蛋白质核酸沉淀分离技术课件

蛋白质核酸沉淀分离技术课件沉淀分离技术沉淀分离技术第三章第三章蛋白质核酸沉淀分离技术课件n沉淀和结晶的区别沉淀和结晶的区别:形态形态 成分纯度成分纯度n 结晶结晶:同类分子或离子以规则排列形式析出；同类分子或离子以规则排列形式析出；n 沉淀沉淀:无序析出，纯度远低于结晶。无序析出，纯度远低于结晶。n操作方式可分操作方式可分连续法连续法或或间歇法间歇法两种，规模较小时，常两种，规模较小时，常采用间歇法。采用间歇法。蛋白质核酸沉淀分离技术课件n生物分子在水中形成稳定的溶液是有条件的，这生物分子在水中形成稳定的溶液是有条件的，这些就是溶液的各种理化参数。些就是溶液的各种理化参数。n任何能够影响这些条件的因素都会破坏溶液的稳任何能够影响这些条件的因素都会破坏溶液的稳定性。定性。n沉淀法就是沉淀法就是采用适当的措施改变溶液的理化参数，采用适当的措施改变溶液的理化参数，控制溶液的各种成分的溶解度控制溶液的各种成分的溶解度，从而将溶液中的，从而将溶液中的欲提取的成分和其它成分分开的技术。欲提取的成分和其它成分分开的技术。蛋白质核酸沉淀分离技术课件n沉淀法操作步骤沉淀法操作步骤：加入沉淀剂。加入沉淀剂。沉淀剂的陈化，促进粒子生长；沉淀剂的陈化，促进粒子生长；离心或过滤，收集沉淀物。离心或过滤，收集沉淀物。n加沉淀剂的方式和陈化条件对产物的纯度、加沉淀剂的方式和陈化条件对产物的纯度、收率和沉淀物的形状都有很大影响。收率和沉淀物的形状都有很大影响。蛋白质核酸沉淀分离技术课件 沉淀能否发生；沉淀能否发生；沉淀剂或沉淀条件下对活性结构是否有破坏作用；沉淀剂或沉淀条件下对活性结构是否有破坏作用；沉淀剂是否容易除去；沉淀剂是否容易除去；用于食品、医药产品的沉淀剂是否对人体有害。用于食品、医药产品的沉淀剂是否对人体有害。沉淀过程应考虑的问题沉淀过程应考虑的问题：蛋白质核酸沉淀分离技术课件n 沉淀技术分离生化产物的典型例子是沉淀技术分离生化产物的典型例子是蛋白质的分离提取蛋白质的分离提取 优点优点：设备简单、成本低、原材料易得、：设备简单、成本低、原材料易得、便于小批量生产；便于小批量生产；缺点缺点：所得沉淀物可能聚集有多种物质，：所得沉淀物可能聚集有多种物质，或含有大量的盐类，或包裹着溶剂，或含有大量的盐类，或包裹着溶剂，产品纯度常比结晶法低，产品纯度常比结晶法低，过滤也较困难。过滤也较困难。蛋白质核酸沉淀分离技术课件eg.从血浆中通过从血浆中通过5步沉淀生产纯度高达步沉淀生产纯度高达99%的免疫球蛋白的免疫球蛋白和和96%99%的白蛋白。的白蛋白。图图1 利用蛋白质沉淀大规模提纯白蛋白与免疫球蛋白的工艺流程图利用蛋白质沉淀大规模提纯白蛋白与免疫球蛋白的工艺流程图蛋白质核酸沉淀分离技术课件n 沉淀法分离蛋白质的特点：沉淀法分离蛋白质的特点：u生产前期可使原料液体体积很快减小生产前期可使原料液体体积很快减小1050倍，从而倍，从而简化生产工艺、降低生产费用简化生产工艺、降低生产费用；u使中间产物保持在一个使中间产物保持在一个中性温和的环境中性温和的环境；u可及早将目标蛋白从其与蛋白水解酶混合液中分离出可及早将目标蛋白从其与蛋白水解酶混合液中分离出来，来，避免蛋白质的降解，提高产物稳定性避免蛋白质的降解，提高产物稳定性；u用蛋白质沉淀法作为色谱分离的前处理技术，可用蛋白质沉淀法作为色谱分离的前处理技术，可使色使色谱分离使用的限制因素降低到最少谱分离使用的限制因素降低到最少。蛋白质核酸沉淀分离技术课件3.2 蛋白质的溶解特性蛋白质的溶解特性n蛋白质的溶解行为是一个独特的性质，由其组成、蛋白质的溶解行为是一个独特的性质，由其组成、构象以及分子周围的环境所决定。构象以及分子周围的环境所决定。n蛋白质在自然环境中通常是可溶的，所以其大部蛋白质在自然环境中通常是可溶的，所以其大部分是亲水的，但其内部大部分是疏水的。