参桂胶囊微生物验证方法验证试验报告.doc

参桂胶囊微生物验证方法验证试验报告试样样品：品名：参桂胶囊批号：20050401、20050402、20050403一 计数方法的验证试验菌株：大肠埃希菌（Escherichia coli）（CMCC（B）44102）金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）（CMCC（B）26003）枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）（CMCC（B） 63501）白色念珠菌（Candida albicans）（CMCC（F） 98001）黑曲霉（Aspergillus niger）（CMCC（F） 98003）培养基：营养肉汤培养基；营养琼脂培养基；改良马丁培养基；改良马丁琼脂斜面培养基等试验方法：本品经直接接种的方法验证试验，每株菌进行3次独立的平行试验，并分别计算各试验菌每次试验的回收率。1 菌液制备：接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，30-35培养18-24小时，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释成每1ml含50-100个CFU的菌悬液。接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中，23-28培养24-48小时，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释成每1ml含50-100个CFU的菌悬液。接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基中，培养5-7天。使大量的孢子产生。加入3-5ml 0.9%无菌氯化钠溶液，用玻璃棒将孢子洗脱。然后，用管口带有能过滤菌丝装置（如薄的无菌棉花或纱布的无菌毛细细管）吸出孢子菌液至无菌试管内，用比浊法，将菌液稀释至每毫升含50-100个CFU。2 供试液制备：称取供试品10g，置灭菌的研钵中，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml，研碎混匀，作为1：10的供试液。3 回收率测定（1） 实验组：取试验菌液、供试液1ml分别注入平皿中，立即倾注琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌数。（2）菌液组 取上述试验菌液，测定其加入的试验菌菌数。（3）供试品对照组 取供试液1ml，按平皿法测定其所含菌数。实验一：（样品20050401）（1）菌液组 菌种平板大肠埃希菌金黄色葡萄球菌枯草杆菌白色念珠菌黑曲霉1646269566027368606352平均值68.56564.559.556菌落数（CFU/皿）6865646056（2）试验组 菌种平板大肠埃希菌金黄色葡萄球菌枯草杆菌白色念珠菌黑曲霉1949285526229280946542平均值938689.558.552菌落数（CFU/皿）9386905852（3）供试品对照组 项目 稀释平板 度细菌数（培养时间48小时）霉菌、酵母菌数（培养时间72小时）10-110-113602270平均值31.50菌落数（CFU/皿）3210实验二：（样品20050402）（1） 菌液组 菌种平板大肠埃希菌金黄色葡萄球菌枯草杆菌白色念珠菌黑曲霉1656272606626079646457平均值62.570.568.6261.5菌落数（CFU/皿）6270686262（2）试验组 菌种平板大肠埃希菌金黄色葡萄球菌枯草杆菌白色念珠菌黑曲霉195941046354290108906563平均值92.5101976458.5菌落数（CFU/皿）92101976458（3）供试品对照组： 项目 稀释平板 度细菌数（培养时间48小时）霉菌、酵母菌数（培养时间72小时）10-110-114602380平均值420菌落数（CFU/皿）4210实验三（样品20050403）（1）菌液组 菌种平板大肠埃希菌金黄色葡萄球菌枯草杆菌白色念珠菌黑曲霉1626973586227660616753平均值6964.56762.557.5菌落数（CFU/皿）6964676258（2）试验组 菌种平板大肠埃希菌金黄色葡萄球菌枯草杆菌白色念珠菌黑曲霉1766275576126874706151平均值726872.55956菌落数（CFU/皿）7268725956（3）供试品对照组： 项目 稀释平板 度细菌数（培养时间48小时）霉菌、酵母菌数（培养时间72小时）10-110-11140280平均值120菌落数（CFU/皿）1210阴性对照：细菌（1）0（2）0霉菌、酵母菌（1）0（2）0结果判定：3次独立的平行试验中，试验组的菌回收率（试验组的平均菌落数减去供试品对照组的平均菌落数占菌液组的平均菌落数的百分数）均不低于70%，表明该样品对验证实验菌无明显的抑菌作用。结果见表1-5表1.大肠埃希菌（Escherichia coli）（CMCC（B）44102）实验次数供试液稀释级菌落计数（CFU/皿）回收率（%）试验组菌液组供试品对照组11：1093683289.721：1092624280.631：1072691287.0表2. 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）（CMCC（B）26003）实验次数供试液稀释级菌落计数（CFU/皿）回收率（%）试验组菌液组供试品对照组11：1086653283.121：10101704284.331：1068641287.5表3. 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）（CMCC（B） 63501）实验次数供试液稀释级菌落计数（CFU/皿）回收率（%）试验组菌液组供试品对照组11：1090643290.621：1097684280.931：1072671289.6表4. 白色念珠菌（Candida albicans）（CMCC（F） 98001）实验次数供试液稀释级菌落计数（CFU/皿）回收率（%）试验组菌液组供试品对照组11：1058601096.721：10646210103.231：1059621095.2表5. 黑曲霉（Aspergillus niger）（CMCC（F） 98003）实验次数供试液稀释级菌落计数（CFU/皿）回收率（%）试验组菌液组供试品对照组11：1052561092.921：1058621093.531：1056581096.6结论：本品的细菌、霉菌和酵母计数可以采用平皿法。二、控制菌检查方法的验证试验菌株：大肠埃希菌（Escherichia coli）（CMCC（B）44102） 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）（CMCC（B）26003）（1） 菌液制备：接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，3537培养18-24小时，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释成每1ml含10-100个CFU的菌悬液。（2） 分别测定加入的各个试验菌菌液中每ml的菌数。 菌种平板大肠埃希菌金黄色葡萄球菌1646227368平均值68.565菌落数（CFU/ml）6865（3）验证：试验组取供试液10ml和试验菌菌液1ml（即10-100CFU试验菌），加入100ml的胆盐乳糖培养基中，3537培养18-24小时，按中国药典2005年版一部附录C进行检查阴性菌对照组取金黄色葡萄球菌的菌液1ml，按试验组操作方法操作BL.增菌 MUG-Indole Macc平板 染色经检 IMViC供试液+菌液： + + + + 阴性对照菌： （金黄色葡萄球菌）阴性对照： 供试品： 阳性菌：+（4）结论：阴性菌对照组未检出阴性对照菌，试验组检出试验菌。本品采用直接接种的方法控制菌能检出。三. 验证结论本品按中国药典2005年版微生物检查法，经验证试验可以按照中国药典2005年版一部附录XIII C采用平皿法检验。 上海玉丹药业有限公司质控部2006年6月26日