细胞培养考试重点整理.doc

第一章 绪论体外培养（in vitro culture）：是将活体结构成分（如活体组织、活体细胞或活体器官等）甚或活的个体从体内或其寄生体内取出，模拟体内的生理环境，在无菌、适当温度和一定营养条件下使之存活和生长发育的方法。 按照体外培养的结构成分，可将体外培养人为分为： 组织培养（tissue culture）指从生物体内取出活的组织（多指组织块）在体外进行培养的方法。 细胞培养 （cell culture）指将活细胞（尤其是分散的细胞）在体外进行培养的方法。 器官培养 （organ culture）指从生物体内取出活的器官（一般是胚胎器官）、器官的一部分或者器官原基在体外进行培养的方法。单一化现象 组织培养过程中，培养组织不能在体外长期维持其结构和功能，培养的时间长，经过反复传代，细胞出现单一化现象趋向单一类型的细胞最终成为细胞培养。体内培养（in vivo culture)：将活体结构成分（如活体组织、活体细胞、活体器官等）甚至活的个体从体内或其寄生体内取出，放在其他生物体内让其生长和发育的方法。最常见的体内培养方式就是移植（trans-plantation）。体外培养技术创立代表性的人或者实验Harrison的工作，较为完善地建立了体外培养活体组织的培养体系，第一次较为系统地观察了体外培养活体组织的结果。被公认为是体外培养技术的的开始。标志着体外培养技术的创立，标志着盖玻片悬滴培养法的建立，标志着神经组织体外培养的开始，也标志着神经突起是由神经细胞长出的这一重大理论的诞生。Carrel对体外培养的贡献： 将无菌操作观念引入体外培养过程中。 将培养组织包埋技术、营养供应以及继续培养（也称传代或继代培养）等许多重要的培养条件和方法引入盖玻片悬滴培养系统，从而完善了Harrison的方法。 发现鸡胚浸液能明显地促进多种细胞的体外生长。 设计卡氏培养瓶减少了污染，扩大了细胞生存空间。现在一般认为体外培养技术是从Harrison和Carrel真正开始的。两位美国科学家W.H.Lewis和M.R.Lewis最先试用已知成分的合成培养基取代不能准确确定其成分的天然培养基，由于他们和其它许多科学家在此后30多年的努力，最终发展出许多合成培养基。现代组织培养的三个阶段：第一阶段 悬滴培养第二阶段 单层培养第三阶段 三维培养（立体培养）现代组织培养的重要标志： 培养液的改变 培养容器的改变 培养方法的改进：液体培养基的应用; 单细胞分离培养法 细胞培养用的多种材料都已商品化、规范化和系列化。 低温冷冻技术的应用，可将已建立的多种细胞系和细胞株长期冻存。 细胞培养技术更加广泛地用于生物学和医学研究.对体外培养技术的评价 能长时间直接观察活细胞的形态结构和功能活动，是多学科进行科学研究的对象和工具，如细胞学、遗传学、免疫学和肿瘤学等。 供研究的细胞种类极为广泛，从低等生物到人，或正常组织或肿瘤组织细胞，而且便于记录（通过摄影、闭路电视和摄电影等方式） 易施加理化因素和生物因素进行实验研究。如研究某种实验因素对细胞的生物学作用 ，只需在培养液中有针对性地加入或删除该成分即可。 可同时方便获得大量细胞类型单一、细胞周期同步、生物学性状基本相同并对实验因素反应一致的细胞群。能够进行大规模生物制品的生产。利用体外培养技术可以大量繁殖动物细胞或微生物以生产生物制品。 与体内环境相比，体外培养细胞在一定程度上失去了组织联系及相互作用，缺乏在体内时的血运和神经体液调节作用，因此不能将体外实验结果一并推至体内，即不能轻易下结论。组织培养常用术语Anchorage-dependent cells or cultures（贴壁依赖性细胞或培养物）：体外培养的细胞只有贴附在不起化学作用的物体的表面时才能生长、生存或维持功能。Apoptosis（细胞凋亡）：是指细胞内死亡程序的启动而导致细胞自杀的过程，因此也常称为程序性细胞死亡（programmed cell death)。细胞凋亡与机体正常发育、形态形成以及多余细胞的清除等生理过程密切相关，所以被认为是一种积极的生理性死亡。Cell culture（细胞培养）：细胞在体外条件下的生长。Cell fusion（细胞融合）：体外培养条件下，经化学试剂、病毒或物理方法诱发，使同种或不同种的2个或2个以上体细胞融合产生杂交细胞的过程。cell generation time（细胞一代时间）：是指单个细胞两次连续分裂的时间间隔。可借助显微镜电影照相术来精确确定。cell line（细胞系）：原代培养物经首次传代成功后即成为细胞系。Clone（克隆）：单个细胞通过有丝分裂形成的细胞群体，他们的遗传特性相同。Confluence（汇合）：指在细胞培养瓶中培养的细胞彼此汇合形成单层，注意与细胞融合的区别。