qPCR优化课件

qPCR的优化的优化邓椋爻 技术支持广州昊洋贸易有限公司www.bio- 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009以Real-time PCR为关键词在 NCBI Pubmed 检索结果www.bio- 目标序列分析 二级结构分析 温度梯度优化实验条件 标准曲线验证www.bio- cDNA sequence 目标基因：CCL26（人脐静脉内皮细胞HUVEC ）CTGGAATTGA GGCTGAGCCA AAGACCCCAG GGCCGTCTCA GTCTCATAAAAGGGGATCAG GCAGGAGGAG TTTGGGAGAA ACCTGAGAAG GGCCTGATTTGCAGCATCAT GATGGGCCTC TCCTTGGCCT CTGCTGTGCT CCTGGCCTCCCTCCTGAGTC TCCACCTTGG AACTGCCACA CGTGGGAGTG ACATATCCAAGACCTGCTGC TTCCAATACA GCCACAAGCC CCTTCCCTGG ACCTGGGTGCGAAGCTATGA ATTCACCAGT AACAGCTGCT CCCAGCGGGC TGTGATATTCACTACCAAAA GAGGCAAGAA AGTCTGTACC CATCCAAGGA AAAAATGGGTGCAAAAATAC ATTTCTTTAC TGAAAACTCC GAAACAATTG TGACTCAGCTGAATTTTCAT CCGAGGACGC TTGGACCCCG CTCTTGGCTC TGCAGCCCTCTGGGGAGCCT GCGGAATCTT TTCTGAAGGC TACATGGACC CGCTGGGGAGGAGAGGGTGT TTCCTCCCAG AGTTACTTTA ATAAAGGTTG TTCATAGAGTTGACTTGTTC ATwww.bio- to designing primers, its a good idea to run a sequence homology analysis. (BLAST)This allows the identification of sequences that may co-amplify or interfere with our intended target.The data is freely available, so why not make use of it.http:/blast.ncbi.nlm.nih.gov www.bio- GGCTGAGCCA AAGACCCCAG GGCCGTCTCA GTCTCATAAAAGGGGATCAG GCAGGAGGAG TTTGGGAGAA ACCTGAGAAG GGCCTGATTTGCAGCATCAT GATGGGCCTC TCCTTGGCCT CTGCTGTGCT CCTGGCCTCCCTCCTGAGTC TCCACCTTGG AACTGCCACA CGTGGGAGTG ACATATCCAAGACCTGCTGC TTCCAATACA GCCACAAGCC CCTTCCCTGG ACCTGGGTGCGAAGCTATGA ATTCACCAGT AACAGCTGCT CCCAGCGGGC TGTGATATTCACTACCAAAA GAGGCAAGAA AGTCTGTACC CATCCAAGGA AAAAATGGGTGCAAAAATAC ATTTCTTTAC TGAAAACTCC GAAACAATTG TGACTCAGCTGAATTTTCAT CCGAGGACGC TTGGACCCCG CTCTTGGCTC TGCAGCCCTCTGGGGAGCCT GCGGAATCTT TTCTGAAGGC TACATGGACC CGCTGGGGAGGAGAGGGTGT TTCCTCCCAG AGTTACTTTA ATAAAGGTTG TTCATAGAGTTGACTTGTTC ATCCL26 序列比序列比对对www.bio- GGCTGAGCCA AAGACCCCAG GGCCGTCTCA GTCTCATAAAAGGGGATCAG GCAGGAGGAG TTTGGGAGAA ACCTGAGAAG GGCCTGATTTGCAGCATCAT GATGGGCCTC TCCTTGGCCT CTGCTGTGCT CCTGGCCTCCCTCCTGAGTC TCCACCTTGG AACTGCCACA CGTGGGAGTG ACATATCCAAGACCTGCTGC TTCCAATACA GCCACAAGCC CCTTCCCTGG ACCTGGGTGCGAAGCTATGA ATTCACCAGT AACAGCTGCT CCCAGCGGGC TGTGATATTCACTACCAAAA GAGGCAAGAA AGTCTGTACC CATCCAAGGA AAAAATGGGTGCAAAAATAC ATTTCTTTAC TGAAAACTCC GAAACAATTG TGACTCAGCTGAATTTTCAT CCGAGGACGC TTGGACCCCG CTCTTGGCTC TGCAGCCCTCTGGGGAGCCT GCGGAATCTT TTCTGAAGGC TACATGGACC CGCTGGGGAGGAGAGGGTGT TTCCTCCCAG AGTTACTTTA ATAAAGGTTG TTCATAGAGTTGACTTGTTC ATCCL26 序列比序列比对对www.bio- 目标序列分析 二级结构分析 温度梯度优化实验条件 标准曲线验证www.bio- Secondary StructuresBad location for primershttp:/bioinfo.math.rpi.edu/mfold/applicationsGood location for primers55C65Cwww.bio- case -二级结构的影响及引物位置Forward PrimerReverse Primer APrimer