动物垫料中绿脓杆菌检测方法 编制说明 2019.12.20

DB15/T XXXXXXXXX编制说明项目名称：动物垫料中绿脓杆菌检测 项目编号：内质监标函（2018）154号-106 编制单位：呼和浩特海关 编制时间：2018.05-2019.10 一、 工作简况本标准根据关于下达2018年第一批内蒙古自治区地方标准制修订项目计划的通知内质监标函（2018）154号，本标准是由中华人民共和国呼和浩特海关提出并归口，项目计划编号为106。呼和浩特海关牵头成立由相关领域的专业技术人员和具有标准化专业知识的人员组成的标准起草组。起草组在充分调查研究、综合分析和试验验证的基础上，起草标准初稿和编制说明，并广泛征求意见。对意见进行汇总整理，修改完善标准初稿，形成地方标准征求意见稿。第一起草单位：中华人民共和国呼和浩特海关；第二起草单位：二连浩特海关；第三起草单位：二连浩特市疾病预防控制中心。本标准主要起草人：赵治国、敖威华、杨帆、延涵、王海艳、陈林军、崔强、韩祎陟、郭文丽、马彩霞。二、标准制定的背景及意义动物垫料与动物关系密切。近年来随着生物科学研究的飞速发展，动物作为其研究中不可缺少的重要组成部分，备受各国政府的重视和科学家的关注。垫料是为动物营造舒适的人工环境，进行环境控制的基础条件和必要材料，是对动物产生直接作用和影响的环境因素。动物垫料与动物健康、福利息息相关，同时也对养殖业、动物及其相关科研方面甚至社会经济发展有十分重大的影响。因此，垫料的质量评定与控制非常必要。 我国动物垫料标准化、商品化尚处于初级阶段。欧美等发达国家早已实行垫料商品化生产，有专业的工厂，并且各道工序的质量要求非常严格。但我国对动物垫料的研究还处于初级阶段，与垫料相关的文献报道甚少，垫料生产监管环节薄弱，检测标准缺乏。近年来我国政府及从业人员逐渐认识到动物垫料中存在的问题，开始对垫料质量评价方面的问题进行改进。因此要想使动物的质量管理与国际接轨，动物垫料生产的标准化、商品化就变得至关重要。我国动物垫料标准化和质量管理相对滞后，影响相关行业发展。我国对动物垫料的研究才刚刚起步，现行的国家标准和实验动物相关管理条例中，对动物垫料的标准化规定几乎空白，稀数资料对于垫料的规定只有：应选用吸湿性好、尘埃少、无异味、无毒性、无油脂的材料；须经消毒、灭菌后方可使用。如此笼统的规定在一定程度上制约了我国动物垫料标准不能紧跟国际标准，同时限制了药品、生物制品、动物等产品的出口，还使科研论文将不能被同行接受。因此要想提高相关学科竞争力，就必须加强垫料标准化和质量管理，从动物垫料微生物指标监测入手。我国动物垫料微生物检测标准几乎空白，亟待建立相关标准。近年来，我国政府及从业人员逐渐认识到动物垫料对动物健康及下游产业的重大意义，垫料相关研究报道逐年增多，积累了一定的理论基础。但目前，我国尚未对国内垫料质量建立统一评价体系、风险分析、国家标准及配套法规。其中，垫料中微生物特别是致病微生物的含量对动物健康、福利和产品等影响重大，但目前动物垫料中微生物检测标准属于空白，亟待建立科学完善的动物垫料微生物检测标准，该工作将对国内垫料建立统一质量评价体系、风险分析及产品标准等有力促进。动物垫料中绿脓杆菌对动物的危害极大。动物垫料绿脓杆菌是影响动物健康和动物实验结果的国际公认的重要环境因素之一，因此动物垫料中绿脓杆菌的检测十分重要。绿脓杆菌是人兽共患的一种条件性病原菌。在自然界分布极广,是多种家畜、经济动物以及野生动物和人都可感染的一种传染病，对人畜危害严重。病畜及带菌动物是主要传染源，经消化道、呼吸道及伤口感染。是烧伤、外伤和术后感染的主要病原菌, 绿脓杆菌感染可发生在人体任何部位和组织、常见于烧伤或创伤部位、中耳、角膜、尿道和呼吸道。也可引起心内膜炎、胃肠炎、脓胸甚至败血症。绿脓杆菌经常由伤口、烧伤部位、外科手术或治疗、检验用各种插管，甚至使用不当的隐形眼镜，而侵入人体。一旦绿脓杆菌侵入患者组织或血液后，常出现各种不同的临床症状，如急性眼内炎；或在囊状纤维瘤患者身上，出现慢性呼吸道感染，进而演变成慢性肺炎；在免疫力缺失的癌症患者或严重的烧伤病人身上，则出现急性的肺炎或菌毒血症。院内感染绿脓杆菌所引起的肺炎或菌毒血症，致死率更高达70，其中主要的致病因子是绿脓杆菌外毒素。