DNA重组的载体蓝背景PPT学习教案

会计学1DNA重组的载体蓝背景重组的载体蓝背景质粒（plasmid）噬菌体或病毒DNA考斯质粒（cosmid）与噬菌粒人造染色体载体载体的功能及特征第1页/共47页载体的功能及特征载体的功能（P12）为外源基因提供进入受体细胞的转移能力为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因提供在受体细胞中 扩增和表达能力注意：上述三大功能并非所有的载体分子都必须具备第2页/共47页载体的功能及特征载体应具备的条件具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性） 具有合适的筛选标记 具有较高的外源DNA的载装能力 具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点 具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点 第3页/共47页质粒载体质粒的基本特征 定义：质粒是一类存在于原核细菌和真菌细胞中，能独立于寄主染色体而自主复制的共价、闭合、环状DNA分子并被稳定遗传的一类核酸分子。是处于生命与非生命的分界线上。（1）质粒常见于原核细菌和真菌中；（2）绝大多数的质粒是DNA型的，绝大多数的天然DNA质粒具有共价封闭、环状的分子结构，即cccDNA；（3）质粒DNA的分子量范围：1 - 100 kb第4页/共47页质粒的基本特征1.质粒的自主复制性：质粒能摆脱寄主细胞的DNA复制系统的束缚进行自主复制；质粒DNA上含有自己的复制起始区（ori），形成独立的复制子结构根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为两大复制类型：严紧型复制控制的质粒 1 - 5拷贝 stringent plasmid松弛型复制控制的质粒 30 - 50 拷贝 relaxed plasmid第5页/共47页质粒的基本特征2.质粒的可转移性：革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类：接合型质粒：能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一个细胞（接合作用），如F、Col、R质粒等；非接合型质粒：不能在天然条件下独立地发生接合作用。值得注意的是，某些非接合型质粒（ColE1）在接合型质粒的存在和协助下，也能发生DNA转移，这个过程由bom和mob基因决定。第6页/共47页质粒的基本特征3.质粒的不相容性：任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于一个细胞中，这种现象称为质粒的不相容性，不相容性的质粒组成不ColE1、pMB1 拥有相似的复制子结构，彼此不相容pSC101、F、RP4 拥有相似的复制子结构，彼此不相容p15A及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容相容性群。以大肠杆菌的质粒为例：第7页/共47页质粒的基本特征4.携带特殊的遗传标记：野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基因，这使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，包括：物质抗性 抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物物质合成 抗生素、细菌毒素、有机碱这些标记基因对DNA重组分子的筛选具有重要意义。第8页/共47页质粒的构建原因：天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少遗传标记不理想等缺陷，不能满足克隆载体的要求，因此往往需要以多种野生型质粒为基础进行人工构建。