来做原则曲线。虽然目前的定量PCR仪好多都宣称能做到单拷贝检测，但这个前提是非常苛刻的。需要模板、引物、体系、实验条件设立一切都是最优的状况下才也许做出来，并且一般尚有比例。像一般低拷贝检测Ct值不精确的状况还是很正常的，不需要郁闷的说，人们都是这样。一般临床检测的下限不会低于100拷贝，因此你要考虑是不是真的要做低拷贝的检测，此外，当Ct值不小于30的时候成果就存在很大的不可信性，要反复确认，而低拷贝的Ct值一般都会不小于30。Q：溶解曲线3个峰A：如果浮现引物二聚体，可以从实验条件和体系上加以优化，例如提高退火温度，减少引物浓度等。但如果非特异性的峰离目的产物的峰较近的话，那就需要重新设计引物了，从引物的设计上多做些考虑。可以先优化条件，如果没有用的话就试试变化引物。引物二聚体的几种特性是溶解曲线的峰不明显，即峰不尖且不高，此外是溶解温度基本上低于80度。如果不符合上面的两个条件，基本上就是体系污染了。可以跑个电泳看看。样本浮现双峰，也可以按照上面的判断看看与否有引物二聚体还是非特异性扩增产物。可以提高2度退火温度试试看，延长退火时间对于消除引物二聚体的作用不大。基本上采用染料法的确容易浮现引物二聚体，特别是30个循环之后。如果提高退火温度后空白对照还是起峰，但Ct值在35之后，那就不要管她了，正常。Q：A：你的实验成果其实较好，是初始模板浓度设立错了。1. 以2倍梯度稀释的模板，Ct值的差别为1的时候扩增效率为100%，从原则曲线上来看，你的6个模板Ct差别（原则曲线横轴）还都在1以上一点，已经较好；2. 你的模板是以2倍梯度稀释的，这样初始模板拷贝数的对数值每个浓度相差应当在0.3左右，从图中看，原则曲线的纵轴每个梯度相差在0.7左右，似乎你设立时初始模板的拷贝数是按照5倍梯度设立的。你可以把Ct值取出来，根据初始模板自己做一种原则曲线看看，估计扩增效率可以达到90%以上。2倍梯度辨别的较好！Q：只要Ct值不小于30都是阴性吗？一开始不用设定吗？A：看你做什么检测了，还要与对照品比对才干定性分析。但是，一般Ct值不小于30成果置信度减少，需要多次确认。常规修饰基团分子量5-Biotin 405.45 3-TAMARA 623.605-(6 FAM) 537.46 3-Dabsyl 498.495-HEX 744.13 3-(6 FAM) 569.465-TET 675.24 3-Amino Modifier C3 153.075-Cy5 533.63 3-Amino Modifier C7 209.185-Cy3 507.59 3-Thiol Modifier C3 154.12荧光定量PCR问题疑难解答（三）Q：溶解曲线浮现三个峰，觉得是引物合成问题，重新合成三次引物，溶解曲线仍为三个峰。产物经电泳证明却为一条带，为什么会浮现这种成果？ A：我也曾经浮现过这个问题，但是我是浮现两个峰，后来跑电泳证明是引物二聚体，35为阴性，那当ct为36时就不要特意调节原则。拟定其为阴性就可以了。4. 阳性产物做模板ct较低，其因素是模板浓度较高，模板浓度的对数和ct成反比。因此，模板浓度越高，ct越低。 A：1. 产物是可以用来电泳的，但是由于定量PCR借助于荧光的作用敏捷度较高，电泳产物则一般条带不会很亮；2. 产物的二次扩增在定量PCR中一般是不建议做的，因素很简朴，片段太短了，还是那个问题，定量PCR是高敏捷度的，再二次扩增很难排除二聚体、PCR污染、操作误差等等因素，特别是污染，我们能排除的往往都只是你想到的，尚有诸多是一时想不到的；3. 如果你是用原则的检测试剂盒，你只需要按阐明书来就操作就可以，判断成果同样，如果你还想探究其中的阴性也许漏检的问题，你应当用其她措施，而不能用这个试剂盒了。 Q：通过前辈的简介理解到：正常的ct值范畴在1830之间，ct值应是荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的拐点所相应的循环次数。