工业微生物chap6微生物遗传变异与育种.doc

第六章 微生物遗传变异与育种第一节 工业微生物菌种的筛选开发微生物资源的关键是获得所需要的菌种，优良的微生物菌种是工业微生物技术的关键和基础。理想的工业发酵菌种必须具有下述特性：(1)纯种培养物；（2）遗传性状稳定；（3）生长速度快；（4）能利用廉价、来源广、成分简单的培养基；（5）能忍耐不良环境因素如温度、pH、离子强度、剪切力等；（6）快速生产目的产物，不产或少产毒性物质或副产物。一、微生物菌种获得的途径（一）微生物的自然分布要获得理想的目的菌的最基本问题是自然界或人工环境有没有目的菌存在的可能性。自然界中蕴藏着大量的微生物，这些微生物在生物生态上起着重要的作用，土壤、空气、水、动植物体以及各种极端环境都有微生物的踪迹，有机物的分解、氮的固定过程都离不开它们。一般微生物的种类和数量要受到所处环境中有机物、氧、温度、水分、pH值、光线等各种因素的影响。据报道：1g土壤约栖息1亿个细菌，1000万个放线菌，100万个真菌，55万个藻类，目前全世界能分离培养的微生物还不到其总数的1%。土壤中的大量微生物已成为分离各种抗生素、生理活性物质、酶和氨基酸产生菌的主要来源。土壤中的微生物分布的数量：按种类递减，细菌（108个/g）放线菌（107个/g）霉菌（106个/g）酵母菌（105个/g）藻类（104个/g）原生动物（103个/g）。（二）微生物菌种获得的途径但自然环境下的微生物是混杂生长的，要获得理想的菌株，必须要有快速、准确、高通量的菌种分离和筛选方法。在实际研究工作中，我们可通过以下途径进行收集和筛选工作：（1）工业微生物的直接来源 包括土壤，水，新鲜的、发酵的和腐烂的水果和食物，有生命的动植物，废水等。（2）向菌种保藏机构索取有关的菌株 国内外有名的菌种保藏机构有：中国微生物保藏管理委员会（CCCCM），美国典型菌种保藏中心（ATCC），英国国家典型菌种保藏所（NCTC），日本大阪发酵研究所（IFO）等。典型的微生物菌种分离筛选过程可分为采样、增殖培养、分离纯化、性能测定等。见图6-1。图6-1 菌种分离筛选流程二、工业微生物的筛选 (一) 微生物样品采集采样应根据筛选的目的、微生物分布情况、菌种的主要特征及其生态关系等因素，确定具体的时间、环境和目标物。1土壤采样自然界中土壤、水、空气、动植物及其腐败残骸含微生物样品极其丰富，但总体来讲土壤样品的含菌量最多，土壤具备了微生物所需要的营养、空气、水，是我们采集样品的首选目标。每克土壤的含菌量大体有如下递减规律：细菌放线菌霉菌酵母藻类原生动物。微生物由于生理特性不同，季节、表面的植被、温湿、通风情况、养分、水分、pH值酸碱度和光照等都会影响土壤中的微生物分布：（1）土壤有机质含量和通气状况 有机质丰富的土壤如耕土、菜园土、近郊土壤，通气保水性能好，适合细菌、放线菌生长繁殖；森林土植被多，枯叶多，有机质丰富，但阴暗潮湿，适合霉菌、酵母生长繁殖；沙土、无植被的山坡土等有机质含量少的，微生物含量少。（2）土层的纵剖面：采土样最好的土层是525cm。15cm的表层土由于阳光照射，蒸发量大，紫外杀菌，微生物数量少；25cm以下的土层因土质紧密，空气、营养、水分缺乏，含菌量逐步减少。（3）土壤pH值：偏碱的土壤（pH7.0-7.5）环境适合于细菌、放线菌生长；偏酸的土壤（pH7.0以下）环境适合于霉菌、酵母菌生长。（4）表面的植被：植物根部的分泌物有所不同也对微生物分布有一定影响。葡萄或其他果树的根部附近土壤中酵母菌多；豆科植物根部的根瘤菌数量占优。(5)地理条件：热带和亚热带的南方土壤比北方土壤的微生物的数量和种类多，原因是南方温度高，气候温暖潮湿，植物多和植被覆盖面大，土壤有机质丰富。（6）季节条件：秋季采土样最为理想，经过夏季到秋季，温度高，植被丰富，土壤水分和通气合适，微生物数量最多。而冬季温度低，气候干燥，微生物生长慢而少；春季气温升高，微生物生长旺盛，但雨水多，土壤含水量高，通气不良；土壤采样方法：采土样地点选好后，用小铲子去除5cm表土，取离地面515cm处的土样1025克，盛于预先灭菌的牛皮纸袋中扎紧，并标明时间、地点和环境等情况，以备查考。2根据微生物生理特点采样微生物的营养需求和代谢类型与其生长的环境有很大相关性。微生物在特定的环境下生息繁衍，它必然具有与之相适应的代谢类型并产生相应的代谢产物适应这种环境。研究表明，如淀粉酶、糖化酶生产菌容易在面粉厂、食品厂、酒厂这类场所分离到；蛋白酶、脂肪酶生产菌容易在肉类加工厂、饭店的污水和污泥中分离到；纤维素酶生产菌容易在森林中腐烂的草木下的土壤或直接从腐烂的草木中分离；油田附近的土壤容易分离出利用碳氢化合物的微生物。筛选一些具有特殊性质的微生物时，需要根据该微生物独特的生理特性到特殊的环境条将下采样。在极端环境如高温、低温、高酸、高碱、高辐射等环境中存在少数极端微生物，这也是目前微生物研究的热点之一。如耐高温菌通常在温度较高的南方，或温泉、火山爆发区以及北方的堆肥中采样；嗜低温菌种可到南北极、冰窖、深海等寒冷的地方采样。海洋对于微生物是个特殊的局部环境，其独特的高盐度、高压力、低温及光照条件，使海洋微生物具备特殊的生理活性，产生了不同于陆地来源的特殊代谢物。海洋采样可参照其中不同微生物的分布：表层为好气异养菌，底层有机质丰富，硫化氢含量高，厌气性腐败菌和硫酸还原菌较多，两层中则为紫硫菌。海洋微生物还可从海洋生物体如海绵、海鞘、海参及深海鱼肠道体内分离。（二）富集培养一般在采集的样品中待分离的菌种在数量上并不占优势，为提高分离的效率，我们根据微生物的生理特点，设计一种选择性培养基，创造有利的生长条件，使目的菌在最适环境中生长繁殖，使天然样品中的劣势菌转变为人工环境中的优势菌，便于将它们从样品中分离。