目前实验室使用的大肠杆菌质粒大多是由少数几个野生型质粒构建而成的：pSC1018.8 kb，拷贝数 5，四环素抗性标记基因 TcrColE16.5 kb，拷贝数 20 - 30，大肠杆菌内毒素标记基因 E1RSF2124ColE1衍生质粒，氨苄青霉素抗性标记基因 Apr第9页/共47页构建过程（P14）第10页/共47页质粒的分类人工构建的质粒根据其功能和用途可分成如下几类： 高拷贝质粒 突变拷贝数控制基因，拷贝数1000-3000，扩增基因低拷贝质粒 来自pSC101，拷贝数小于10，表达某些毒性基因温敏质粒 在不同温度下表现出拷贝数、整合等不同性质测序质粒 含有测序通用引物互补序列和多酶接头（polylinker）整合质粒 装有整合促进基因及位点，便于外源基因的整合穿梭质粒 装有针对两种不同受体的复制子，便于基因克隆表达质粒 装有强化外源基因表达的转录、翻译、纯化的元件探针质粒 装有报告基因，便于启动子等元件的克隆筛选第11页/共47页重要的大肠杆菌质粒载体松弛型复制 pBR3224363 bpOrigin of ReplicationROPROISal IBamH ITcrPvu IPst IPst IEcoR ICla IHind IIIHind IIBal IAprpBR322： 氯霉素可扩增拷贝数 50 - 100 / cell用于基因克隆 第12页/共47页pUC18 / 19： 拷贝数 2000 - 3000 / cell用于基因克隆和测序 装有多克隆位点（MCS）正选择颜色标记 lacZBamHIpUC182686 bpAprlacZoriGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTT396452EcoRISstIKpnISmaIXbaISalIPstISphIHindIII第13页/共47页重要的大肠杆菌质粒载体pUC18 / 19：正选择标记 lacZ 的显色原理pUC18/19PlaclacZMCSb-半乳糖苷酶的a-肽段OHHHOHHOHHOHCH2OHONClBr5-溴-4-氯-3-吲哚基-b-D-半乳糖苷X-galClBrClBrONNO第14页/共47页重要的大肠杆菌质粒载体pGEM-3Z：多拷贝装有两个噬菌体的强启动子装有多克隆位点（MCS）正选择颜色标记 lacZ用于外源基因的高效表达 注意：T7和SP6启动子特异性地由噬菌体DNA编码的RNA聚合2743 bpMCSlacZPT7oriAprpGEM-3EPSP6酶所识别，因此相应的受体菌必须表达噬菌体RNA聚合酶，如：E.coli BL21（DE3）等第15页/共47页质粒DNA的分离纯化实验室一般使用下列三种方法制备质粒DNA： 氯化铯密度梯度离心法 质粒DNA纯度高、周期长、设备要求高、溴乙锭污染碱溶法 质粒DNA纯度底、快速、操作简便沸水浴法 质粒DNA纯度、操作周期介于氯化铯法和碱溶法之间第16页/共47页氯化铯密度梯度离心法： 用含有EDTA的缓冲液悬浮菌体； 加溶菌酶裂解细菌细胞壁； 加CsCl和溴乙锭；超速离心过夜；在紫外灯下吸取cccDNA；稀释沉淀cccDNA。proteinsocDNAL-DNAcccDNARNAs第17页/共47页碱溶法： 用含有EDTA的缓冲液悬浮菌体； 加溶菌酶裂解细菌细胞壁； 加NaOH和SDS的混合溶液，破膜释放内含物； 加高浓度的醋酸钾溶液，沉淀染色体，去除染色体DNA及大部分蛋白质； 离心取上清液，用苯酚-氯仿萃取，去除痕量的蛋白质；乙醇或异丙醇沉淀水相质粒DNA；用无DNase的RNase去除残余的RNA。 cccDNAL-DNAocDNAD-DNAT-DNA第18页/共47页沸水浴法： 用含有EDTA和Triton X-100的加溶菌酶裂解细菌细胞壁； 沸水浴40秒钟；离心，用无菌牙签挑去沉淀物； 乙醇或异丙醇沉淀质粒DNA。缓冲液悬浮菌体； 第19页/共47页另一类载体 噬菌体或病毒DNA 噬菌体或病毒是一类非细胞微生物，能高效率高特异性地侵染宿主细胞，然后或自主复制繁殖，或整合入宿主基因组中潜伏起来，而且在一定的条件下上述两种状态还会相互转化。 噬菌体或病毒的上述特性使得它们的DNA能被开发成为基因工程的有用载体，因为： 高效率的感染性能使外源基因高效导入受体细胞； 自主复制繁殖性能使外源基因在受体细胞中高效扩增。第20页/共47页l 噬菌体的生物学特性：生物结构l 噬菌体是大肠杆菌的温和型噬菌体l 噬菌体由外壳包装蛋白和l-DNA组成 l-DNA全长48502个核苷酸l-DNA上至少有61？