据报道10在医院感染的病症都是由绿脓杆菌所引致的，居病原菌之首。国内外烧伤中心对细菌感染的临床调查中发现绿脓杆菌感染占50以上。基于以上致病性，绿脓杆菌是疾病诊断中必检微生物之一。禽类感染可呈现卡他性或出血性肠炎,或发生眼角膜炎。也可与葡萄球菌等混合感染呈现呼吸道疾病。绿脓杆菌也是奶牛乳房炎的重要病原菌之一。它引起的疾病不论在发达国家还是在发展中国家都严重地损害着动物及人类的健康，也给养殖业造成了重大经济损失。绿脓杆菌病的危害如此之大，使用绿脓杆菌污染的垫料容易引起动物发病，含有绿脓杆菌的动物产品又会导致公共卫生事件的发生。动物体内排出的绿脓杆菌，也可能污染食物导致人的食物中毒。因此检测垫料中绿脓杆菌成为重中之重。建立动物垫料绿脓杆菌检测标准，保障动物健康急不可待。动物垫料与动物粪便直接接触，容易滋生细菌，尤其是肠道致病微生物，致使垫料被绿脓杆菌污染，从而威胁动物的健康与福利，并且对养殖业的发展与国际间动物及产品贸易带来巨大的影响，甚至威胁到人类社会的生产与生活。但是对于动物垫料绿脓杆菌检测标准几乎空白，还没有统一的标准和方法，所以建立动物垫料绿脓杆菌检测标准已刻不容缓。本实验室具有多年微生物检测的经验，本方法的开发和应用，在检测技术方面填补我区的空白、弥补了自治区没有现行标准的不足，能够使动物垫料中绿脓杆菌的检测更加高效、准确、安全。本方法的开发和应用将会使我区在动物垫料中绿脓杆菌的检测先进性方面达到国内领先水平，为我区动物垫料质量安全管理部门更快更好的管控提供可靠保障。因此，加强动物垫料中绿脓杆菌的检测对确保全区农业持续、健康发展具有重要的现实意义。三、主要起草过程2018.05-2018.08 地标前期基础工作：收集动物垫料样本，查阅绿脓杆菌资料，检索绿脓杆菌检测的相关文献及标准。2018.09-2019.07 前期实验条件的摸索：包括前处理方法的优化、对照，不同垫料中绿脓杆菌的检出率，最终确定实验方案，编写编制说明。2019.08-2019.09 验证单位进行验证。2019.10 编写地标并定初稿。四、现行法律、法规和强制性标准的关系本标准遵循GB/T 1.1-2009 标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写和GB/T 20001.4-2015 标准编写规则 第4部分：试验方法标准的规则编写。还参照相关国家标准编写指南的要求。在编制本标准的过程中参考了以下标准：ISO 22717:2015 Cosmetics. Microbiology. Detection of Pseudomonas aeruginosa、AOAC Official Method 991.49 Testing Disinfectants Against Pseudomonas aeruginosa、SN/T 2099进出口食品中绿脓杆菌检测方法、GB 7918.4化妆品微生物标准检验方法 绿脓杆菌、DB 22/T 394.3-2017保健用品微生物检验方法 第3部分：铜绿假单胞菌测定、GB 8538-2016食品安全国家标准 饮用天然矿泉水检验方法、GB/T 14926.17-2001实验动物 绿脓杆菌检验方法、SN/T 4458-2016出口中药材微生物学检验；综合参考了国内外与绿脓杆菌检测相关的检测标准，力求该标准能够高效准确的检测垫料中绿脓杆菌，同时兼顾标准的广泛应用。本标准完全符合现行法律法规和强制性标准规定，不存在任何与现行法律法规和强制性标准相违背之处。相关强制性标准2项：GB 14925-2010 实验动物 环境及设施，本标准规定了实验动物及动物实验设备和环境的技术要求及检测方法，同时规定了垫料、饮水和笼具的原则要求。但针对垫料该标准仅规定了“垫料的材质应符合动物的健康和福利要求，应满足吸湿性好、尘埃少、无异味、无毒性、无油脂、耐高温、耐高压等条件；垫料必须经灭菌处理后方可使用”，本地标适用于垫料中绿脓杆菌检测，明确规定了不同类别垫料取样方法，标准中绿脓杆菌鉴定过程增加了新的鉴定手段，确保检测结果更加准确。5、 主要内容及检测方法的确定5.1 取样方法的确定及优化根据动物垫料的物理性状将其分为颗粒状/粉末状垫料和平面状垫料，针对不同性状的垫料采取不同的取样方法。