这种方法称为增殖培养或富集培养。与直接分离相比较，直接分离避免了不同微生物之间的竞争作用，而富集培养是基于不同微生物之间在液体培养基中的自由竞争，在人为选定的培养条件下，适合生长的微生物会在数量上超过其他微生物而最终占优势。富集培养主要根据微生物的碳源、氮源、pH、温度、需氧等生理因素来控制。1控制培养基的营养成分营养成分主要指碳源、氮源、无机盐类、生长因子等。微生物的代谢类型丰富，其分布随环境条件不同而不同，所需的营养成分也不一样。对于大多数微生物的富集培养可用下面的基础培养基如表6-1，对于碳源、氮源、能量物质的需求依所要富集的微生物不同而不同。表6-1 基础培养基成分成分用量成分用量K2HPO4MgSO47H2OFeSO47H2O1g0.2g0.05gCaCl2微量元素溶液蒸馏水0.02g0.1ml1L控制增殖培养基中营养成分，特别适合分离产水解酶类（纤维素酶、淀粉酶等）的产生菌，可在富集培养基中以相应底物作为唯一碳源，加入含菌样品，并给目的微生物以最佳的培养条件培养，能分解利用该底物的菌类得以繁殖，而其他微生物则因得不到碳源而无法生长。但是许多的碳源、氮源可被多种微生物利用，不适于用作控制条件。常规实验研究中，各大类微生物已确定基本的营养成分，如细菌用蛋白胨、牛肉膏，放线菌用淀粉，酵母、霉菌用麦芽汁或米曲汁等。2控制培养条件 通过微生物对pH、温度及通气等条件的特殊要求来控制培养，达到富集目的微生物菌种。（1）pH值 不同微生物生长繁殖的最适pH值不同，培养基配制时要考虑微生物生长代谢产物如有机酸和培养基成分利用后造成的pH变化,控制培养基的pH值一般通过添加磷酸盐缓冲液体系、碳酸钙以及必要时补加酸、碱的方式来调节。（2）培养温度和热处理 不同种类的微生物所适宜的生长温度是不同的，利用不同培养温度可使不同的嗜温性微生物生长速度不同。筛选耐高温菌株，有利于发酵工业节约冷却用水，采用5060温度培养，就可使嗜冷、嗜温微生物大量淘汰。细菌芽孢是特别耐热的，可以抵抗100或更高的温度，要分离内生孢子生成型细菌，可将采集样品进行短时间的巴氏杀菌消除不产孢子细菌的竞争，浓缩产芽孢菌种。（3）通风 一般所筛选的微生物通常是好气菌，但有时也分离厌氧菌，严格的厌氧菌不仅可省略通气和搅拌，节省能耗。这时除配制特殊的培养基外，还需要厌氧培养箱、厌氧罐等特殊设备创造有利于厌氧菌的生长环境。3添加抑制剂添加专一性抑制剂也可达到抑制不需增殖的微生物的目的。如土样悬浮液中加数滴10酚可抑制霉菌和细菌的生长，而放线菌仍生长；又如添加青霉素、链霉素之类抗生素能抑制细菌的生长。不同抗生素能抑制的菌类的范围不同，所用浓度等也不同，应区别分离对象、药物性质及适当的添加量。经常用于选择培养添加药物如表6-2。表6-2 选择培养基使用的药物及其浓度（括号内数字与药物的浓度一般以mg/ml表示）被分离的微生物添加物质及其浓度被抑制的微生物放线菌放线菌酮（50），制霉菌素（50），环己亚氨（50），匹马霉素（50），丙酸钠（4mg）霉菌环己亚氨+多黏菌素+枯草菌素（各20单位），多黏菌素B（5）+青霉素（1）细菌放线酮（50-500），制霉菌素（100），曲古霉菌素（500），优洛杀菌素（30-100）（eu-rocidin）霉菌、酵母菌原虫霉素（5）原生动物革兰氏阳性菌多黏菌素B（5）革兰氏阴性菌革兰氏阴性菌青霉素（1），月桂酸钠（2mg）革兰氏阳性菌酵母菌氯霉素（100），青霉素（20）+链霉素（40），玫瑰红（50）+放线菌酮（10）细菌放线菌酮霉菌霉菌菌氯霉素（100），青霉素（20）+链霉素（40），玫瑰红（35-67）氯霉素（50）+放线菌酮（10），青霉素（100）细菌细菌、酵母菌 (三)分离纯化虽然增殖培养过程中设置了许多限制因素，目的微生物得到增殖占了优势，其他种类的微生物在数量上相对减少，但富集后的培养液中仍是一个各类微生物的混合体。为了获得某一特定的微生物菌种，必须进行微生物的分离纯化，把最需要的菌株直接从样品中分离出来。1、好氧微生物的分离纯化（1）常规的分离方法 常用的菌种纯化方法很多，大体可将它们分为二个层次，一个层次较粗放，一般只能达到“菌落纯”的水平，其方法有划线分离法、稀释涂布法。其具体方法已在其它相关章节作了详细说明，划线分离法简单，较快；而稀释涂布法获得单菌落均匀，获得纯种的几率大，特别适合分离具有蔓延性的微生物如根霉、毛霉等霉菌，这类微生物在分离时极易生长成片，很难挑单菌落，实验中可在培养基中加入去氧胆酸盐或山梨糖。另一层次是较为精细的单细胞或单孢子分离法，可达到“菌株纯”的水平。最简便的方法是利用培养皿或凹玻片等分离小室进行细胞分离；或利用复杂的显微操作装置进行单细胞挑取。（2）平皿反应快速检出法 提高分离筛选工作的效率，除控制增殖培养条件外，并选用特异的检出方法和筛选方案，可显著提高菌株分离纯化的效率。目前在分离筛选研究工作中常采用平皿反应快速检出法，根据目的微生物特殊的生理特性或利用某些代谢产物生化反应来设计特殊的分离培养基，通过观察微生物在选择性培养基上生长状况或生化反应如透明圈、变色圈、抑菌圈等进行分离。表6-3列出了微生物代谢产物的平板检测方法。透明圈法：在平板培养基中加入溶解性较差的底物，使培养基混浊。能分解底物的微生物便会在菌落周围产生透明圈，圈的大小初步反应该菌株利用底物的能力。该法在分离水解酶(如脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶、核酸酶等产生菌时采用较多。如在分离淀粉酶产生菌时，培养基以淀粉为唯一碳源，待样品涂布到平板上，经过培养形成单个菌落后，再用碘液浸涂，根据菌落周围是否出现透明的水解圈来区别产酶菌株（见图6-2）。