BReverse Primer B Primer B: h h = 95.8 % Primer A: h h = 66.3 %Primer Awww.bio- Primers - singleplex assaysDesigns Internal OligosProvides multiple outputsFree Web software provided by Steve Rozen and Whitehead Institute for Biomedical Research. http:/frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgiPrimer Design www.bio- GGCTGAGCCA AAGACCCCAG GGCCGTCTCA GTCTCATAAAAGGGGATCAG GCAGGAGGAG TTTGGGAGAA ACCTGAGAAG GGCCTGATTTGCAGCATCAT GATGGGCCTC TCCTTGGCCT CTGCTGTGCT CCTGGCCTCCCTCCTGAGTC TCCACCTTGG AACTGCCACA CGTGGGAGTG ACATATCCAAGACCTGCTGC TTCCAATACA GCCACAAGCC CCTTCCCTGG ACCTGGGTGCGAAGCTATGA ATTCACCAGT AACAGCTGCT CCCAGCGGGC TGTGATATTCACTACCAAAA GAGGCAAGAA AGTCTGTACC CATCCAAGGA AAAAATGGGTGCAAAAATAC ATTTCTTTAC TGAAAACTCC GAAACAATTG TGACTCAGCTGAATTTTCAT CCGAGGACGC TTGGACCCCG CTCTTGGCTC TGCAGCCCTCTGGGGAGCCT GCGGAATCTT TTCTGAAGGC TACATGGACC CGCTGGGGAGGAGAGGGTGT TTCCTCCCAG AGTTACTTTA ATAAAGGTTG TTCATAGAGTTGACTTGTTC ATCCL26 primer designwww.bio- did they fare?CCl26 amplified using Bio-Rad SsoFastTM EVAGreen Supermix: 5ul Assay 98oC 30sec / 50 x 95oC 1 sec 55-70oC 5 sec / melt analysiswww.bio- 目标序列分析 二级结构分析 温度梯度优化实验条件 标准曲线验证www.bio- 借助温度梯度优化实验条件并验证实验体系 最合适的退火温度高特异性、高产率 发现并消除引物二聚体的潜在威胁 发现并消除扩增子二级结构的潜在威胁 降低引物浓度差异的潜在威胁 利用标准曲线检验验证下列因素 扩增效率 标准品的动态范围 PCR抑制剂的存在与影响用SYRB Green进行体系的优化与验证www.bio- 样本熔解曲线倒数图中有单一清晰的峰 阴性对照中无扩增产物 同时进行凝胶电泳实验检测特异性www.bio- thermal gradient6oC Below10oC Above利用温度梯度优化体系利用温度梯度优化体系www.bio- Thermal gradientSingle Plate Optimisation of Annealing Temperature and PCR Efficiency via Slope of Calibration Curve 一次试验完成引物退火温度和扩增效率的优化利用温度梯度优化体系利用温度梯度优化体系Dilution series107106105104103102一对引物在每一个温度下，做一个模板稀释序列一对引物在每一个温度下，做一个模板稀释序列 (每个稀释两个重复），引物浓度固定。每个稀释两个重复），引物浓度固定。www.bio- Ct Reproducibility www.bio- ConditionsTA = 61 - 64CE=103%R2=0.999利用温度梯度优化体系利用温度梯度优化体系www.bio- thermal gradient6oC Below10oC Above利用温度梯度优化退火温度利用温度梯度优化退火温度 - - 简易法（节约试剂）简易法（节约试剂）www.bio- annealing temperature最佳退火温度的选择最佳退火温度的选择www.bio- each primer引物浓度的优化引物浓度的优化www.bio- each primer引物浓度的优化引物浓度的优化www.bio- each primer引物浓度的优化引物浓度的优化www.bio- each primer引物浓度的优化引物浓度的优化www.bio- primer at 60o800nM primer at 60o200nM primer at 60o100nM primer at 60o100nM primer at 55o200nM primer at 55o400nM primer at 55o800nM primer at 55o引物浓度引物浓度 vs.vs.退火温度退火温度如果退火温度优化得合适，引物浓度对Cq的影响会降到最低www.bio- 目标序列分析 二级结构分析 温度梯度优化实验条件 标准曲线验证www.bio- 使用使用SYBR GreenSYBR Green进行阳性模板对照实验进行阳性模板对照实验 设置设置3-103-10倍的样品稀释梯度，倍的样品稀释梯度，浓度范围应能涵盖预期浓度范围应能涵盖预期 的目标样本的浓度的目标样本的浓度 包括至少包括至少5 5个不同浓度的标准品，个不同浓度的标准品，每个浓度做三个重复每个浓度做三个重复 加入无模板对照加入无模板对照 (NTC) - (NTC) - 检测可能出现的污染检测可能出现的污染用标准曲线验证www.bio- tube contains 90ml H20www.bio- You!Questions?