分是亲水的，但其内部大部分是疏水的。n一般而言，小分子蛋白质比起在化学上类似的大一般而言，小分子蛋白质比起在化学上类似的大分子蛋白质更易溶解。分子蛋白质更易溶解。蛋白质核酸沉淀分离技术课件图图2 蛋白质分子表面的憎水区域和荷电区域蛋白质分子表面的憎水区域和荷电区域蛋白质核酸沉淀分离技术课件蛋白质性质蛋白质性质溶液性质溶液性质分子大小分子大小溶剂可利用度（如：水）溶剂可利用度（如：水）氨基酸组成氨基酸组成 pH值值氨基酸序列氨基酸序列离子强度离子强度可离子化的残基数可离子化的残基数温度温度极性极性/非极性残基比率非极性残基比率极性极性/非极性残基分布非极性残基分布氨基酸残基的化学性质氨基酸残基的化学性质蛋白质结构蛋白质结构蛋白质电性蛋白质电性化学键性质化学键性质表表1 影响蛋白质溶解度的参数影响蛋白质溶解度的参数蛋白质核酸沉淀分离技术课件3.3 蛋白质胶体溶液的稳定性蛋白质胶体溶液的稳定性防止蛋白质凝聚沉淀的屏障：防止蛋白质凝聚沉淀的屏障：蛋白质周围的水化层（蛋白质周围的水化层（hydration shell)hydration shell)可可以使蛋白质形成稳定的胶体溶液。以使蛋白质形成稳定的胶体溶液。蛋白质分子间静电排斥作用。（存在双电层）蛋白质分子间静电排斥作用。（存在双电层）因此，可通过降低蛋白质周围的水化层和因此，可通过降低蛋白质周围的水化层和双电层厚度（双电层厚度（电位）降低蛋白质溶液的稳电位）降低蛋白质溶液的稳定性，实现蛋白质的沉淀。定性，实现蛋白质的沉淀。蛋白质核酸沉淀分离技术课件吸引力吸引力n颗粒间的相互作用颗粒间的相互作用n颗粒间的相互作用的位能取决于离子强度。颗粒间的相互作用的位能取决于离子强度。nVan der Waals Van der Waals 力力nKeeson Keeson 引力（偶极力）引力（偶极力）nDebye Debye 引力引力 （诱导力）（诱导力）nLondon London 引力引力 （色散力）是最重要的一种引力，因为所有（色散力）是最重要的一种引力，因为所有分子都是可以被极化的，所以它是普遍存在的。分子都是可以被极化的，所以它是普遍存在的。蛋白质核酸沉淀分离技术课件其他沉淀法其他沉淀法金属沉淀法金属沉淀法聚电解质沉淀法聚电解质沉淀法非离子型聚合物沉淀法非离子型聚合物沉淀法3.4 蛋白质沉淀方法蛋白质沉淀方法有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法等电点沉淀法等电点沉淀法中性盐盐析法中性盐盐析法蛋白质核酸沉淀分离技术课件一、中性盐沉淀法（盐析法）一、中性盐沉淀法（盐析法）盐浓度盐浓度Salting-in溶解度溶解度Salting-out蛋白质核酸沉淀分离技术课件 蛋白质和酶均易溶于水，分子中的蛋白质和酶均易溶于水，分子中的COOH、NH2和和OH等亲水基团，与极性水分子相互作用形成水化层，等亲水基团，与极性水分子相互作用形成水化层，包围于蛋白质分子周围形成包围于蛋白质分子周围形成，削弱了蛋白质分子，削弱了蛋白质分子之间的作用力，之间的作用力，蛋白质分子表面极性基团越多，水化层越蛋白质分子表面极性基团越多，水化层越厚，蛋白质分子与溶剂分子之间的亲和力越大，因而溶解厚，蛋白质分子与溶剂分子之间的亲和力越大，因而溶解度也越大度也越大。1、中性盐沉淀蛋白质的基本原理、中性盐沉淀蛋白质的基本原理亲水胶体在水中的稳定因素亲水胶体在水中的稳定因素 蛋白质核酸沉淀分离技术课件等点电时的蛋白质等点电时的蛋白质（亲水胶体）（亲水胶体）带负电荷蛋白质带负电荷蛋白质（亲水胶体）（亲水胶体）脱水脱水脱水脱水脱水脱水带负电荷蛋白质带负电荷蛋白质（疏水胶体）（疏水胶体）不稳定蛋白颗粒不稳定蛋白颗粒阴离子阴离子阳离子阳离子碱碱酸酸酸酸蛋白质聚集沉淀蛋白质聚集沉淀带正电荷蛋白质带正电荷蛋白质（亲水胶体）（亲水胶体）碱碱水化膜水化膜带正电荷蛋白质带正电荷蛋白质（疏水胶体）（疏水胶体）蛋白质核酸沉淀分离技术课件由于中性盐的亲水性大于蛋白质由于中性盐的亲水性大于蛋白质和酶分子的亲水性，所以加入大和酶分子的亲水性，所以加入大量中性盐后，量中性盐后，夺走了水分子夺走了水分子，破，破坏了水化膜，暴露出疏水区域。