变色圈法：对于一些不易产生透明圈产物的产生菌，可在底物平板中加入指示剂或显色剂，使所需微生物能被快速鉴别出来。产生有机酸或者胺的微生物，通常采用pH值指示剂可检测出来，如将溴麝香草酚蓝的中性红色溶液加入到琼脂营养培养基中，通过菌落周围代表产酸反应或产碱反应的指示剂颜色变化，可决定是否产生该物质。 在分离谷氨酸产生菌时，可在培养基中加入溴百里酚蓝，它是一种酸碱指示剂，变色范围在pH6.27.6，当pH在6.2以下时为黄色，pH 7.6以上为蓝色。若平板上出现产酸菌，其菌落周围会变成黄色，可从这些产酸菌中筛选谷氨酸产生菌。表6-3 微生物特异性平板检测方法有机酸柠檬酸 pH值指示剂的颜色变化，或掺入琼脂平板的碳酸钙的溶解胞外酶1 淀粉酶 由碘指示的可溶性淀粉的液化2 蛋白酶 酪蛋白的溶解3 脂肪酶 乳化的三丁酸甘油酯的液化，消除或向橄榄油琼脂中添加0.05%-0.25%的OsO4溶液或中性红溶液4 果胶酶 果胶凝胶的液化（1.5%的聚果胶酸钠），多糖沉淀剂5 弹性蛋白酶 弹性蛋白的溶解6 核酸酶（DNA，RNA） 未水解的核酸的沉淀，酸过量时可见浑浊，或者氮蒽橙荧光和紫外荧光7 磷酸酯酶C 卵磷脂平板的浑浊圈8 磷酸酯酶A 卵磷脂平板的透明圈9 纤维素酶 纤维素平板的透明圈10 酯酶 氯化钙和Tween20释放出的月桂酸反应生成月桂酸钙沉淀，或者7-羟-4甲基香豆素荧光反应11 DNA酶 亚甲胺蓝的DNA荧光反应12 过氧化物酶 喷洒对茴香碱-过氧化氢酶抑制剂 （用含酶的琼脂平板上的抑制圈筛选）胰蛋白酶抑制剂或蛋白酶抑制剂生长圈法：生长圈法通常用于分离筛选氨基酸、核苷酸和维生素的产生菌。其中工具菌是一些相对应的营养缺陷型菌株。将待检菌涂布于含高浓度的工具菌并缺少所需营养物的平板上进行培养，若某菌株能合成平板所需的营养物，在该菌株的菌落周围便会形成一个混浊的生长圈。如嘌呤营养缺陷型大肠杆菌与不含嘌呤的琼脂混合倒平板，在其上涂布含菌样品保温培养，周围出现生长圈的菌落即为嘌呤产生菌。图6-2 淀粉透明圈 图6-3 抑菌圈抑菌圈法：抑菌圈法是常用的抗生素产生菌的初筛方珐，其检测菌采用抗生素的敏感菌。若被检菌能分泌某些抑制菌生长的物质，如抗生素等，便会在该菌落周围形成工具菌不能生长的抑菌圈，测量抑菌圈大小，根据有效指标(抑菌圈直径与菌落直径之比)选出高产菌株（见图6-3）。采用该方法已得到许多有用的抗生素，如春雷霉素和青霉素等。该种方法中检测菌的选择十分重要，它直接关系到检出的灵敏度和筛选到的抗生素活性及抗菌谱。2、厌氧微生物的分离纯化要分离厌氧性微生物，如生产丙酮丁醇的梭状芽孢杆菌，白酒生产上增香用的丁酸菌、已酸菌及用于环境污水处理和水产养殖用的光合菌、反硝化菌、脱氮排硫杆菌等。它们生长于水底层及沉积物中，要从样品中分离这类菌，需采取厌气培养法。因为专性厌氧菌与分子氧接触很快会被杀死，所以要求微生物与空气的接触降至最少或完全隔绝。许多专性厌氧菌最初仅能生长在低氧化还原电位(约150毫伏或更低)的培养基中，因此可以将培养基“预还原”，即在培养基中加入半胱氨酸、巯基化物、硫化钠或抗坏血酸等还原剂，然后将此类培养基隔绝空气贮藏(如贮器内充入CO2或N2)。若分离时菌株可短暂接触空气，就可用划线法。划线后放到一密封的贮器中抽真空或充N2加以培养。也可用化学法吸收O2，例如利用焦性没食子酸与NaOH反应将氧除去。每吸收100毫升空气中的氧，需用焦性没食子酸l克及10NaOH溶液10毫升。目前较先进的厌氧培养的方法采用在厌氧培养箱或厌氧袋进行培养，已有较完善的商品化系列。（四）菌种筛选、性能评价及菌种的初步鉴定1菌种筛选、菌种性能评价在目的菌株分离的基础上，初筛就是进一步筛选目的产物生产能力高的菌株。菌株的分离和初筛往往是结合在一起进行的，分离时所采用的选择培养基和特异性平板检测方法等本身就包含了筛选的内容。虽然平板法是常用的初筛方法，但由于是固体培养，与液体培养条件差距较大，需进一步采用摇瓶培养法来筛选。由于摇瓶培养法更接近于发酵罐培养的条件，效果一致。初筛由于菌株量相对还较大，故一般一个菌株接一个瓶，在摇床上及合适的温度条件下振荡培养，并对产物进行活性测定。初筛的淘汰率在85%90%，剩下的较好菌株要进行摇瓶复筛，复筛是进一步挑出那些确实有工业应用价值的微生物，排除那些不具潜力的微生物。菌种性能测定包括菌株的毒性试验和生产性能测定。此时一个菌株通常要重复35个瓶，筛选时的培养条件确定是关键，如培养基、温度、pH、供氧等，应该根据菌株性能、产物代谢途径、类似产品的培养条件以及前人的经验等进行综合考察，防止漏筛。培养后的发酵液采用精确的分析方法测定，选出较优良的菌株23株。一般筛选过程，即初筛，复筛、再次复筛，重复至获得可靠的少数几株后进行较全面的考察。这种直接从自然界样品中分离出来具有一定生产性能的菌株称为野生型菌株。这种野生型菌种往往低产甚至不产所需的产物，只有经过进一步的人工改造才能真正用于工业发酵生产。所以，我们常将这野生型菌株称为进一步育种工作的原始菌株或出发菌株。 2微生物的初步鉴定 确定菌种的类别尽可能的将其分类到种或属是很有价值的因为这样我们就可以将新分离得到的菌种与那些文献上已记载的能产生发酵产品的菌种作一比较，对菌种的分类也可使我们对该菌种对植物、动物或人是否有致病性做一预测，这一点在微生物的操作中是必须考虑的。另外还可以在某种程度上推测一下在研究这些微生物时要考虑的生长特性和其他要求。微生物的分类通常是一个耗时、费力的过程，所以，除非其具有确切的的工业前景，否则我们并不希望进行详细分类，只分至大类就可以了。但是如果要注册专利时就应将其鉴定至种，对于一个新的微生物的应用获得专利是大有益处的，这可以在微生物工艺前加上一个“新颖”或“新”的字样。