5.1.1 颗粒状或粉末垫料样品取样方法国内外食品和饲料中霉菌检测法中常用的取样方法为称取法，本标准中针对颗粒状或粉末垫料样品（木屑、玉米芯、秸秆、纸屑等）参考通用做法采用称取25 g的方法进行取样。5.1.2 平面垫料样品取样方法针对平面垫料（胶垫、托盘等）采用表面涂抹取样法，无菌操作将涂抹25 cm2100 cm2平面样品的棉拭子置入装有 25 mL100 mLSCDLP中，混匀作为原液。5.2 增菌液和培养基的选择5.2.1 增菌液的选择国内外标准和资料中用到的增菌液主要有：SCDLP液体培养基、NAC液体培养基、灭菌生理盐水、磷酸盐缓冲稀释液和营养肉汤（NB）等。不同标准中使用最多的是SCDLP，本标准也选用该增菌液。5.2.2 分离培养基 本标准选用的绿脓杆菌分离培养基为国内外标准中比较认可的假单胞菌CFC选择性培养基、假单胞菌CN选择性培养基，在保证检测结果的同时，兼顾不同标准所用培养基的一致性，节约实验室成本。5.3 典型或可疑菌落的鉴定 本标准对典型或可疑菌落的鉴定过程，参考了国内外绿脓杆菌检测标准和药典等成熟做法，综合了生化反应等必要鉴定过程，并囊括了全自动细菌鉴定系统和飞行时间质谱检测方法，做到了与国际接轨，缩短检测时间，增加检测通量，减少检测人员工作量。5.4 培养时间和温度最新的ISO 22717:2015采用了32.52.5的预增菌温度，使绿脓杆菌培养温度范围扩大为为3035，而我国常用的绿脓杆菌培养温度为361，也在这一范围内，本标准将继续采用我国常用的361对绿脓杆菌进行检测培养。本标准各种培养基培养时间也与国内外标准常用时间相统一。六、方法验证为验证本方法的有效性和适用性，选择5家不同行业的检测机构对本方法进行验证，验证内容为方法的适用性、准确度、检出率及相关样品的检测，结果显示该方法稳定可靠，符合相关要求。七、结论综上所述，本标准在制定过程中所涉及到的各项技术指标均经过方法学的验证，并切实可行，完全达到了编制标准的要求。八、重大意见分歧的处理依据和结果未发生。九、国内外情况简要说明国内尚没有建立统一的国家标准检测方法。检索国家标准1项和地方标准2项：GB 14925-2010 实验动物 环境及设施、江苏省地方标准DB 32/T 2129-2012 实验动物 垫料、北京市地方标准DB 11/T 1126-2014实验动物 垫料。根据文献报道尚未发现内蒙古自治区内有相关单位从事这项研究。10、 标准草稿征求意见情况汇总表序号意见提出单位/专家采纳不采纳（说明原因）1建议在标准适当位置增加“绿脓杆菌检测流程图”。二连浩特海关技术中心/王伊琴采纳2建议将新型“飞行时间质谱法”加入到标准。包头海关综合技术服务中心/张鹏翔采纳3建议只保留绿脓菌素、硝酸盐还原产气、明胶液化、42生长试验，去掉乙酰胺、葡萄糖酸盐、精氨酸双水解酶试验。兰州海关技术中心/张宇霞采纳4平面垫料样品应用表格方式给出采样量。贵阳海关综合技术服务中心/罗阿东采纳5无参考文献：1 GB/T 1.1-2009标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写规则.2 GB/T 20001.4-2015标准编写规则 第4部分：试验方法标准.3 GB 14925-2010实验动物 环境及设施.4 DB 32/T 2129-2012实验动物 垫料.5 DB 11/T 1126-2014实验动物 垫料.6 SN/T 2099-2008进出口食品中绿脓杆菌检测方法.7 GB 7918.4-1987化妆品微生物标准检验方法 绿脓杆菌.8 DB 22/T 394.3-2017.保健用品微生物检验方法 第3部分：铜绿假单胞菌测定.9 GB 8538-2016食品安全国家标准 饮用天然矿泉水检验方法.10 GB/T 14926.17-2001实验动物 绿脓杆菌检验方法.11 SN/T 4458-2016出口中药材微生物学检验.12 ISO 22717:2015 Cosmetics. Microbiology. Detection of Pseudomonas aeruginosa.13 AOAC Official Method 991.49 Testing Disinfectants Against Pseudomonas aeruginosa.8