坏了水化膜，暴露出疏水区域。同时又同时又中和了电荷中和了电荷，破坏了亲水，破坏了亲水胶体，蛋白质分子即形成沉淀。胶体，蛋白质分子即形成沉淀。蛋白质核酸沉淀分离技术课件选用盐析用盐的几点考虑：选用盐析用盐的几点考虑：n盐析作用要强盐析作用要强n盐析用盐需有较大的溶解度盐析用盐需有较大的溶解度n盐析用盐必须是惰性的盐析用盐必须是惰性的n来源丰富、经济来源丰富、经济2、中性盐的选择、中性盐的选择蛋白质核酸沉淀分离技术课件阴离子：阴离子：柠檬酸根柠檬酸根-3酒石酸根酒石酸根-3 F-I03-H2P04-S04-CH3C00-Cl-Cl03-Br-N03-Cl04-I-CNS-阳离子：阳离子：Th4+Al3+H+Ba2+Sr2+Ca2+Cs+Rb+NH4+K+Na+Li+Hofmeister对一系列离子沉淀蛋白质的能力对一系列离子沉淀蛋白质的能力进行排序，称进行排序，称Hofmeister序列序列，或感胶离子序。，或感胶离子序。蛋白质核酸沉淀分离技术课件 常用于蛋白质沉淀的盐为硫酸铵和硫酸钠。常用于蛋白质沉淀的盐为硫酸铵和硫酸钠。硫酸钠硫酸钠虽无腐虽无腐蚀性但蚀性但低于低于40400 0C C就不易溶解就不易溶解，因此只适用于热稳定性较好的蛋，因此只适用于热稳定性较好的蛋白质的沉淀过程。白质的沉淀过程。02080100（NH4)2SO470.675.495.3103Na2SO44.918.943.342.2NaH2PO41.67.893.8101蛋白质核酸沉淀分离技术课件（1）溶解度大）溶解度大（2）分离效果好）分离效果好（3）不易引起变性，有稳定酶与蛋白质结构的作用。）不易引起变性，有稳定酶与蛋白质结构的作用。（4）价格便宜，废液不污染环境。）价格便宜，废液不污染环境。最常用的盐：最常用的盐：硫酸铵硫酸铵缓冲能力弱，具腐蚀性，含缓冲能力弱，具腐蚀性，含N蛋白质核酸沉淀分离技术课件（1）加入固体盐法）加入固体盐法3、盐析的操作方法盐析的操作方法适用：饱和度高，不增大溶液体积适用：饱和度高，不增大溶液体积加入硫酸铵固体的量：查表、计算加入硫酸铵固体的量：查表、计算饱和度饱和度：在给定条件下以可能达到的最大浓度的百分数表示的盐在给定条件下以可能达到的最大浓度的百分数表示的盐浓度。浓度。蛋白质核酸沉淀分离技术课件蛋白质核酸沉淀分离技术课件蛋白质核酸沉淀分离技术课件（1）加入固体盐法）加入固体盐法2025g：加入固体硫酸铵的质量：加入固体硫酸铵的质量S2：所需达到的硫酸铵饱和度：所需达到的硫酸铵饱和度S1：原溶液的硫酸铵饱和度：原溶液的硫酸铵饱和度蛋白质核酸沉淀分离技术课件适用：蛋白质溶液体适用：蛋白质溶液体积不大，所需调整的积不大，所需调整的硫酸铵浓度不高。硫酸铵浓度不高。V：所需加进的饱和硫酸铵溶液的体积；：所需加进的饱和硫酸铵溶液的体积；V0：原溶液体积；：原溶液体积；S2：所需达到的硫酸铵饱和度；：所需达到的硫酸铵饱和度；S1：原溶液的硫酸铵饱和度。：原溶液的硫酸铵饱和度。饱和硫酸铵的配制方法饱和硫酸铵的配制方法 在一定量的水中加入在一定量的水中加入过量的硫酸铵，加热至过量的硫酸铵，加热至50506060，趁热滤去沉淀，趁热滤去沉淀，再在再在00或室温平衡或室温平衡1 12 2天，有固体析出时达天，有固体析出时达100100饱和度。饱和度。蛋白质核酸沉淀分离技术课件优点优点 硫酸铵浓度变化连硫酸铵浓度变化连续，盐析效果较好。续，盐析效果较好。缺点缺点 硫酸铵饱和度的测硫酸铵饱和度的测定、计算工作手续繁定、计算工作手续繁琐，而且透析袋容积琐，而且透析袋容积有限、盐析速度慢、有限、盐析速度慢、硫酸铵耗费大。