第二节 微生物遗传学一、遗传变异的物质基础遗传的物质基础是蛋白质还是核酸，曾是生物学中激烈争论的重大问题之一。利用微生物作为生物对象设计的 3个著名实验，以确凿的事实证明了DNA和RNA为遗传变异物质基础。（一）经典转化实验DNA作为遗传物质格里菲斯（1928 年）以肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）作研究对象，是一种球形细菌，常成双或成链排列，菌体外有多糖的荚膜包围，其菌落表面光滑（smoth），故称S型，可使人患肺炎；另一为不形成荚膜、菌落外观粗糙（rough），称为 R 型，它在动物体内易被吞噬细胞吞噬，对动物不具毒力，是非致病菌株。格里菲斯发现将R型肺炎双球菌菌株与经加热杀死的S型菌株混合后，注射小鼠，能毒死小鼠，并从死鼠血中可以分离到S型菌株。这现象被认为是S型菌株和R型菌株发生了转化(Transformation)。见图64。O.T.Avery等(1944年)为了弄清楚Griffith实验中的转化因子的实质，从加热杀死的肺炎链球菌中提纯了几种有可能作为转化因子的成分，并深入到离体条件下进行转化实验。从活的 S菌中抽提各种细胞成分（DNA，蛋白质，荚膜多糖等）,并对各种生化组分进行转化试验。如图65。图64肺炎链球菌转化实验图65 肺炎链球菌体外转化实验上述结果表明，只有 S型菌株的 DNA能将R 型菌株转化为 S型。分别用蛋白酶和核酸酶处理转化因子，进一步证实转化现象与蛋白质、荚膜多糖和RNA无关，只与DNA有关，而且DNA纯度越高，转化效率也越高。这就说明，S型转移给 R 型的决不是遗传性状（在这里是荚膜多糖）的本身，而是以 DNA 为物质基础的遗传信息，UDP葡萄糖脱氧酶基因使UDP葡萄糖转变为多糖荚膜前体UDP葡萄糖醛酸。（二）噬菌体感染实验DNA是遗传物质A.D.Hershey和 M .Chase（1952年）用同位素对大肠杆菌噬菌体T2的感染过程进行了示踪研究。因为蛋白质含有硫元素（S），不含磷元素（P），而DNA含有磷元素（P），不含硫元素（S）。故用同位素32P和35S分别标记T2噬菌体的DNA与蛋白质。然后用标记的T2噬菌体(32P或35S)分别感染大肠杆菌，经10分钟后，用搅拌器甩掉附着于细胞外面的噬菌体外壳。发现在第一种情况下，基本上全部放射活性见于细菌内而不被甩掉并可传递给子代。在第二种情况下，放射性活性大部分见于被甩掉的外壳中，细菌内只有较低的放射性活性，且不能传递给子代(图66)。图66 T2噬菌体感染实验（引自Russell, 2000）这说明在噬菌体感染过程中，蛋白质外壳未进入宿主细胞，进入宿主细胞是DNA，并增殖、装配成完整的子代噬菌体粒。这就有力地证明，在其DNA 中，存在着包括合成蛋白质外壳在内的整套遗传信息。（三）植物病毒的重建实验RNA是遗传物质H .Fraenkel-Conrat（1956 年）用含 RNA 的烟草花叶病毒（TMV）作的著名的植物病毒重建实验证明烟草花叶病毒（TMV）的主要感染成分是其核酸（RNA）。烟草花叶病毒经弱碱、尿素、去垢剂等处理，能将它的蛋白质外壳与 RNA 核心相分离，二者重新混合后，病毒粒子又会重建。在实验中，还选用了另一株与 TMV 近缘的霍氏车前花叶病毒（HRV）。实验过程和结果可见图67。当用由 TMV - RNA 与 HRV - 衣壳重建后的杂合病毒去感染烟草时，烟叶上出现的是典型的 TMV 病斑。分离出来的新病毒也是典型 TMV 病毒。这就证明核酸RNA 也是遗传物质。而HR RNA与TMV蛋白重建的杂种病毒，经TMV抗体处理，杂种病毒颗粒被钝化失活，进一步证明主要感染成分是RNA，病毒外壳蛋白起保护作用。这 3个具有历史意义的经典实验，得到了一个确信无疑的共同结论：只有核酸才是负载遗传信息的真正物质基础。图67 病毒重建实验示意图(引自Klug and Cummings，2000)二、微生物的染色体分子结构（一）原核微生物拟核体与真核生物相比，原核微生物的染色体要简单得多，其染色体通常只有一个核酸分子(DNA或RNA)，其遗传信息的含量也比真核生物少得多。病毒染色体只含一个DNA或者RNA分子，可以是单链也可以是双链；大多呈环状，少数呈线性分子。细菌染色体均为环状双链DNA分子。虽然病毒和细菌的染色体比真核生物小得多，但其伸展长度比其本身仍要大得多，如大肠杆菌(Escherichia coli) 的DNA分子伸展有1200m长，而菌体直径只有12m，那么这样长的DNA是如何装配到病毒或者细菌里去的呢？如图68所示大肠杆菌染色体为双链环状的DNA分子，在细胞中以紧密缠绕成的较致密的不规则小体形式（拟核）存在于细胞中，其上结合有类组蛋白蛋白质和少量RNA分子，使其压缩成一种手脚架形的(scaffold)致密结构(大肠杆菌DNA分子长度是其菌体长度的1000倍，所以必须以一定的形式压缩进细胞中) 。大肠杆菌及其它原核细胞就是以这种拟核形式在细胞中执行着诸如复制、重组、转录、 翻译以及复杂的调节过程。研究发现，原核生物的染色体并不是象过去人们认为的那样是“露裸”的DNA分子，其DNA分子同样与蛋白质和RNA等其它分子结合。例如：大肠杆菌DNA与几种DNA结合蛋白(DNA-binding protein)相结合。这些DNA结合蛋白很小，但在细胞内数量很多，它们含有较高比例的带正电荷氨基酸，可以与DNA带负电荷的磷酸基团相结合，其特性与真核生物染色体中的组蛋白(histone)相类似。大肠杆菌的染色体DNA除与蛋白质结合外，还结合有RNA。它的染色体是由50100个独立的负超螺旋环组成的环状结构(图69)。RNA和蛋白质结合在上面，以保持其结构的稳定性。 