如果正常状况下不小于30应可以定为阴性。由于近来我也在用SYBR Green做实时定量PCR，因此也想向各位前辈请教一下有关Ct值的问题。我的成果中待测基因的Ct值大多在1825之间，但唯独内参照的Ct值很低。第一次做时基本都在10左右，将模板稀释10倍后第二次的内参照的Ct值还是在1214之间。以这样的数据分析会影响成果的精确度吗？或者还是将模板继续稀释，直到ct值都达到1830之间呢。 A：没必要吧。一般ct超过30是不好，但要是三个反复都这样，也还是可以用的啊，每次都做阴性对照阴性对照ct为0，那ct30就肯定不是污染，而是基因体现量低或是模板太稀，内参ct为1014都正常啊，没必要再稀释模板了，那样你的目的基因ct又要超过30了，但是内参ct太低，低于10也是不太好，成果也许会有偏差。 Q：real-time pcr成果可用来发文章的规定有哪些？ A：不用，但是在文章必须阐明用电泳还是用溶解曲线检测过。论文中把你的实验措施阐明白就可以了。简朴的一种表达图，就可以刊登了。但是REAL-TIME PCR 想用的话最佳放溶解曲线图，一般外文杂志喜欢接受。 Q：不懂得为什么这两天做荧光老不顺，荧光Ct在20如下产物检测很亮，而一般用mix酶跑PCR条带却很淡，难道是荧光定量的酶比较好的因素吗？此外我的NTC荧光在30多种循环的时候均有起峰，我用重开的一管新酶和新稀释的引物以及新水做，还是有起峰，实在是搞不懂了。求人们帮帮忙吧！ A：1. 某些公司荧光定量试剂盒的酶是比一般Tag酶要好，重要是可以避免引物二聚体产生，引物二聚体少了，扩增效率自然高了。2. 也也许是你荧光定量的体系比你一般的PCR体系要优化，例如有些公司荧光定量mix中的Mg离子浓度要高于一般的PCR体系。3. 也许是跑胶的问题。看看你的MARKER还和此前同样亮吗？做荧光定量的短片段特别容易污染。也许是你的枪被污染了吧，是用的跑电泳的那把枪吗？如果在35个循环后起峰，污染不算严重。可以把荧光定量PCR的基线调节到正好高过阴性对照。 Q：请问下目前的PCR荧光诊断试剂盒里面，国家规定都规定要有临界阳对照吗？这些对照品是不是一定要和样本一起提取呢？尚有临界阳用阳性对照来稀释来得到可以吗？不懂得要怎么稀释比较好呢？ A：阳性对照和阴性对照必须要和样品一起提取，进行平行实验，这样才有作为对照的意义。临界阳性样品是不能通过阳性对照稀释的，除非你懂得临界阳性的浓度，通过定量标定将阳性对照稀释到临界阳性。 Q：本人检测的目的基因共有5个解决，每个解决做两次反复，目前的问题每个解决内反复性非常差，有的Ct值差别达到了10，不懂得是怎么回事？ A：换了一种退火温度把所有的设计好的引物都拿来重新试了一下，目前有一对引物两个温度都还好。基本上可以达到规定了。此外，我使用的是BIO-RAD的仪器，感觉边上跟中间温度差别挺大的，由于之前这对引物我也曾经试过的，但是放在边上一种，成果差别很大。经验教训啊！ Q：荧光量开始很高 A：根据TAKARA的资料说，这是由于摸板浓度过大了，把它再稀释，然后再做看看。是模板浓度过大引起的，可以看到曲线图中最高浓度的样品的Ct值很小。但是这张图也能用的，你调节一下基线范畴，把背景荧光压下去，这样以来图就美丽了就能分析了。 Q：刚做了一次real time PCR，成果解离曲线中浮现了负值 A：这个曲线反映的是随着温度的变化荧光值的变化速率。值越高，则此时PCR产物荧光值变化越快，也就是说PCR产物变性速度最快。当温度达到Tm值时，PCR产物迅速变性，荧光值急剧下降，表目前这张图上就是浮现一种峰。产物越纯，峰越窄，PCR产物越多，峰越高。这样看来，浮现负值表白此温度下PCR产物变性速度没有两边的温度是快。70-80度时，已经浮现变性，但是较为缓慢。但是你的产物看来不是特别纯，峰比较宽，也许要变化反映条件或者变化引物。荧光定量PCR问题疑难解答（一）两天我做原则曲线，线性关系还行，R平方0.998。