硫酸铵耗费大。（3）透析平衡法）透析平衡法 蛋白质核酸沉淀分离技术课件方法一方法一：取料液分成等体积几份，冷却至：取料液分成等体积几份，冷却至004、盐析曲线的制作、盐析曲线的制作 各级均离心分离沉淀物，将沉淀溶于各级均离心分离沉淀物，将沉淀溶于2 2倍体积的缓冲液中，测倍体积的缓冲液中，测定其中定其中总蛋白总蛋白和和目标蛋白目标蛋白浓度（或测定离心上清液）浓度（或测定离心上清液）以饱和度为横坐标，沉淀（或上清液）中总蛋白和目标蛋白浓以饱和度为横坐标，沉淀（或上清液）中总蛋白和目标蛋白浓度为纵坐标，得到蛋白质溶解度曲线度为纵坐标，得到蛋白质溶解度曲线 蛋白质核酸沉淀分离技术课件蛋白质量蛋白质量(mg)或酶或酶活力活力硫酸铵饱和度硫酸铵饱和度蛋白质量蛋白质量(mg)或酶或酶活力活力硫酸铵饱和度硫酸铵饱和度蛋白质核酸沉淀分离技术课件方法二方法二各级均离心分离沉淀物，将沉淀溶于各级均离心分离沉淀物，将沉淀溶于2 2倍体积的缓冲液中，测倍体积的缓冲液中，测定其中定其中总蛋白总蛋白和和目标蛋白目标蛋白浓度浓度以饱和度为横坐标，总蛋白和目标蛋白浓度为纵坐标，得到蛋以饱和度为横坐标，总蛋白和目标蛋白浓度为纵坐标，得到蛋白质溶解度曲线白质溶解度曲线 蛋白质核酸沉淀分离技术课件蛋白质量蛋白质量(mg)或酶或酶活力活力硫酸铵饱和度硫酸铵饱和度蛋白质量蛋白质量(mg)或酶或酶活力活力硫酸铵饱和度硫酸铵饱和度蛋白质核酸沉淀分离技术课件5、盐析的影响因素、盐析的影响因素（1）离离子子强强度度与与离离子子类类型型S：离子强度为：离子强度为I时蛋白质的溶解度；时蛋白质的溶解度；S0：离子强度为：离子强度为0时蛋白质的溶解度；时蛋白质的溶解度；KS：盐析常数。：盐析常数。盐析时，蛋白质溶解度与中性盐的离子强度的关系：盐析时，蛋白质溶解度与中性盐的离子强度的关系：当溶剂的温度一定时，对当溶剂的温度一定时，对于某一溶质，于某一溶质，S0是一常数是一常数（溶解度常数）（溶解度常数）蛋白质核酸沉淀分离技术课件KS越大，有效成分溶解度随盐浓度增加而减小的程度越大。越大，有效成分溶解度随盐浓度增加而减小的程度越大。KS越大，分级范围越小，盐析效果越好。越大，分级范围越小，盐析效果越好。多价阴离子具有很高的多价阴离子具有很高的KS，但高价阳离子的存在反而降低，但高价阳离子的存在反而降低KS；大而不规则的蛋白分子大而不规则的蛋白分子KS越大。越大。KS主要取决于盐的性质：主要取决于盐的性质：离子价数离子价数离子半径离子半径介电常数介电常数KS几种盐的盐析能力的排列次序：几种盐的盐析能力的排列次序：磷酸钾磷酸钾硫酸钠硫酸钠磷酸铵磷酸铵柠檬酸钠柠檬酸钠硫酸镁硫酸镁蛋白质核酸沉淀分离技术课件1纤维蛋白纤维蛋白2血红蛋白血红蛋白3拟球蛋白拟球蛋白4血清蛋白血清蛋白5肌红蛋白肌红蛋白几种蛋白盐析时离子强度与溶解度的关系图几种蛋白盐析时离子强度与溶解度的关系图 蛋白质核酸沉淀分离技术课件KS分段盐析法分段盐析法分段盐析法分段盐析法 在一定在一定pH、温度条件下，改变离子强度。、温度条件下，改变离子强度。适用于早期粗提阶段的分步分离。适用于早期粗提阶段的分步分离。在一定离子强度下，改变在一定离子强度下，改变pH、温度。适、温度。适于后期分离纯化和精制。于后期分离纯化和精制。蛋白质核酸沉淀分离技术课件（2）蛋蛋白白质质浓浓度度硫酸铵盐析法测定羧基肌红蛋白：硫酸铵盐析法测定羧基肌红蛋白：蛋白质浓度蛋白质浓度g/L硫酸铵饱和度硫酸铵饱和度%结果结果3058开始沉淀开始沉淀366开始沉淀开始沉淀306590%沉淀析出沉淀析出当蛋白浓度增加当蛋白浓度增加10倍时，盐析时倍时，盐析时所需硫酸铵的饱和度约减小所需硫酸铵的饱和度约减小7%。适宜蛋白质浓度是适宜蛋白质浓度是2.53.0（25 mg/mL30mg/mL）蛋白质核酸沉淀分离技术课件（3）pH的的影影响响 蛋白质所带净电荷越多，它的溶解度就越大。