图68大肠杆菌染色体 图69 原核微生物染色体模型 （二）真核微生物染色体1染色质的基本结构 染色质(chromatin)是染色体在细胞分裂的间期所表现的形态，呈纤细的丝状结构，故亦称为染色质线(chromatin fiber)。在真核生物中，它是脱氧核糖核酸(DNA)和蛋白质及少量核糖核酸(RNA)组成的复合物，其中DNA的含量约占染色质重量的30。蛋白质包括组蛋白和非组蛋白二类，组蛋白是与DNA结合的碱性蛋白，有H1、H2a、H2b、H3和H4等五种，其在细胞中的比列大致为12222。它们几乎为所有生物和细胞所共有，与DNA的含量比率大致相等，是很稳定的，在染色质结构上具有决定的作用。而非组蛋白在不同细胞间变化很大，在决定染色体结构中作用可能不是很大，它们可能与基因的调控有关。近来研究发现，染色质的基本结构单位是核小体(nucleosome)、连接丝(linker)和一个分子的组蛋白H1。每个核小体的核心是由H2A、H2B、H3和H4四种组蛋白各以两个分子组成的八聚体，其形状近似于扁球状 (图610)。DNA双螺旋就盘绕在这八个组蛋白分子的表面。连接丝把两个核小体串联起来，它是两个核小体之间的DNA双链。组蛋白H1结合于连接丝与核小体的接合部位，影响连接丝与核小体结合的长度。如果H1被除去，其核小体的基本结构并不会因此而改变。据测定，大部分细胞一个核小体及其连接丝约含有180200个碱基对(base pair，bp)的DNA，其中约146个碱基对盘绕在核小体表面1.75圈，其余碱基对则为连接丝，其长度变化较大，从短的8个碱基对到长的114个碱基对。图610 核小体结构模型（引自Russell，2000）根据染色反应，间期细胞核中的染色质可以分为两种：异染色质(heterochromatin)和常染色质(euchromatin)。异染色质是染色质线中染色很深的区段，这称为异染色质区(heterochromatin region)；常染色质是染色很浅的区段，这称为常染色质区(euchromatin region)。据分析，异染色质和常染色质在化学性质上并没有什么差别，只是在细胞分裂间期异染色质高度螺旋化而紧密卷缩，而常染色质区的染色质表现为脱螺旋而呈松散状态。染色体的这种结构与功能密切相关，常染色质可经转录表现为活跃的遗传功能，而异染色质一般不编码蛋白质，只对维持染色体结构的完整性起作用。2染色体的结构模型 染色体的结构是由两条染色单体(chromatid)组成的。每条染色单体包括一条染色线(chromonema)，以及位于线上许多染色很深、颗粒状的染色粒(chromomere)。染色粒的大小不同，在染色线上有一定的排列顺序。每个染色体所含的染色质线是单线的，即一个染色体所包含的两条染色单体都分别是单线的，换言之，每条染色单体是一个DNA分子与蛋白质结合形成的染色质线。在细胞分裂过程中染色质线到底是怎样卷缩成为一定形态结构的染色体的呢？现在认为至少存在三个层次的卷缩(图611)：第一个层次是DNA分子超螺旋化形成核小体，产生直径约为10nm的间期染色质线，在此过程中组蛋白H2A、H2B、H3和H4参与作用。第二个层次是核小体的长链进一步螺旋化形成直径约为30nm的超微螺旋，称为螺线管(solenoid)，此过程中组蛋白H1参与作用。最后是染色体螺旋管进一步卷缩, 并附着于由非组蛋白形成的骨架(scaffold)或者称中心(central core)(图611)上面成为一定形态的染色体。但有关三个层次卷缩的机理至今尚不清楚。因为染色体本身就是细胞分裂期间染色质的卷曲压缩，所以染色体也会象染色质一样，出现异染色质区和常染色质区。图611 染色体结构模型3着丝粒和端体 染色体另外二个重要的结构就是着丝粒(centromoere)和端体(telomere)。着丝粒是染色体的缩缢部位，是细胞分裂过程中纺锤丝(spindle fiber)结合的区域，染色体在有丝分裂和减数分裂过程中在纺锤丝的牵引下分向二极。因此，着丝粒在细胞分裂过程中，对染色体向子细胞的正确分配起着关键的作用。缺少着丝粒的染色体片段，由于没有纺锤丝的牵引，在细胞分裂过程中经常容易丢失。端体(telomere)也就是染色体的末端，存在着特珠的结构。主要有三方面的功能：一是防止染色体末端为DNA酶酶切；二是防止染色体末端与其它DNA分子的结合；三是使染色体末端在DNA复制过程中保持完整。对不同物种染色体末端的结构分析发现，所有染色体的末端都存在着串连的重复序列。尽管不同生物的重复序列有所不同，但均可用下列通式表示：5-T1-4 - A0-1 G1-8 3。如人类为TTAGGG，原生动物嗜热四膜虫(Tetrahymena thermophila) 为TTGGG，而植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)为TTTAGGG。但这种保守序列重复的次数在不同生物、同一生物的不同染色体，甚至同一染色体在不同的细胞生长时期也可能不同。有关端体的具体结构有待进一步研究。三、微生物基因组（一）基因与基因组的概念1基因概念及其发展经典遗传学中关于基因的概念 按照经典遗传学对基因的概念，基因具有下列共性：基因具有染色体的主要特性，能自我复制，有相对的稳定性，在有丝分裂和减数分裂中有规律的进行分配；基因在染色体上占有一定位置(位点)，并且是交换的最小单位，即在重组时不能再分隔的单位；基因是以一个整体进行突变的，故它又是一个突变单位；基因是一个功能单位，它控制着正在发育有机体的某一个或某些性状，如红花、白花等。可以把重组单位和突变单位统称为结构单位。这样，基因既是一个结构单位，又是一个功能单位。