大肠杆菌感受态细胞的置备与质粒转化.ppt

大肠杆菌感受态细胞的制备与转化,一.实验目的通过本实验，学习大肠杆菌感受态细胞制备和转化的原理与技术方法。,二.实验原理感受态细胞(Competentcells):受体细胞经过一些特殊方法处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能使许多有外源DNA的载体分子通过的感受态细胞(competentcell)。,转化（transformation）：是将异源DNA分子引入受体细胞，使其获得新的遗传性状的一种技术方法。进入细胞的DNA分子通过复制表达，才能实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。,大肠杆菌转化的方法：化学法：使用化学试剂（如CaCl2）制备的感受态细胞，通过热击处理将载体DNA分子导入受体细胞；电转化法：通过高压脉冲的作用将载体DNA分子导入受体细胞。,转化子的筛选：利用导入的DNA上的选择性标记，区分转化子与非转化子。选择性标记主要有两类：营养筛选标记抗性筛选标记,三实验方法,1挑取大肠杆菌DH5单菌落，接于5mLLB液体培养基中37振荡培养过夜2以1:50比例将1ml菌液转移到新鲜LB液体培养基中，37振荡培养1.52hr左右，使A600在0.40.5左右,3将培养液4ml转移到5ml离心管中，4，2000g离心3min4弃上清，加0.5mL用冰预冷的0.1MCaCl2溶液，轻轻吹打或摇动混匀细胞注意：加入CaCl2动作需轻柔，勿剧烈震荡，并且尽量使细胞处于低温中,5冰上放置20min，2000g离心2min6弃上清，加0.1ml预冷的0.1MCaCl2溶液，轻轻吹打或摇动混匀细胞，即得感受态细胞注意：离心后观察沉淀，如果出现中间空心的沉淀说明操作正常,7将取0.1ml感受态细胞转移到1.5ml离心管中，加2l质粒，混匀，冰上放置30min842水浴90秒,在冰上放置2min9加入0.5ml新鲜LB培养基，37，200rpm振荡约30min45min（注：转纯质粒可省略，转连接产物需进行）10.取100l涂布到含有氨苄青霉素的平板上,加X-gal/IPTG各3L11倒置平皿，37培养1216h,每个平板大约20ml的培养基,平板培养基,用CaCl2法制备的感受态细胞，可使每微克超螺旋质粒DNA产生5106-2107个转化菌落。在实际工作中，每微克有105以上的转化菌落足以满足一般的克隆实验。,