但是扩增效率只有80%，此外扩增曲线也不是太光滑。2.我用SYBR作为荧光染料，样品的荧光强度也挺低的，只有100-200左右。 A：曲线不光滑有时跟染料的量有关，可以加大看看，或者就是扩增产物太少了。1. PCR反映效率差：引物，试剂PCR条件的因素。做realtime-pcr优化体系很重要，你的扩增效率低。可以增长Mg离子的浓度，如果其她条件都好了，还不行，那就是引物的因素，那你就只能重新设计引物了。2. PCR中混入影响反映的物质：模板提取措施需要改善3. 样品稀释不精确：这很重要，做原则曲线诸多不好的时候，诸多都是倍比稀释的问题，正常状况10倍比稀释时，前后是相差3.32个循环。Q：荧光定量PCR的敏捷度A：对于染料法的荧光定量来说，Ct值在1330之间比较精确，3033之间需要再次确认，在以上范畴内的置信度比较差。Q：原则曲线要反复两三次吗?A：没有人说做定量PCR原则曲线要反复两三次，只是用来做原则曲线的梯度点最佳不要少于4个，否则原则曲线精确性不高。Q：有关荧光定量原则曲线的制作A：一般的仪器虽然声称能进行单拷贝检测，但如果不是特别设计的体系，很难做到100拷贝如下的精拟定量，一般用来做原则曲线的最小浓度为1000拷贝，再往下可靠性就减少了，这不是稀释或其她什么问题，而是自身你选作原则曲线的浓度以及定量浓度最佳不要低于1000拷贝，如果再低一点，100拷贝也勉强可以接受，否则虽然你做出来，承认度也不会太高。Q：溶解曲线高矮A：Tm值相似，而峰高下有差别是体现丰度不同，同样的扩增产物也会浮现Tm值有微小差别，一般差别在1度以内都可以接受。融解曲线的纵坐标表达荧光信号对温度的一阶负导数。Q：定量PCR没有扩增A：把定量PCR的产物跑个电泳，看看有无产物，如果电泳有条带，阐明PCR是成功的，只是荧光信号没有读取到，这时要调节染料或探针的浓度（看你是染料法还是探针法）；如果电泳没有条带，那么还要在定量PCR仪上优化实验条件。虽然你在一般PCR仪上优化过条件，但换了定量PCR仪，由于两台仪器的升降温速度及温度精密度等指标存在差别，同样的条件做不出PCR也是也许的。由于诸多因素的影响，扩增子的溶解温度会有一定变异。溶解温度会受特殊缓冲液的pH值，所用Taq聚合酶，SG和MgCl2浓度和其她因素的影响。要做溶解曲线的对比你一方面要保证所用的条件相似。Q：SG的稳定性如何？A：只要不进行稀释，SG是非常稳定的。一旦稀释，可以保存1周到3个月，这取决于冻融次数，推荐配备成一定浓度的贮存液，用时现用现配稀释液。为优化SG反映，有必要在所有的常规环节来拟定，优化扩增反映的条件（合适的MgCl2、dNTP和Taq酶浓度等）。成果应当在凝胶电泳上有唯一的条带。SG分析的优化重要涉及如下4个因素：a) SG 浓度 b) 引物浓度 c) MgCl2浓度 d) 温度和反映次数推荐的SG终浓度变动范畴是1：5000到1：100000。常常用到的浓度范畴是1：10000到1：70000。引物浓度的优化应当测试不同浓度的正向和反向引物。引物浓度的范畴应当是50nM到300nM，然而，也有例外的状况。Q：荧光定量污染解决措施A：几种月前我也有跟你同样的遭遇，当时跳楼的心均有。后来美国来人给培训，按照她们的规定，污染果真就给控制了，两个月来始终还较好。如下的经验但愿对你有用。1. 配反映体系和加模板要在不同的屋子进行；2. 配体系的屋子准备一件干净的白大衣，每次进去都要记得换白大衣，至少要把别的屋子穿的白大衣脱掉；3. 分装好体系后来把反映板/条放在一种有盖的干净的托盘中端到加样的房间；4. 配体系戴的手套可以带到加样的房间，反过来不可；5. PCR完毕后，反映产物拿到别的屋子扔掉；6. 最重要的就是不要把DNA带到配体系的屋子，以上几点也都是为了这一目的。Q：荧光定量real-timePCR反复性问题A：建议不要只加1ul，而是稀释10倍左右然后加10ul，这样有助于改善反复性。