NMR在近五年的进展

Losoomzz :容凑1001谯申*干：亦辜習班艮岖凹半书01虫凑昼輪帀丑HIAINNMR 在生物医学近 10 年来的研究进展自核磁共振技术产生以来，在各个学科领域产生了不可估量的影响，尤其是生物医学方面。 主要体现在核磁共振成像技术和对生物大分子的结构分析这两项获得诺贝尔奖的成就。核磁共振成像技术：2003年10月6 日，瑞典卡罗林斯卡医学院宣布，2003年诺贝尔生理学或医学奖授予美国化 学家保罗劳特伯;保罗劳特布尔(Paul C. Lauterbur)和英国物理学家彼得曼斯菲尔 德(Peter Mansfield)，以表彰他们在医学诊断和研究领域内所使用的核磁共振成像技术 领域的突破性成就。劳特伯;劳特布尔的贡献是，在主磁场内附加一个不均匀的磁场，把梯度引入磁场中，从而 创造了一种可视的用其他技术手段却看不到的物质内部结构的二维结构图像。他描述了怎样 把梯度磁体添加到主磁体中，然后能看到沉浸在重水中的装有普通水的试管的交叉截面。除 此之外没有其他图像技术可以在普通水和重水之间区分图像。通过引进梯度磁场，可以逐点 改变核磁共振电磁波频率，通过对发射出的电磁波的分析，可以确定其信号来源。核磁共振成像技术运用于各种医学学科，核磁成像优点很多，容易分辨软组织，对机体无损 伤，而且随着所测核在体内得代谢变化，图像也会变化，反映了活体中一定的功能变化，因 此核磁共振已经成为许多医院中一种常规的检查手段，且被应用于研究脑的功能变化。如氢 质子核磁共振波谱分析在颞叶癫痫中的应用，核磁共振及IGF-1对ICPP女孩的诊断及鉴别 诊断，核磁共振和多种垂体激素检查对垂体柄阻断综合征患儿的诊治等等。近年来，核磁共振成像技术发展十分迅速，已日臻成熟完善。检查范围基本上覆盖了全 身各系统，并在世界范围内推广应用。为了准确反映其成像基础，避免与核素成像混淆，现 改称为磁共振成象。参与MRI成像的因素较多，信息量大而且不同于现有各种影像学成像， 在诊断疾病中有很大优越性和应用潜力。(1) 脑血管性疾病由于弥散、灌注及水抑制的应用，使的MRI诊断脑梗塞的敏感性、特异 性均明显高于CT。MRI对脑溢血的价值在于其能对血肿进行准确分期。脑动脉瘤、动静脉 畸形均有流空血管影显示。(2) 脑肿瘤脑肿瘤在MRI上有形态学和异常信号改变，三维成像的使用对脑肿瘤的定性、 定位诊断更准确。(3) 炎症各种细菌、病毒、霉菌性脑炎、脑膜炎与肉芽肿在MRI可显示，注射顺磁性造影 剂Gd-DTPA对定性诊断更有价值。对弓形体脑炎、脑囊虫、脑包虫病可定性诊断，并能 分期分型。(4) 脑退行性病变MR能清楚的显示皮质性、髓质性、弥漫性脑萎缩。MR还能诊断原发 性小脑萎缩。协助诊断皮质下动脉硬化性脑病、Alzermer氏病、pick氏病、hunfing氏舞蹈 病，wilson氏病、leigh氏病、fahr氏病及CO中毒、霉变干蔗中毒、甲旁减等疾病。(5) 脑白质病变MR对诊断多发性硬化、肾上腺性脑白质病等脱髓鞘和髓鞘形成不良性疾 病都有重要价值。(6) 脑室与蛛网膜下腔病变MR能清楚的显示孟氏孔和中脑导水管，即能明确分辨梗阻性 和交通性脑积水。MR显示蛛网膜囊肿、室管膜囊肿、脑室内肿瘤、脑室内囊肿等均很敏感。（7）脑先天性发育畸形MR是显示发育畸形最敏感而准确的方法，如大脑、小脑发育不良， 脑灰质异位症、并字体发育不良、神经管闭合障碍，Dandywalker畸形，chiari畸形，结 节性硬化，神经纤维瘤病等。（8）脊髓与脊椎病变从矢状面、轴位与冠状面上直接显示脊髓与脊椎是MR的突出贡献。 脊椎骨折、椎间盘突出、脊髓受累在MRI上一目了然。MR能对颈椎病分期、分型。MRI 椎动脉造影是唯一无创伤性血管造影。MR直接显示脊髓空洞，脊髓动静脉畸形髓内出血， 硬膜下或硬膜外血肿，蛛网膜囊肿。MR还能明确肿瘤位于髓内或髓外。增强MR更能勾画 出肿瘤侵犯的具体范围。对生物大分子的结构分析：Kuvk wiithrich教授于2002年由于他用二维核磁共振技术对生物大分子识别和结构分析方面 的贡献获得诺贝尔化学奖的二分之一。由于采用核磁共振方法可以对溶液中的蛋白质的三维 结构、动力学性质进行研究，因此这一研究成果使NMR技术成为研究生物大分子强有力的 研究手段，极大地促进了生物大分子的研究进程，对整个生命科学研究产生了深远的影响。 围绕“基于NMR的结构基因组和药物的研究”；“细胞信号的传递和调节” ；NMR方法学 的发展和应用”；“酶催化和分子识别”四个方面展开，涵盖了 NMR在蛋白质三维结构测定、 动力学和方法学研究、分子成像等多领域的研究课题。