蛋白质所带净电荷越多，它的溶解度就越大。改变改变pH值可改变蛋白质的带电性质，因而就改变值可改变蛋白质的带电性质，因而就改变了蛋白质的溶解度。远离等电点处溶解度大，在等了蛋白质的溶解度。远离等电点处溶解度大，在等电点处溶解度小，因此用中性盐沉淀蛋白质时，电点处溶解度小，因此用中性盐沉淀蛋白质时，pH值常选在该蛋白质的等电点附近值常选在该蛋白质的等电点附近。在水或稀盐溶液中测得的等电点在水或稀盐溶液中测得的等电点与在高盐溶液中测得的等电点结果可与在高盐溶液中测得的等电点结果可能不一样能不一样 蛋白质核酸沉淀分离技术课件（4）温温度度的的影影响响 温度是影响溶解度的重要因素，对于多数无机盐温度是影响溶解度的重要因素，对于多数无机盐和小分子有机物，温度升高溶解度加大。和小分子有机物，温度升高溶解度加大。但对于蛋白质、酶和多肽等生物大分子，在高离但对于蛋白质、酶和多肽等生物大分子，在高离子强度溶液中，温度升高，它们的溶解度反而减小。子强度溶液中，温度升高，它们的溶解度反而减小。在低离子强度溶液或纯水中蛋白质的溶解度大多数还在低离子强度溶液或纯水中蛋白质的溶解度大多数还是随温度升高而增加的。是随温度升高而增加的。在一般情况下，对蛋白质盐析的温度要求不严格，在一般情况下，对蛋白质盐析的温度要求不严格，可在室温下进行。但对于某些对温度敏感的酶，要求可在室温下进行。但对于某些对温度敏感的酶，要求在在04下操作，以避免活力丧失。下操作，以避免活力丧失。蛋白质核酸沉淀分离技术课件1）注意饱和度表中规定的温度；）注意饱和度表中规定的温度；2）分段盐析中，应考虑每次分段后蛋白质浓度的变化；）分段盐析中，应考虑每次分段后蛋白质浓度的变化；3）盐析后一般放置半小时至一小时，待沉淀完全后才过滤）盐析后一般放置半小时至一小时，待沉淀完全后才过滤或离心；或离心；4）加入硫酸铵时应注意搅拌，避免局部过浓；）加入硫酸铵时应注意搅拌，避免局部过浓；5）硫酸铵使用前须用）硫酸铵使用前须用H2S处理，高浓度的硫酸铵溶液使用处理，高浓度的硫酸铵溶液使用前需用氨水或硫酸调节至所需前需用氨水或硫酸调节至所需pH。6、注意事项、注意事项 蛋白质核酸沉淀分离技术课件 蛋白质等电点沉淀法是基于不同蛋白蛋白质等电点沉淀法是基于不同蛋白质离子具有不同等电点这一特性，依次改质离子具有不同等电点这一特性，依次改变溶液变溶液pHpH值的办法，将杂蛋白沉淀除去，值的办法，将杂蛋白沉淀除去，最后获得目标产物。最后获得目标产物。二、等电点沉淀法二、等电点沉淀法 蛋白质核酸沉淀分离技术课件（1）适用于疏水性强的蛋白质）适用于疏水性强的蛋白质（2）中性盐浓度增大时，等电点向偏酸方向移动，）中性盐浓度增大时，等电点向偏酸方向移动，同时最低溶解度会有所增大。同时最低溶解度会有所增大。（3）无机酸通常价格便宜，无毒）无机酸通常价格便宜，无毒（4）蛋白质对低）蛋白质对低pH 敏感，易失活敏感，易失活蛋白质核酸沉淀分离技术课件未沉淀蛋白质的分率未沉淀蛋白质的分率pH对大豆蛋白质溶解度的影响对大豆蛋白质溶解度的影响蛋白质核酸沉淀分离技术课件利用等电点除杂蛋白时必须利用等电点除杂蛋白时必须了解制备物对酸碱的稳定性了解制备物对酸碱的稳定性，不然盲目使用十分危险。不少蛋白质与金属离子结合后，不然盲目使用十分危险。不少蛋白质与金属离子结合后，等电点会发生偏移，故等电点会发生偏移，故溶液中含有金属离子时，必须注意溶液中含有金属离子时，必须注意调整调整PH值值。由于许多蛋白质的等电点十分接近，而且带有水膜的蛋白由于许多蛋白质的等电点十分接近，而且带有水膜的蛋白质等生物大分子仍有一定的溶解度，不能完全沉淀析出，质等生物大分子仍有一定的溶解度，不能完全沉淀析出，因此，因此，单独使用此法分辨率较低，效果不理想单独使用此法分辨率较低，效果不理想。