如果你测的是拷贝数，反复性不好是很难避免的。我感觉用SYBR green作realtime的误差还是比较大的，它的优势在于敏捷度高，但如果想精拟定量，还是比较困难的，只得反复诸多次，或者多花钱买标记的引物，那个特异性最佳。Q：各位高手，今天第一次做完8个基因的相对荧光定量（ddct法），扩增时忘了做融解曲线了，目前是不是没法再做融解曲线了？（ABI7500）对于每个基因都作了NTC对照，成果显示NTC无扩增，这样能否阐明引物设计得还可以，没有引物二聚体的产生？至于与否有非特异性产物，就必须得做融解曲线了？请帮忙指教一下啊A：把你的定量PCR产物重新作融解曲线，只是新建立一种反映，反映条件按照融解曲线的条件设定就可以了，没必要重新作定量。Ct值25-29，融解曲线单峰；ntc无CT值，融解曲线无峰，就不用电泳了，可以肯定。模板量增长10倍，Ct值减小3.32Cycles。Q：荧光阈值高，怎么改善？A：阈值取决于基线，基线是313cycles左右的荧光信号值原则偏差10倍，也许是背景高，把模板纯化一下看看。要调节一下你的基线的起止循环数。一般开始的循环为2或3，中断循环为一次实验最早起峰的Ct-3，即如果一条曲线在第13个循环就已经起峰了，那么基线的中断循环可以设立为13-3=10。如果你的体系不存在问题，就也许是你的那次实验模板浓度较高，起峰早，导致的阈值线过高。Q：荧光定量PCR检测敏捷度和线性范畴的关系A：一般人们觉得的检测敏捷度即检测下限，可以理解为能检测到和精拟定量的最低浓度(拷贝数)，而线性范畴为可以检测的区间，即可以检测及辨别的最低浓度到最高浓度的数量级。但两者都与荧光定量PCR仪器及试剂体系有关。Q：real time PCR CT值一般在多少后觉得模板没扩增？A：当进入对数期的循环数不小于35个时，RealTime RT-PCR检测无效，基因没有体现；当进入对数的循环数在32-35个循环时，需要有至少3个反复才干判断与否能检测到基因的体现。Q：正常状况NTC是不应当浮现CT值的吗？A：如果是探针法，应当没有Ct值，所谓的没有，也是针对不同算法而言的。NTC一般没有明显的指数扩增，因此一般软件不计算Ct。如果是染料法，也许在30个循环后有单薄起峰，并且软件计算出Ct值，这时还要观测溶解曲线，看扩增产物与否是引物二聚体。大多状况是二聚体，这时也可以优化条件，例如提高退火温度等。如果是探针法，阴性对照起峰肯定是污染，如果是染料法，还要看溶解曲线：如果溶解曲线的Tm值在80度如下，那么很也许是引物二聚体；如果溶解曲线是双峰或更多峰，其中有与加模板后的扩增产物的Tm值相似的峰，那么就意味着存在污染。Q：real time PCR无成果，而用产物跑电泳条带很清晰，什么问题？A：我也浮现过此状况，后来发现是由于加样的时间太长了，荧光染料暴露时间太长了，荧光基团淬灭了，浮现上述问题尚有一种状况，那就是荧光PCR仪的荧光采用信号值太低，有时也不稳定。如果你使用探针法，有荧光信号而没有求出Ct值，那么也许你的探针浓度有问题，也许太高或者太低了，也许变化探针浓度看看。Q：最佳荧光采集温度A：采集荧光的时机不是决定于温度，而是决定于采用的措施。如果采用染料法，一般要在延伸阶段的末点进行检测，而72度延伸的效率最高，因此采用染料法时大多在72度检测。如果扩增产物中存在引物二聚体，也有采用更高的读板温度，例如76度、80度等，这时的读板温度与引物二聚体的Tm值有关。如果采用TaqMan探针法，由于TaqMan探针是累积荧光，理论上说在任何环节检测都可以，但目前TaqMan大多采用两步法，因此在退火的末点进行检测即可。如果采用分子信标的措施，就要在退火的末点进行检测。如果采用FRET探针法，要在退火时进行荧光检测。Q：原则曲线的讨论A：有一点可以告诉你：样品浓度太高，beta-actin都是很高的，要美丽就稀释1000倍后再做。浓度高，很容易导致污染。