一些生物大分子，如膜蛋白，蛋白质复合体，蛋白质纤维等，在生命过程中起着极为 重要的作用，但是由于难以得到这些生物分子的单晶以及它们在溶液中的低溶解度， 用 X-ray和液体NMR很难得到它们的结构。一个典型的例子是膜蛋白质。膜蛋白约占与人类基 因编码有关的蛋白质的30%，一些重要的生命活动如能量转换、信息识别与传递、物质运送 和分配都与膜蛋白密切相关。但是到目前为止，只有157种（总共约3万种）膜蛋白的三维 结构是已知的。对于这些“困难”的生物大分子，固体NMR被认为是最有前途的研究手段之 一。自从2002年德国科学家首次用魔角旋转NMR得到固体蛋白质的三维结构以来，这几年 这个领域飞速向前发展。随着高磁场NMR仪器的使用，魔角旋转NMR探头技术的发展，固体 蛋白质样品制备技术的成熟和一批两维到四维固体NMR脉冲序列的使用，魔角旋转NMR研究 蛋白质的能力大大提高，魔角旋转NMR已经能够对25-30 KDa的蛋白质进行NMR信号全归属 和相应的结构和动力学研究。在这个研究中，杨俊和特拉华大学的同事Tatyana Polenova设计了一组新脉冲序列， 他们用这组脉冲序列研究了用不同同位素标记的thioredoxin蛋白质组装体的分子内和分 子间的界面。首先他们用理论模拟和NMR实验证实了固体NMR中的REDOR技术可以用来消除 13C,15N全富集的蛋白质主链上的15N信号，实现了用一个蛋白质样品同时进行NMR信号归 属和蛋白质界面研究。借助于对远程相互作用敏感的1H/13C REDOR和PAINCP技术，他们 设计了两个脉冲序列，用不同核自旋对的相关性观察到了蛋白质界面上空间相近的残基对。 另外，他们还设计了两个脉冲序列对蛋白质另外一段的主链上的15N信号进行了归属。这组 固体NMR的脉冲序列和相应的同位素标记方法将可以在更大的蛋白质复合体的界面研究中 使用。在活细胞中以原子分辨率确定蛋白的三维结构，对结构生物学家来说是一大挑战。本 期Nature报告的两项进展，应能拓宽这一领域中一项很有希望的方/ 胞内NMR光谱 的应用范围。以前，光谱方法较低的灵敏度及样本的短寿命，使得人们难以获得足够的结构 信息来用这种方法确定蛋白结构。为NMR实验收集数据一般需要一到两天时间，这对活细 胞来说太长了。 Sakakibara 等人通过在 2 至 3 个小时内收集到足够数据而克服了这一局限。 他们报告了完全根据在活大肠杆菌中获得的信息确定的第一个三维蛋白结构。该原理证明研究中所用模型蛋白，是来自嗜热菌的假设的重金属结合蛋白 TTHA1718 。 此前，活细胞的细胞内 NMR 光谱仅限于细菌和非洲爪蟾卵母细胞，对活真核细胞的广泛应 用受到向这些细胞中输送同位素标记蛋白效率相对较低的限制。现在， Inomata 等人发现， 通过细胞穿透肽由吡啶酸调控的作用，有可能将合适标记的蛋白输送到人细胞的细胞液中， 所用细胞穿透肽通过共价键与目标蛋白相结合。当输入的蛋白被内生酶活性或自体还原裂解 作用释放时，研究人员便能够获得活的人细胞内蛋白质的高分辨率二维异核NMR光谱。这 一方法有可能成为以细胞内蛋白为作用目标的药物的设计及筛选工作的一个强大工具。上海药物所林东海课题组博士生文祎等近年来用多维NMR技术研究兔朊病毒蛋白 PrPC(91-228)及其S173N, I214V等点突变体蛋白的溶液结构和动力学，不久前在JBC上报道 兔PrPC蛋白具有独特的空间结构和动力学性质。最近该课题组通过比较野生型兔PrPC与其I214V突变体的空间结构和动力学，进一步 指出朊病毒蛋白的表面电荷分布和骨架柔性可能是传染性海绵状脑病(TSE )种间传播屏障的 关键因素。该研究工作有助于深入理解兔朊病毒蛋白不发生PrPC-PrPSc构象变化从而不导 致朊病毒病的分子机制。使用核磁共振光谱法(nuclear magnetic resonance spectroscopy, NMRS)技术，研 究人员能够快速识别出一种化学“指纹”，从而鉴别出肺炎链球菌导致的肺部感染疾病。 这 是第一次描述基于NMR的尿代谢分析，其潜在的提供了肺炎成因的快速诊断方法oSlupsky 教授介绍说。 此外，可以使用该技术快速简单的检测病人的康复情况，该技术的主要目的 是快速精确的进行肺炎成因诊断，从而使得患者能够尽早开始恰当的药物治疗。由此可见， NMR 在生物医学上的应用极大的反映出其巨大的潜力和价值。