个基因l双链噬菌体DNA载体第21页/共47页l 噬菌体生物学特性： 生物结构5 TCCAGCGGCGGGG33CCCGCCGCTGGA 5 COSCOScos头部合成基因尾部合成基因溶菌控制基因晚期控制基因DNA合成控制基因阻遏基因早期控制基因阻遏基因重组基因删除与整合基因l - DNA第22页/共47页l 噬菌体生物学特性： 感染周期E.coli吸附LamB受体注入复制包装裂解第23页/共47页l 噬菌体生物学特性： 感染周期体内包装100个左右的拷贝包装范围为原DNA的75 - 105%即 36 - 51 kbDA第24页/共47页l 噬菌体生物学特性： 溶原状态 l噬菌体感染大肠杆菌后，除能裂解细胞外，也可能将其DNA直接整合到宿主细胞的染色体DNA上，并不产生子代噬菌体颗粒，这种情况为溶原状态。整合主要由l-DNA上的cI和int两基因的产物所激活，而这两个基因的开放与关闭又取决于宿主细胞本身的性质。人们可以根据需要改变l-DNA或宿主细胞的性质，使噬菌体或处于溶菌状态，或处于溶菌状态。 DNA重组技术一般需要l噬菌体进入溶原状态第25页/共47页l-DNA重组分子的体外包装： l-DNA重组分子需在体外人工包装成有感染力的噬菌体重组颗粒，方可高效导入受体细胞。 用于体外包装的蛋白质可直接从感染了l噬菌体的大肠杆菌中提取，现已商品化。这些包装蛋白通常分为相互互补的两部分：一部分缺少E组份，另一部分则缺少D组份。包装时，当且仅当这两部分包装蛋白与重组l-DNA分子混合后，包装才能有效进行，任何一种蛋白包装液被重组l-DNA污染后，均不能被包装成有感染力的噬菌体颗粒，这也是基于安全而设计的。第26页/共47页-DNA载体的构建：缩短长度 野生型l-DNA包装的上限为51kb，本身长度为48.5kb，只有当插入的外源DNA片段不大于2.5kb时，才能被包装成有感染力的噬菌体颗粒。因此缩短野生型l-DNA的长度，可以提高装载量。其实野生型l-DNA上约有40-50%的片段是复制和裂解所非必需的。根据切除的多少，可将l-DNA分成两大类载体： 插入型载体取代型载体第27页/共47页取代型 （Replacement vectors）这种载体具有两个对应的酶切克隆位点，在两个位点之间的DNA区段是噬菌体的非必需序列，可以被外源插入的DNA取代。如Charon 4 载体：克隆能力大，2025kb插入型 （Insertion vectors ）这种载体仅仅有一个可供外源DNA插入的克隆位点。如：gt10 、 gt11 克隆能力小，一般不到10kb-DNA载体的主要类型：第28页/共47页-DNA及其重组分子的分离纯化：P22将大肠杆菌在含有麦芽糖的培养基中培养至对数生长期 加入l噬菌体或重组l噬菌体的悬浮液，37培养1小时 用新鲜培养基稀释，继续培养4 -12小时。这时噬菌体颗粒 密度已达1013 -1014 / L，大肠杆菌细胞已完全裂解 超速离心，沉淀噬菌体 苯酚抽提，释放l-DNA 乙醇或异丙醇沉淀l-DNA 第29页/共47页l-DNA作为载体的优点：l-DNA可在体外包装成噬菌体颗粒，能高效转染大肠杆菌 l-DNA载体的装载能力为25 kb，远远大于质粒的装载量 重组l-DNA分子的筛选较为方便 重组l-DNA分子的提取较为简便 l-DNA载体适合克隆和扩增外源DNA片段，但不适合表达 外源基因第30页/共47页单链噬菌体DNA载体噬菌体的生物学特性： 生物结构M13噬菌体的外型呈丝状M13 噬菌体由外壳包装蛋白和正链DNA组成 M13 DNA全长6407个核苷酸M13 DNA上至少有10个基因2700个VIIIM13 噬菌体不裂解宿主细胞，但抑制其生长 IIIVIVIIXI第31页/共47页宿主细胞不被溶菌。M13噬菌体的生物学特性： 感染周期第32页/共47页载体的构建：III VI I IV II X V VII IX VIII野生型M13RF-DNAIII VI I IV II X V VII IX VIIIM13mp系列载体lacZpolylinker第33页/共47页M13 DNA载体的特点：使克隆的DNA片段以特定单链的形式输出受体细胞外这在DNA定向突变中非常有用M13重组分子筛选简便被M13噬菌体感染的受体细胞生长缓慢，形成混浊斑，易于辨认挑选。而且重组分子越大，混浊斑的混浊度亦越大 但M13-DNA载体的最大缺陷是装载量小，只有1.5 kb第34页/共47页 与动植物受体细胞相适应的载体一般选择相应动植物的病 毒基因组DNA。 动植物病毒种类繁多，每一种动植物都有多种特异性的病毒。按照基因组的结构，可将动植物病毒分成四大类： 单链DNA病毒双链DNA病毒单链RNA病毒双链RNA病毒 RNA病毒在自我复制时大多存在相应的DNA中间反应物，这些中间体可作为载体进行常规的DNA重组。