并且第一二个梯度没有分开啊。原则曲线的落点局限在15个循环此前，那样你得到的反映有效线性范畴太窄，就是说要很高浓度的样品才合用你这原则曲线。Q：定量PCR中，质粒作为原则分子为什么要线性化A：由于你要检测的目的基因如果不出意外的话，应当是线性的吧，而你用来定原则曲线的目的基因确是连接在环状的质粒上的。我想单从变性和复性的难易上就会有很大的区别，固然会对引物的结合等各方面导致影响，何况环状的空间构象和线性的空间构象上的差别了。做原则曲线时的基本原则之一就是要尽量的模仿需要定量的基因所在的自然条件，因此说，如果做原则曲线时你可以有条件做到用和你要检测的基因同样的原则品做原则曲线的话，就不要选择把一段基因克隆到质粒上。但是一般状况下是很难做到的。楼上说的没有酶切效果还行，那只是还行。荧光定量本来就是很容易受到诸多因素影响的实验，固然是规定严点好了，固然如果你检测的基因自身就是环状的，那固然不用线性化了，那样反而不好了！线性化比较麻烦：一方面要酶切，保证完全酶切，才干所有线性化。然后要回收，质粒酶切后再回收容易被破坏，并且回收率也不是很高。第三，线性化的质粒不容易保存，相对于环状质粒来说。因此，如果有实验证据证明不线性化的质粒可以用，那就可以省去诸多事情了。Fig. 6 also shows the efficiency of the PCR reaction is not altered by using circular plasmid DNA in place of linearised plasmid DNA.线形化与环状质粒比较文章评论：这篇文章用这个质粒对线性化和非线性化做了比较，从实验成果看线性化并没有对原则曲线产生任何变化。但是这篇文章只是摆出了实验成果，并没有从原理上分析这个实验成果的因素，因此线性化对于原则曲线的作用并不能以这篇文章的成果来外推。就是说也许需要更多的实验成果，或者从原理上分析了这篇文章的成果，才干得出结论来阐明，线性化的确对于所有,或大部分的质粒原则分子是不必要的。荧光定量PCR问题疑难解答（二）Q：realtime pcr不同基因之间的阈值(threshold)是不是要同样啊?A：如果做原则曲线或者相对定量，建议阈值还是同样比较好。并且阈值一般要放置于扩增曲线的指数段，即荧光数据对数坐标轴下的线性段。如果扩增曲线的效率接近，阈值线的位置对于定量成果的影响是微乎其微的。Q：扩增曲线本底不断升高是什么因素?A：我近期也遇到过这种现象，目前基本解决了，因素也许如下：1、试剂质量差是重要因素，我用ABI的SYBR试剂做了一年历来没有遇到过类似问题，而近期换成东洋纺的试剂就浮现了这个问题，因此最佳不要贪便宜用小鬼子的试剂！2、模板不纯是一种重要因素，我用东洋纺的试剂浮现问题后，用ddH2O稀释10倍以上（一定不要用TE稀释，要否则也许会更差），问题基本解决；3、如果模板稀释后基线尚有一定的上升，成果分析时可以将基线从6以上设，避开初始的几种上升厉害的循环；建议：要主线解决此问题请用质量可靠的试剂，便宜没好货！Q：分子信标做的阴性对照，曲线为一条斜线，什么因素？A：和我此前做得没消除背景的曲线挺相像。很也许是试剂的问题，我用东洋纺的试剂也得到过类似的曲线，换了试剂就好了！探针设计的问题！尚有反映液体试剂酶离子调节。Q：原则曲线检测限A：这是由于ABI仪器采用半导体加热，其边沿效应致使96孔加热模块的中央温度高，周边温度低。由于定量原理是通过已知浓度的原则品和未知样本之间的比较来进行的，因此各孔位的反映参数可比性决定了定量的精确性。在模板浓度低的时候ABI的仪器各孔位热循环不均导致的误差通过多种循环后被放大，最后影响定量成果的精确性。因此ABI仪器只能辨别5000个拷贝和10000个拷贝的差别，并且必须用ABI的原装试剂才干达到此效果，如果将模板再稀释，就无法辨别这2倍浓度差别了。你加入起始模板数分别是1000、100、10copy/ul 的反映孔，模板浓度太低了，ABI7000仪器不能检测出来，建议用高浓度模板来做原则曲线。