主要用于在分离纯化流程中去除杂蛋白主要用于在分离纯化流程中去除杂蛋白蛋白质核酸沉淀分离技术课件例如：工业上生产胰岛素例如：工业上生产胰岛素粗提液粗提液调调PH8.0调调PH3.0去除碱性蛋白质去除碱性蛋白质去除酸性蛋白质去除酸性蛋白质胰岛素胰岛素蛋白质核酸沉淀分离技术课件三、有机溶剂沉淀法三、有机溶剂沉淀法 许多能与水互溶的有机溶剂如乙醇、丙酮、许多能与水互溶的有机溶剂如乙醇、丙酮、甲醇和乙腈，常用于低盐浓度下沉淀蛋白质甲醇和乙腈，常用于低盐浓度下沉淀蛋白质。蛋白质核酸沉淀分离技术课件加入溶剂后会加入溶剂后会使水溶液的介电常数降低使水溶液的介电常数降低，而使蛋白质分，而使蛋白质分子间的静电引力增大，导致凝集和沉淀。子间的静电引力增大，导致凝集和沉淀。蛋白质的溶剂化蛋白质的溶剂化，使原来和蛋白质结合的水被溶剂所取，使原来和蛋白质结合的水被溶剂所取代，从而降低了它们的溶解度。代，从而降低了它们的溶解度。有机溶剂有机溶剂可能破坏了蛋白质的某种键可能破坏了蛋白质的某种键如氢键，使其空间如氢键，使其空间结构发生某种程度的变化，致使一些原来包在内部的疏结构发生某种程度的变化，致使一些原来包在内部的疏水基团暴露于表面并与有机溶剂的疏水基团结合形成疏水基团暴露于表面并与有机溶剂的疏水基团结合形成疏水层，从而使蛋白质沉淀。水层，从而使蛋白质沉淀。机理分析进展机理分析进展蛋白质核酸沉淀分离技术课件 对某些具有生物活性的大分子容易引起变对某些具有生物活性的大分子容易引起变性失活，操作需在低温下进行。成本高。性失活，操作需在低温下进行。成本高。分辨能力比盐析法高，即一种蛋白质或其他分辨能力比盐析法高，即一种蛋白质或其他溶质只在一个比较窄的有机溶剂浓度范围内沉淀。溶质只在一个比较窄的有机溶剂浓度范围内沉淀。沉淀不用脱盐，过滤比较容易（如有必要，沉淀不用脱盐，过滤比较容易（如有必要，可用透析袋脱有机溶剂）。可用透析袋脱有机溶剂）。蛋白质核酸沉淀分离技术课件2、有机溶剂的选择和浓度的计算、有机溶剂的选择和浓度的计算 不同有机溶剂沉淀蛋白质的效率受多方面的影响，需通过不同有机溶剂沉淀蛋白质的效率受多方面的影响，需通过试验加以选择。大致上以试验加以选择。大致上以丙酮最佳，乙醇次之，甲醇更次丙酮最佳，乙醇次之，甲醇更次。前提：能与水互溶前提：能与水互溶蛋白质核酸沉淀分离技术课件离子强度离子强度 3、有机溶剂沉淀的影响因素、有机溶剂沉淀的影响因素 温度温度 样品浓度样品浓度 pHpH值值 蛋白质核酸沉淀分离技术课件四、非离子多聚物沉淀法四、非离子多聚物沉淀法 20世纪世纪60年代非离子型聚合物开始用于分离年代非离子型聚合物开始用于分离血纤维蛋白原和免疫球蛋白，从此高相对分子质血纤维蛋白原和免疫球蛋白，从此高相对分子质量非离子聚合物沉淀蛋白质的方法被广泛使用，量非离子聚合物沉淀蛋白质的方法被广泛使用，如：如：聚乙二醇（聚乙二醇（PEG）、聚乙烯吡咯烷酮）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、葡聚糖）、葡聚糖等。等。蛋白质核酸沉淀分离技术课件u沉淀作用是聚合物与生物大分子发生沉淀作用是聚合物与生物大分子发生共沉淀共沉淀作用。作用。u由于聚合物有较强的亲水性，使生物大分子由于聚合物有较强的亲水性，使生物大分子脱水脱水而发而发生沉淀。生沉淀。u聚合物与生物大分子之间聚合物与生物大分子之间以氢键相互作用形成复合物以氢键相互作用形成复合物，在重力作用下形成沉淀析出。在重力作用下形成沉淀析出。u通过通过空间位置排斥空间位置排斥，使液体中生物大分子被迫挤聚在，使液体中生物大分子被迫挤聚在一起而发生沉淀。一起而发生沉淀。非离子多聚物沉淀蛋白的原理非离子多聚物沉淀蛋白的原理 蛋白质核酸沉淀分离技术课件 操作条件温和，不易引起生物大分子变性。操作条件温和，不易引起生物大分子变性。沉淀效能高，使用很少量的沉淀效能高，使用很少量的PEG即可以沉淀即可以沉淀相当多的生物大分子。