分子遗传学关于基因的概念 分子遗传学的发展揭示了遗传密码的秘密，使基因的概念落实到具体的物质上，获得了具体的内容。广泛的试验证明，DNA是主要的遗传物质，基因在DNA分子上，基因（gene）是一个具有特定核苷酸顺序的核酸片段，在生物体内具有自主复制能力的遗传功能单位，包括编码蛋白质多肽链的核酸序列，也包括保证转录所必需的核酸调控序列以及5和3端的非翻译序列。另一方面，在精细的微生物遗传分析中查明，基因并不是不可分割的最小遗传单位，而是远为复杂得多的遗传和变异的单位。例如，在一个基因的区域内，仍然可划分出若干个起作用的小单位。按照现代遗传学的概念，重组、突变、功能这三个单位应该分别是：突变子(muton)， 它是性状突变时，产生突变的最小单位。一个突变子可以小到只是一个核苷酸；重组子 (recon)， 在发生性状的重组时，可交换的最小的单位称为重组子。据微生物重组的精细研究证明，一个交换子可只包含一对核苷酸；顺反子(作用子)(cistron)， 这一术语表示一个起作用的单位，基本上符合通常指的基因。一个作用子所包括的一段DNA与一个多肽链的合成相对应。由此可知，基因是一个功能单位的概念仍然是正确的，但不是最小的结构单位。因为作为结构单位的基因实际上包含大量的突变子或重组子。然而关于基因的概念是：(1)可转录一条完整的RNA分子，或编码一条多肽链；(2)功能上被顺反测验(cis-trans test)或互补测验(complementary test)所规定。可以说，分子遗传学保留了功能单位的解释，而抛弃了最小结构单位的说法。随着基因结构和功能的深入研究，使基因的概念有了新的内容和认识，进一步可将基因分为不同类型。l 结构基因 (structural gene)，可编码RNA或蛋白质的一段DNA序列；l 调控基因 (regulator gene)，其产物参与调控其它结构基因表达的基因；l 重叠基因(overlapping gene)，指同一段DNA的编码顺序，由于阅读框架(open reading frame，ORF)的不同或终止早晚的不同，同时编码两个或两个以上多肽链的现象; l 隔裂基因(split gene)，指一个结构基因内部为一个或更多的不翻译的编码顺序，如内含子(intron)所隔裂的现象；l 跳跃基因(jumping gene)，可作为插入因子和转座因子移动的DNA序列，有人将它作为转座因子的同义词；l 假基因 (pseudogene)，同已知的基因相似，但位于不同位点，因缺失或突变而不能转录或翻译，是没有功能的基因。还有根据基因来源将基因分为核基因，线粒体基因，叶绿体基因等。2基因组概念自然界绝大多数生物体的遗传信息贮存在DNA的核苷酸排列顺序中。DNA是巨大的生物高分子，一般将细胞内遗传信息的携带者在染色体所包含的DNA总体称为基因组(genome)。细菌在一般情况下是一套基因，即单倍体(hoploid)；真核微生物通常是有二套基因又称二倍体(diploid)。基因组通常是指全部一套基因。由于现在发现许多非编码序列具有重要的功能，因此目前基因组的含义实际上是指细胞中基因以及非基因的DNA序列组成的总称，包括编码蛋白质的结构基因、调控序列以及目前功能还尚不清楚的DNA序列。同一物种的基因组DNA含量总是恒定的，不同物种间基因组大小和复杂程度则差异极大，一般讲，进化程度越高的生物体其基因组构成越大、越复杂，见(表64)。表64有代表性的生物体内DNA大小分子量碱基对（bp)最简单的微生物SV40病毒31065103噬菌体3.41075104细菌大肠杆菌2.21094.6106哺乳动物小鼠1.510122.3109人1.810122.8109（二）原核微生物基因组特点（1）基因组较小，没有核膜包裹，且形式多样，如病毒基因组可能是DNA，也可能是RNA，可能是单链的，也可能是双链的，可能是闭环分子，也可能是线性分子；细菌染色体基因组则常为环状双链DNA分子，并与其中央的RNA和支架蛋白构成一致密的区域，称为类核(nucleoid)。（2）具有操纵子结构。功能相关的结构基因常常串连在一起，并转录在同一个mRNA分子中，称为多顺反子mRNA(polycistronic mRNA)，然后再加工成各种蛋白质的模板mRNA。（3）DNA分子绝大部分用于编码蛋白质，不编码部分(又称间隔区)通常包含控制基因表达的顺序。例如，噬菌体x 174中只有5%是非编码区。（4）基因重叠是病毒基因组的结构特点，即同一段DNA片段能够编码两种甚至三种蛋白质分子。（5）除真核细胞病毒外，基因是连续的，即不含内含子序列。 大肠杆菌是目前研究得最深入的一种代表性的细菌原核微生物。其基因组是双链环状的DNA分子，在细胞中以紧密缠绕成的较致密的不规则小体形式（拟核）存在。基因组全序列测定于1997年由Wisconsin大学的Blattner等人完成，其基因组结构特点如下： 1遗传信息的连续性大肠杆菌和其它原核生物中基因数基本接近由它的基因组大小所估计的基因数(通常以1000bp1500bp为一个基因计)，说明这些微生物基因 组DNA 绝大部分用来编码蛋白质、RNA；用作为复制起点、启动子、终止子和一些由调节蛋白识别 和结合的位点等信号序列。除在个别细菌(鼠伤寒沙门氏菌)和古生菌的rRNA和tR NA中发现有内含子或间插序列外，其它绝大部分原核生物不含内含子，遗传信息是连续的而不是中断的。2功能相关的结构基因组成操纵子结构 大肠杆菌总共有2584个操纵子，基因组测序推测出2192个操纵子。其中73%只含一个基因，16.6%含有2个基因，4.6%含有3个基因，6%含有4个或4个以上的基因。大肠杆菌有如此多的操纵子结构，可能与原核基因表达多采用转录调控有关，因为组成操纵子有其方便的一面。