虽然目前的定量PCR仪好多都宣称能做到单拷贝检测，但这个前提是非常苛刻的。需要模板、引物、体系、实验条件设立一切都是最优的状况下才也许做出来，并且一般尚有比例。像一般低拷贝检测Ct值不精确的状况还是很正常的，不需要郁闷的说，人们都是这样。一般临床检测的下限不会低于100拷贝，因此你要考虑是不是真的要做低拷贝的检测，此外，当Ct值不小于30的时候成果就存在很大的不可信性，要反复确认，而低拷贝的Ct值一般都会不小于30。Q：溶解曲线3个峰A：如果浮现引物二聚体，可以从实验条件和体系上加以优化，例如提高退火温度，减少引物浓度等。但如果非特异性的峰离目的产物的峰较近的话，那就需要重新设计引物了，从引物的设计上多做些考虑。可以先优化条件，如果没有用的话就试试变化引物。引物二聚体的几种特性是溶解曲线的峰不明显，即峰不尖且不高，此外是溶解温度基本上低于80度。如果不符合上面的两个条件，基本上就是体系污染了。可以跑个电泳看看。样本浮现双峰，也可以按照上面的判断看看与否有引物二聚体还是非特异性扩增产物。可以提高2度退火温度试试看，延长退火时间对于消除引物二聚体的作用不大。基本上采用染料法的确容易浮现引物二聚体，特别是30个循环之后。如果提高退火温度后空白对照还是起峰，但Ct值在35之后，那就不要管她了，正常。Q：A：你的实验成果其实较好，是初始模板浓度设立错了。1. 以2倍梯度稀释的模板，Ct值的差别为1的时候扩增效率为100%，从原则曲线上来看，你的6个模板Ct差别（原则曲线横轴）还都在1以上一点，已经较好；2. 你的模板是以2倍梯度稀释的，这样初始模板拷贝数的对数值每个浓度相差应当在0.3左右，从图中看，原则曲线的纵轴每个梯度相差在0.7左右，似乎你设立时初始模板的拷贝数是按照5倍梯度设立的。你可以把Ct值取出来，根据初始模板自己做一种原则曲线看看，估计扩增效率可以达到90%以上。2倍梯度辨别的较好！Q：只要Ct值不小于30都是阴性吗？一开始不用设定吗？A：看你做什么检测了，还要与对照品比对才干定性分析。但是，一般Ct值不小于30成果置信度减少，需要多次确认。常规修饰基团分子量5-Biotin 405.45 3-TAMARA 623.605-(6 FAM) 537.46 3-Dabsyl 498.495-HEX 744.13 3-(6 FAM) 569.465-TET 675.24 3-Amino Modifier C3 153.075-Cy5 533.63 3-Amino Modifier C7 209.185-Cy3 507.59 3-Thiol Modifier C3 154.12荧光定量PCR问题疑难解答（三）Q：溶解曲线浮现三个峰，觉得是引物合成问题，重新合成三次引物，溶解曲线仍为三个峰。产物经电泳证明却为一条带，为什么会浮现这种成果？ A：我也曾经浮现过这个问题，但是我是浮现两个峰，后来跑电泳证明是引物二聚体，35为阴性，那当ct为36时就不要特意调节原则。拟定其为阴性就可以了。4. 阳性产物做模板ct较低，其因素是模板浓度较高，模板浓度的对数和ct成反比。因此，模板浓度越高，ct越低。 A：1. 产物是可以用来电泳的，但是由于定量PCR借助于荧光的作用敏捷度较高，电泳产物则一般条带不会很亮；2. 产物的二次扩增在定量PCR中一般是不建议做的，因素很简朴，片段太短了，还是那个问题，定量PCR是高敏捷度的，再二次扩增很难排除二聚体、PCR污染、操作误差等等因素，特别是污染，我们能排除的往往都只是你想到的，尚有诸多是一时想不到的；3. 如果你是用原则的检测试剂盒，你只需要按阐明书来就操作就可以，判断成果同样，如果你还想探究其中的阴性也许漏检的问题，你应当用其她措施，而不能用这个试剂盒了。 Q：通过前辈的简介理解到：正常的ct值范畴在1830之间，ct值应是荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的拐点所相应的循环次数。