相当多的生物大分子。沉淀后有机聚合物较难去除。沉淀后有机聚合物较难去除。特特 点：点：蛋白质核酸沉淀分离技术课件1）选用）选用两种水溶性非离子多聚物两种水溶性非离子多聚物组成液液两相体组成液液两相体系，不等量分配，而造成分离。系，不等量分配，而造成分离。2）选用）选用一种水溶性非离子多聚物一种水溶性非离子多聚物，使生物大分子，使生物大分子在同一液相中，由于被排斥相互凝聚而沉淀析出。在同一液相中，由于被排斥相互凝聚而沉淀析出。方方 法法 蛋白质核酸沉淀分离技术课件 聚电解质是含有重复离子化基团的水溶性聚合物，可聚电解质是含有重复离子化基团的水溶性聚合物，可用于蛋白质沉淀的聚电解质有用于蛋白质沉淀的聚电解质有聚丙烯酸、聚乙烯亚胺、羧甲聚丙烯酸、聚乙烯亚胺、羧甲基纤维素和离子型多糖基纤维素和离子型多糖如肝素等。如肝素等。沉淀机理沉淀机理五、聚电解质沉淀法五、聚电解质沉淀法 蛋白质分子的相反电荷与聚电解质结合，形成一个多蛋白质分子的相反电荷与聚电解质结合，形成一个多分子络合物，当络合物超过游离蛋白质的溶解度极限值时，分子络合物，当络合物超过游离蛋白质的溶解度极限值时，就发生沉淀。就发生沉淀。蛋白质核酸沉淀分离技术课件六、生成盐复合物沉淀法六、生成盐复合物沉淀法 金属复合盐法金属复合盐法有机盐法有机盐法无机复合盐法无机复合盐法蛋白质核酸沉淀分离技术课件u能与能与羧基、胺基等含氮化合物以及含氮杂环化合物羧基、胺基等含氮化合物以及含氮杂环化合物强烈强烈结合的金属离子，如：结合的金属离子，如：Mn2+、Fe2+、Co2+、Ni2+、Cu2+、Zn2+、Cd2+；u能与能与羧酸结合而不与含氮化合物结合羧酸结合而不与含氮化合物结合的金属离子，如：的金属离子，如：Ca2+、Ba2+、Mg2+、Pb2+；u与与巯基化合物巯基化合物强烈结合的金属离子，如：强烈结合的金属离子，如：Hg2+、Ag+、Pb2+。金属离子沉淀蛋白质可分为三类：金属离子沉淀蛋白质可分为三类：实际使用时，金属离子的浓度常为实际使用时，金属离子的浓度常为0.02 mol/L。蛋白质核酸沉淀分离技术课件ZnZn2+2+沉淀尿激酶沉淀尿激酶蛋白质核酸沉淀分离技术课件有机盐法有机盐法无机复合盐法无机复合盐法含氮有机酸如苦味酸、苦酮含氮有机酸如苦味酸、苦酮酸、鞣酸等能与有机分子的酸、鞣酸等能与有机分子的碱性功能团形成复合物而沉碱性功能团形成复合物而沉淀析出，沉淀后用乙醚除去淀析出，沉淀后用乙醚除去有机酸。有机酸。如细胞色素如细胞色素C用用45%硫酸铵除杂后，硫酸铵除杂后，用用20%TCA即可将即可将其沉淀。其沉淀。如磷钨酸盐、磷钼酸盐等。如磷钨酸盐、磷钼酸盐等。可加入乙醚或采用离子交换除去无机盐。可加入乙醚或采用离子交换除去无机盐。蛋白质核酸沉淀分离技术课件七、其他沉淀法七、其他沉淀法 1、选择性变性法、选择性变性法 p 选择一定的条件使溶液中存在的某些选择一定的条件使溶液中存在的某些杂蛋白杂蛋白等杂质变性等杂质变性沉淀下来，而与目的物分开，这种分离方法就称为沉淀下来，而与目的物分开，这种分离方法就称为选择选择性变性沉淀法。性变性沉淀法。蛋白质核酸沉淀分离技术课件2、亲和沉淀、亲和沉淀 利用蛋白质与特定的生物或合成的分子之间高度专一利用蛋白质与特定的生物或合成的分子之间高度专一的作用而设计出来的一种特殊选择性的分离技术，其沉淀原的作用而设计出来的一种特殊选择性的分离技术，其沉淀原理是理是依据依据“吸附吸附”有特殊蛋白质的聚合物的溶解度的大小有特殊蛋白质的聚合物的溶解度的大小。