此外有些功能相关的RNA基因也串联在一起，如构成核糖核蛋白体的三种RNA基因转录在同一个转录产物中，它们依次是16SrRNA、23SrRNA、5SrRNA。这三种RNA除了组建核糖体外，别无他用，而在核糖体中的比例又是111，倘若它们不在同一个转录产物中，则或者造成 这三种RNA比例失调，影响细胞功能；或者造成浪费；或者需要一个极其复杂、耗费巨大的调节机构来保持正常的111。3结构基因的单拷贝及rRNA基因的多拷贝 在大多数情况下结构基因在基因组中是单拷贝的，但是编码rRNA的基因rrn往往是多拷贝的，大肠杆菌有7个rRNA操纵子，其特征都与基因组的复制方向有关，即按复制方向表达。4基因组的重复序列少而短 原核生物基因组存在一定数量的重复序列，但比真核生物少得多，而且重复的序列比较短，一般为440个碱基，重复的程度有的是十多次，有的可达上千次。 （三）真核生物基因组特点（1）真核生物基因组DNA与蛋白质结合形成染色体，储存于细胞核内，除配子细胞外，体细胞内的基因组是双份的(即双倍体，diploid)，即有两份同源的基因组。（2）真核细胞基因转录产物为单顺反子(monocistron)，即一个结构基因转录、翻译成一个mRNA分子，一条多肽链。（3）存在大量重复序列，即在整个DNA中有许多重复出现的核苷酸顺序，重复序列长度可长可短，短的仅含两个核苷酸，长的多达数百、乃至上千。重复频率也不尽相同；高度重复序列重复频率可达106次，包括卫星DNA、反向重复序列和较复杂的重复单位组成的重复序列；中度重复序列可达103104次，如为数众多的Alu家族序列，KpnI家族，Hinf家族序列，以及一些编码区序列如rRNA基因、tRNA基因、组蛋白基因等；单拷贝或低度重复序列，指在整个基因组中只出现一次或很少几次的核苷酸序列，主要是编码蛋白质的结构基因，在人基因组中占约6065%，因此所含信息量最大。（4）基因组中不编码的区域多于编码区域。（5）基因是不连续的，在真核生物结构基因的内部存在许多不编码蛋白质的间隔序列(intervening sequences)，称为内含子(intron)，编码区则称为外显子(exon)。内含子与外显子相间排列，转录时一起被转录下来，然后RNA中的内含子被切掉，外显子连接在一起成为成熟的mRNA，作为指导蛋白质合成的模板。（6）基因组远大于原核生物的基因组，具有许多复制起点，而每个复制子的长度较小。 啤酒酵母是单细胞真核生物，1996年，由欧洲、美国、加拿大和日本共96个实验室的633位科学家的艰苦努力完成了全基因组的测序工作，这是第一个完成测序的真核生物基因组。该基因大小为13.5106bp，分布在16个不连续的染色体中。像所有其它的真核细胞一样，酵母菌的DNA也是与四种主要的组蛋白(H2A、H2B、H3和H4)结合构成染色质(chromatin)的核小体核心DNA；染色体DNA上有着丝粒(centromere)和端粒(telomere)，没有明显的操纵子结构，有间隔区或内含子序列。酵母菌基因组最显著的特点是高度重复， tRNA基因在每个染色体上至少是4个，多则30多个，总共约有250个拷贝(大肠杆菌约60个拷贝)。rRNA基因位于号染色体的近端粒处，每个长9137bp，有100200个拷贝。酵母基因组全序列测定完成后，在其基因组上还发现了许多较高同源性的DNA重复序 列，并称之为遗传丰余(genetic redundancy)。酵母基因组的高度重复或遗传丰余是一种浪费和多余呢?还是一种进化的策略呢?显然应该是后者，所有现存的生物在自然的不断选择下 ，总是以合适的结构特征来完成其生命过程。四、染色体外遗传成份基因不仅存在在染色体上，还存在于细胞中的染色体外的遗传因子上，这些染色体外的遗传因子见图612。（一）原核微生物核外遗传物质1质粒的复制 质粒（图613、614）是一个复制子(replicon)，它的复制若与核染色体复制同步，称严紧型复制控制(Stringent replication control)，一般细胞内只含12个这种质粒；另一类质粒复制与核染色体复制不同步，称松驰型复制控制(Relaxed replication control)，一般细胞内含1015个甚至更多的这类质粒。少数质粒可以在不同的菌株之间转移，如F因子和R因子等。遗传物质类型核染色体原核生物的染色体真核生物的染色体原核生物的核外遗传因子细胞质基因（线粒体 叶绿体等）真核生物的共生生物：卡巴颗粒酵母菌：2mm质粒F因子（ F质粒）R因子（R质粒） Col质粒Ti质粒巨大质粒降解性质粒图612 染色体内和染色体外的遗传因子革兰氏阴性细菌中多数质粒的复制方式与染色体复制类似，包括在复制起始位点的开始,围绕环形分子的双向复制，出现型中间体等。也有些质粒是单向的复制。参与质粒复制的酶均为细胞中正常的酶，质粒本身的遗传因子控制着复制的起始时间，以及将复制后的质粒分配到两个子细胞中。而在革兰氏阳性菌中多数质粒的复制是通过滚环机制，这种复制会形成单链的中间体，因此这些质粒有时就是单链DNA质粒。已知多数线型质粒的复制机制是以一种蛋白结合在双链的5末端，从而引导DNA的合成。图613 质粒的电镜图片（箭头所示） 图614 质粒DNA的三种形式某些质粒具有与核染色体DNA发生整合的功能，如F因子，这类质粒称为附加体（Episome）。质粒还具有重组的功能，可在质粒之间、质粒与核染色体之间发生重组。有许多种方法处理宿主细胞可去除质粒，这一过程称为消除。丫啶类染料、丝裂霉素C、紫外线、利福平、重金属离子或高温等因素处理含质粒的细胞时，由于质粒的复制受到抑制，而核染色体的复制仍继续进行，可以使子代细胞中的质粒消除。2质粒的类型 大多数质粒控制着宿主的一种或几种特殊的性状，具有一定表现型，按其表现型不同分为以下几类型。