如果正常状况下不小于30应可以定为阴性。由于近来我也在用SYBR Green做实时定量PCR，因此也想向各位前辈请教一下有关Ct值的问题。我的成果中待测基因的Ct值大多在1825之间，但唯独内参照的Ct值很低。第一次做时基本都在10左右，将模板稀释10倍后第二次的内参照的Ct值还是在1214之间。以这样的数据分析会影响成果的精确度吗？或者还是将模板继续稀释，直到ct值都达到1830之间呢。 A：没必要吧。一般ct超过30是不好，但要是三个反复都这样，也还是可以用的啊，每次都做阴性对照阴性对照ct为0，那ct30就肯定不是污染，而是基因体现量低或是模板太稀，内参ct为1014都正常啊，没必要再稀释模板了，那样你的目的基因ct又要超过30了，但是内参ct太低，低于10也是不太好，成果也许会有偏差。 Q：real-time pcr成果可用来发文章的规定有哪些？ A：不用，但是在文章必须阐明用电泳还是用溶解曲线检测过。论文中把你的实验措施阐明白就可以了。简朴的一种表达图，就可以刊登了。但是REAL-TIME PCR 想用的话最佳放溶解曲线图，一般外文杂志喜欢接受。 Q：不懂得为什么这两天做荧光老不顺，荧光Ct在20如下产物检测很亮，而一般用mix酶跑PCR条带却很淡，难道是荧光定量的酶比较好的因素吗？此外我的NTC荧光在30多种循环的时候均有起峰，我用重开的一管新酶和新稀释的引物以及新水做，还是有起峰，实在是搞不懂了。求人们帮帮忙吧！ A：1. 某些公司荧光定量试剂盒的酶是比一般Tag酶要好，重要是可以避免引物二聚体产生，引物二聚体少了，扩增效率自然高了。2. 也也许是你荧光定量的体系比你一般的PCR体系要优化，例如有些公司荧光定量mix中的Mg离子浓度要高于一般的PCR体系。3. 也许是跑胶的问题。看看你的MARKER还和此前同样亮吗？做荧光定量的短片段特别容易污染。也许是你的枪被污染了吧，是用的跑电泳的那把枪吗？如果在35个循环后起峰，污染不算严重。可以把荧光定量PCR的基线调节到正好高过阴性对照。 Q：请问下目前的PCR荧光诊断试剂盒里面，国家规定都规定要有临界阳对照吗？这些对照品是不是一定要和样本一起提取呢？尚有临界阳用阳性对照来稀释来得到可以吗？不懂得要怎么稀释比较好呢？ A：阳性对照和阴性对照必须要和样品一起提取，进行平行实验，这样才有作为对照的意义。临界阳性样品是不能通过阳性对照稀释的，除非你懂得临界阳性的浓度，通过定量标定将阳性对照稀释到临界阳性。 Q：本人检测的目的基因共有5个解决，每个解决做两次反复，目前的问题每个解决内反复性非常差，有的Ct值差别达到了10，不懂得是怎么回事？ A：换了一种退火温度把所有的设计好的引物都拿来重新试了一下，目前有一对引物两个温度都还好。基本上可以达到规定了。此外，我使用的是BIO-RAD的仪器，感觉边上跟中间温度差别挺大的，由于之前这对引物我也曾经试过的，但是放在边上一种，成果差别很大。经验教训啊！ Q：荧光量开始很高 A：根据TAKARA的资料说，这是由于摸板浓度过大了，把它再稀释，然后再做看看。是模板浓度过大引起的，可以看到曲线图中最高浓度的样品的Ct值很小。但是这张图也能用的，你调节一下基线范畴，把背景荧光压下去，这样以来图就美丽了就能分析了。 Q：刚做了一次real time PCR，成果解离曲线中浮现了负值 A：这个曲线反映的是随着温度的变化荧光值的变化速率。值越高，则此时PCR产物荧光值变化越快，也就是说PCR产物变性速度最快。当温度达到Tm值时，PCR产物迅速变性，荧光值急剧下降，表目前这张图上就是浮现一种峰。产物越纯，峰越窄，PCR产物越多，峰越高。这样看来，浮现负值表白此温度下PCR产物变性速度没有两边的温度是快。70-80度时，已经浮现变性，但是较为缓慢。但是你的产物看来不是特别纯，峰比较宽，也许要变化反映条件或者变化引物。