引导产生沉淀的方法有：引导产生沉淀的方法有：u离子交联离子交联u加入带相反电荷的聚合物加入带相反电荷的聚合物u加入带相反电荷的疏水基团加入带相反电荷的疏水基团u改变改变pH值，诱导产生疏水沉淀值，诱导产生疏水沉淀u温度诱导产生沉淀温度诱导产生沉淀蛋白质核酸沉淀分离技术课件配基配基-载体复合物与目的蛋白质的分离载体复合物与目的蛋白质的分离基本过程：基本过程：亲和结合亲和结合 洗洗 涤涤 初始阶段：将一个目标蛋白质初始阶段：将一个目标蛋白质与键合在可溶性载体上的亲和与键合在可溶性载体上的亲和配体络合成沉淀；配体络合成沉淀；所得沉淀物用一种适当的所得沉淀物用一种适当的缓冲溶液进行洗涤，洗去缓冲溶液进行洗涤，洗去可能存在的杂质可能存在的杂质用一种适当的用一种适当的试剂将目标蛋试剂将目标蛋白质从配体中白质从配体中离解出来离解出来蛋白质核酸沉淀分离技术课件3.4 核酸的沉淀方法核酸的沉淀方法 核酸分离纯化应维持在核酸分离纯化应维持在0-4的低温的低温条件下，条件下，以防止核酸的变性和降解。以防止核酸的变性和降解。为防止核酸酶引起的水解作用，可加入为防止核酸酶引起的水解作用，可加入十十二烷基硫酸钠二烷基硫酸钠(SDS)、乙二胺四乙酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、8-羟基喹啉、柠檬酸钠羟基喹啉、柠檬酸钠等以抑制核酸酶的活性。等以抑制核酸酶的活性。蛋白质核酸沉淀分离技术课件有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法等电点沉淀法等电点沉淀法钙盐沉淀法钙盐沉淀法溶剂沉淀法溶剂沉淀法常用的沉淀分离法有：常用的沉淀分离法有：蛋白质核酸沉淀分离技术课件1 1、有机溶剂沉淀法、有机溶剂沉淀法 由于核酸都不溶于有机溶剂，所以由于核酸都不溶于有机溶剂，所以可在核酸提取液中加可在核酸提取液中加入乙醇、异丙醇或入乙醇、异丙醇或2-2-乙氧基乙醇，使乙氧基乙醇，使DNADNA或或RNARNA沉淀下来沉淀下来。核酸沉淀的形状与其相对分子质量密切相关：核酸沉淀的形状与其相对分子质量密切相关：相对分子质量相对分子质量106Da106Da的双链的双链DNADNA可以可以丝状纤维丝状纤维缠绕在玻棒缠绕在玻棒上；上；相对分子质量稍小的双链相对分子质量稍小的双链DNADNA或单链或单链DNADNA、RNARNA则以则以凝胶形凝胶形式式存在。存在。这些核酸经离心后存在于沉淀中，用这些核酸经离心后存在于沉淀中，用70%70%乙醇乙醇洗涤，除去洗涤，除去其它盐和小分子物质，干燥后即为核酸制品。其它盐和小分子物质，干燥后即为核酸制品。蛋白质核酸沉淀分离技术课件2 2、等电点沉淀法、等电点沉淀法脱氧核糖核蛋白脱氧核糖核蛋白的等电点为的等电点为pH 4.2；核糖核蛋白核糖核蛋白的等电点力的等电点力pH 2.0-2.5；tRNA的等电点为的等电点为pH 5。蛋白质核酸沉淀分离技术课件3、钙盐沉淀法、钙盐沉淀法蛋白质核酸沉淀分离技术课件4、选择性溶剂沉淀法、选择性溶剂沉淀法 在核酸提取液中加入氯仿在核酸提取液中加入氯仿/异戊醇或氯仿异戊醇或氯仿/辛醇，振荡辛醇，振荡一段时间，使一段时间，使蛋白质在氯仿蛋白质在氯仿/水界面上形成凝胶状沉淀水界面上形成凝胶状沉淀而离心而离心除去，除去，核酸仍留在水溶液中核酸仍留在水溶液中。在对氨基水杨酸等阴离子化合物存在下，核酸的苯酚在对氨基水杨酸等阴离子化合物存在下，核酸的苯酚水溶液提取液中，水溶液提取液中，DNA和和RNA都进入水层都进入水层，而，而蛋白质沉淀于蛋白质沉淀于苯酚层中苯酚层中被分离除去。被分离除去。在在DNA与与RNA的混合液中，用的混合液中，用异丙醇选择性地沉淀异丙醇选择性地沉淀DNA而与而与留在溶液中的留在溶液中的RNA分离。分离。蛋白质核酸沉淀分离技术课件沉淀法应用沉淀法应用n利用蛋白质沉淀大规模提纯蛋白与免疫球蛋利用蛋白质沉淀大规模提纯蛋白与免疫球蛋白的工艺白的工艺n柠檬酸的生产柠檬酸的生产n萃取萃取 一沉淀法提取分离茶多酚一沉淀法提取分离茶多酚蛋白质核酸沉淀分离技术课件标准沉淀法回收柠檬酸流程图标准沉淀法回收柠檬酸流程图加热到加热到7070度度蛋白质核酸沉淀分离技术课件