F因子（fertility factor） 或称为致育因子或性因子，又称F质粒，这是最早发现的一种与大肠杆菌的有性生殖现象(接合作用)有关的质粒。它决定细菌的性别，与细菌接合作用有关。其大小约100kb，分子量63MDa，可分为复制控制区、插入与缺失区和转移操纵子等3个部分（如图615）。图615所示内圈的数字单位为kb，表示质粒的大小。F质粒上各个基因的含义：tra表示转移功能；oriT为转移起始；oriS为复制起始；inc表示不相容；rep是复制功能。黑色区域表示转座子，通过这些部位可以整合进细菌染色体上相同的区域形成各种Hfr菌株。图615 大肠杆菌F(致育)质粒的基因图。携带F质粒的菌株称为F+菌株(相当于雄性)，无F质粒的菌株称为F-菌株(相当于雌性)。F质粒整合到宿主细胞染色体上的菌株称之为高频重组菌株(high frequence recombination, 简称Hfr)。由于F因子能以游离状态(F+)和以与染色体相结合的状态(Hfr)存在于细胞中。 F质粒在大肠杆菌的接合作用(conjugation)中起主要作用。当Hfr菌株上的F因子通过重组回复成自主状态时，有时可将其相邻的染色体基因一起切割下来，而成为携带某一染色体基因的F因子，例如F-lac、F-gal、F-pro等。因此将这些携带不同基因的F因子统称为F，带有这些F因子的菌株也常用F表示。R因子（resistance factor）又称抗药性质粒，是分布最广、研究得最充分的质粒之一。主要包括抗药性和抗重金属二大类，简称R质粒。带有抗药性因子的细菌有时对于几种抗生素或其他药物呈现抗性。例如R1质粒(94kb)可使宿主对下列五种药物具有抗性：氯霉素(Chlorampenicol, Cm)、链霉素(Streptomycin, Sm)、磺胺(Sulfonamide, Su)、氨苄青霉素(Ampicillin, Ap)和卡那霉素(Kanamycin, Km)，并且负责这些抗性的基因是成簇地存在于R1抗性质粒上。它能赋予宿主抵抗各种抗生素或生长抑制剂的功能。研究表明，细菌的耐抗生素的性状主要是由于R因子在菌株之间迅速转移所致。抗重金属R质粒能使宿主细胞对许多金属离子呈现抗性，包括碲(Te6+)、砷(As3+) 、汞(Hg2+)、镍(Ni2+)、钴(Co2+)、银(Ag+)、镉(Cd2+)等。 在肠道细菌中发现的R质粒，约有25%是抗汞离子的，而铜绿假单胞菌中约占75%。R因子一般由相连的二个DNA片段组成，其一称RTF质粒（resistance transfer factor, 抗性转移因子），它含调节DNA复制和转移的基因；其二是抗性决定质粒（r-determinant），含有抗性基因，如：青霉素抗性（penr），氨苄青霉素抗性（Ampr），氯霉素抗性（Camr），四环素抗性（Strr），卡那霉素抗性（Kanr）及磺胺药物抗性（Sulr）等。由RTF质粒和抗性决定质粒结合而形成R因子的过程见图616。 图616 R因子的结构组成 此外，R因子能自行重组，即来自两种不同耐药菌株的R 因子基因整合在一起，构成多重耐药菌株。R因子也是借助性纤毛进行接合而传递的，在R因子和F因子之间也能发生重组，但R 因子不能整合到核染色体上，所以它不是附加体而是一种稳定的质粒。 R因子在细胞内的数量可从1至2个到几十个不等，分属严紧型和松弛型复制控制。后者经氯霉素处理后，拷贝数甚至可达2000-3000个。因为R因子对多种抗生素有抗性，因此，可作为菌株筛选时的遗传标记，也可用作基因转移的载体。Col因子（Colicinogenic factor）又称为产大肠杆菌素因子。因这类质粒首先发现于大肠杆菌中而得名，该质粒含有编码大肠菌素的基因，大肠菌素是一种细菌蛋白，通过抑制复制、转录、翻译或能量代谢等而专一性地杀死近缘且不含Col质粒的菌株，而宿主不受其产生的细菌素的影响，质粒本身编码一种免疫蛋白，从而使宿主对大肠杆菌素有免疫作用，不受其伤害。Col质粒分子量约41048104Da，分两类，分别以ColE1和ColIb为代表。前者分子量小，约为5106Da，是多拷贝和非转移性的；后者的分子量约为80106Da，只有12个拷贝，可通过性纤毛转移。但由于Col因子有较弱的阻遏系统，它不能象F因子或R因子那样在群体中快速传播。由G+细菌产生的细菌素通常也是由质粒基因编码，有些甚至有商业价值，例如一种乳酸细菌产生的细菌素NisinA能强烈抑制某些G+细菌的生长，而被用于食品工业的保藏。毒性质粒 许多致病菌的致病性是由其所携带的质粒引起的，这些质粒具有编码毒素的基因，如苏云金杆菌含有编码内毒素(伴孢晶体中)的质粒、大肠杆菌编码肠毒素的质粒以及根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)Ti质粒（Tumor inducing plasmid）。其中主要代表Ti质粒是引起双子叶植物冠瘿瘤的致病因子，其宿主是一种根癌土壤杆菌。其机制是Ti质粒上的一段特殊DNA片段转移至植物细胞内并整合其染色体上，导致细胞无控制的瘤状增生，合成正常植物所没有的冠瘿碱(opines)化合物，该DNA片段称为T-DNA其上含有三个致癌基因。Ti质粒长200kb，是大型质粒，当前Ti质粒已成为植物遗传工程研究的重要载体，一些具重要性状的外源基因可借DNA重组技术插入到Ti质粒中，并进一步使之整合到植物染色体上，以改变植物的遗传性，达到培育植物优良品种的目的。共生质粒 为近年来在根瘤菌属（Rhizobium）中发现的一种质粒，分子量为200300X106Da，比一般的质粒大几十倍至几百倍，故称巨大质粒。质粒上有一系列固氮基因。降解性质粒 这类质粒