插曲插曲第35页/共47页质粒与噬菌体杂合载体 l-DNA载体和M13-DNA载体的装载量最大分别为25 kb和1.5 kb，但在很多情况下，往往需要克隆更大的外源DNA片段，考斯质粒和噬菌粒载体的构建就是为了进一步提高噬菌体DNA的装载量。 在包装上限固定的条件下，大幅度缩短噬菌体DNA的长度，就能同步增加载体的装载能力。将噬菌体DNA与包装有关的序列与质粒组装在一起，既能最大限度地缩短载体的长度，同时又能保证重组DNA分子在体外仍被包装成有感染力的颗粒，这便是构建考斯质粒和噬菌粒载体的思路。当然，由于考斯质粒和噬菌粒不再携带包装蛋白基因，因此重组DNA分子在细胞内不能形成噬菌体颗粒。第36页/共47页考斯质粒（cosmid）考斯质粒载体的构建： 考斯质粒是一类人工构建的含pHC796400 bpTcrl fragmentcosoriAprPstIBamHISalI有l-DNA cos 序列和质粒复制子的殊类型的载体，1978年由Collins由含cos序列的1.8kb的l片段和 考斯质粒的装载范围为31-45kb。和Hohn发明构建。例如，pHC79质粒pBR322片段组合而成。第37页/共47页考斯质粒载体的特点：能像l-DNA那样进行体外包装，并高效转染受体细胞 装载量大（45 kb）且克隆片段具有一定的大小范围能像质粒那样在受体细胞中自主复制重组操作简便，筛选容易不能体内包装，不裂解受体细胞第38页/共47页噬菌粒（phagemid or phasmid）噬菌粒载体的特点： 噬菌粒是一类人工构建的含有单链噬菌体包装序列、复制子以及质粒复制子、克隆位点、标记基因的特殊类型的载体。能像M13-DNA那样体外包装，并高效转染受体细胞 装载量比常规的M13mp系列要大很多（10 kb）能像质粒那样在受体细胞中自主复制重组操作简便，筛选容易通过克隆双链DNA能获得同等长度的单一单链DNA概念：25页第39页/共47页重要的噬菌粒载体：pUC118 / 119pUC118：pUC18 + M13间隔区 IGpUC119：pUC19 + M13间隔区 IG500 个拷贝3200 bpMCSlacZlacIoriAprM13-MGpUC118 / 119表示M13辅助噬菌体DNA第40页/共47页重要的噬菌粒载体：pBluescript 体外转录载体pBluescript = pUC + f1-ori + PT3 + PT72958 bpMCSlacZPT7oriAprf1-oripBluescriptPT3噬菌体启动子PT3和PT7强化外源基因的转录，提取出来的单链DNA重组分子在噬菌体RNA聚合酶的存在下，又可实现外源基因的体外转录。第41页/共47页人造染色体载体 人类、动物、植物的全基因组序列分析往往需要克隆数百甚至上千kb 的DNA片段， 此时考斯质粒和噬菌粒载体的装载量也远远不能细菌人造染色体（BAC）酵母人造染色体（YAC）满足需要。 将细菌接合因子或酵母菌染色体上的复制区、分配区、稳定区与质粒组装在一起，即可构成染色体载体。当大片段的外源DNA克隆在这些染色体载体上后，便形成重组人造染色体，它能像天然染色体那样，在受体细胞中稳定的复制并遗传。人造染色体载体包括：第42页/共47页细菌人造染色体（Bacterial Artificial Chromosomes BAC）细菌人造染色体通常是在大肠杆菌性因子F质粒的基础上构建的，命名为pBACs，其装载量范围在50 - 300 kb之间。各种类型的pBACs在大肠杆菌受体菌只能维持单一拷贝。pBACs主要适用于：克隆大型基因簇（gene cluster）结构构建动植物基因文库第43页/共47页酵母人造染色体（Yeast Artificial Chromosomes YAC）YAC载体一般含有下列元件： 酵母染色体的端粒序列 酵母人造染色体的构建：pYAC4CEN4EcoRIURA3TELBamHITELoriAprTRP1ARS1酵母染色体的复制子 酵母染色体的中心粒序列 酵母系统的选择标记大肠杆菌的复制子 大肠杆菌的选择标记YAC载体的装载量为350-400 kb。第44页/共47页酵母人造染色体的使用：pYAC4CENEcoRIURATELBamHITELoriAprTRPARSEcoRIEcoRIEcoRIBamHI连接转化酵母菌重组酵母染色体第45页/共47页第46页/共47页