Contact inhibition（接触抑制）：当一个贴壁生长的体外正常细胞生长至与另一个细胞相互接触时，便停止了分裂增殖，相互虽然紧密接触，但不形成交叉重叠生长，也不再进入S期。HeLa cell 来源于子宫颈癌组织（美国黑人妇女Henrietta Lacks）的上皮细胞系，为体外最早建立的人类癌细胞系。In vitro malignant transformation（体外恶性转化）：细胞在体外培养过程中获得了致瘤性，当把这种细胞接种于适当的动物，可以产生肿瘤，即异种动物接种致瘤实验。In vitro transformation （体外转化）：细胞在体外培养过程中发生与原代细胞形态、抗原、增殖或其他特性的可遗传的变化，但不一定具有致瘤性。Minimal medium(最低限度培养基)：能满足大多数细胞生长增殖需要的最简单的培养基。Organ culture（器官培养）：是指维持整个器官或器官的一部分在体外生存和生长，并一定程度上保持原来的结构和功能的方法。Passage（Subculture，传代或传代培养）：将细胞从一个培养瓶转移到更多培养瓶的过程。Primary culture（原代培养）：是指直接取自生物体细胞、组织或器官开始的培养。Saturation density（饱和密度）：在特定条件下，培养容器能达到的最高细胞数，当细胞达到饱和密度后细胞群体停止增殖。在贴壁培养中以每平方厘米的细胞数表示，而悬浮生长的细胞则以每立方厘米的细胞数表示。Suspension culture（悬浮培养）：细胞或细胞聚集体悬浮于液体培养基中增殖的一种培养方法。Tissue culture （组织培养）：组织在体外条件下保存或生长。借此组织结构或功能得以在体外保持，亦可能在体外维持其分化。Transfection （转染）：用生物学的、物理的或化学的方法将目的基因转移到培养细胞内的实验方法。Lipofectin：一种常用的细胞转染试剂，用该试剂包裹DNA可形成脂质体-DNA复合物，再通过细胞膜融合可将DNA转染入哺乳动物细胞。Cell cycle：指细胞从前一次分裂结束开始至本次分裂结束所经历的时相过程。分4个时期，即DNA合成期（S期）、有丝分裂期（M期）、有丝分裂完成至DNA合成开始的间隙期（G1期）以及DNA复制结束至有丝分裂开始的间隙期（G2）。若某种原因细胞不再沿细胞周期运行，而进入休眠状态称为G0期。细胞株（cell strain）：是由具有某些特性与标志的细胞选择或克隆化而派生的亚系，这些特性或标志在尔后的培养中必须保持下去。恶性转化（malignant transformation）：不受时间或空间的控制向正常组织侵袭能力的形成，也可导致转移性生长。群体密度（population density）：培养器皿内，每单位面积或体积中的细胞数，多用细胞数/cm2表示。Stem cell（干细胞）：具有继续增殖与分化潜能的细胞，其中胚胎干细胞（Embryonic stem cell，ESC)可形成机体所有各种类型的组织和细胞，甚至发育成一个完整的胚胎，故又称全能性（totipotency）干细胞。随着细胞分化，这种分化潜能逐渐受到局限，只能分化形成有限细胞类型的细胞称为多能性(multipotency)干细胞，最终成为单能干细胞（Monopotency stem cell )或定向干细胞(directional).第二章 体外细胞培养的基本要求体外培养的生存条件一、严格的无污染（无菌无毒）环境无化学物质污染无微生物污染无对细胞产生损伤作用的生物活性物质污染（抗体、补体等）二、合适的生存环境恒定适宜的温度 人和动物（哺乳）培养细胞适合温度是3537，鸟类细胞温度要求较高，为38.5。 细胞对低温的耐受比高温的耐受强。 培养细胞置4下数小时后，恢复到37细胞仍能良好生长。 低温冷冻技术可长期保存细胞。气相环境 细胞生存所需的气体主要有O2和 CO2 多数细胞缺O2不能生存，但高氧环境对细胞毒性作用较大。 CO2主要维持培养液的PH，细胞代谢产生的CO2，释放至培养液使培养液变酸。为维持培养液PH值的恒定，常在培养用液中加入NaHCO3。 PH 多数细胞适宜的PH为7.27.4，细胞耐酸比耐碱强，在偏酸性环境中更有利于生长。液相环境（渗透压）： 指各种平衡盐溶或培养液的等渗状态，细胞必须生活在等渗的环境中，不同细胞的理想渗透压不同。人血浆渗透压约290mOsm/kg，可视为培养人体的理想渗透压。对大多数哺乳类动物细胞，渗透压在260320mOsm/kg的范围均适宜。三、合适的营养条件营养成分：与体内基本相同，主要包括： 1. 氨基酸 所有细胞都需要以下12种必需氨基酸：精氨酸、胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、组氨酸、酪氨酸和缬氨酸，这些氨基酸均为型。 此外，所有细胞都需要谷氨酰胺，谷氨酰胺在细胞代谢过程中具有重要作用，所含的氮是核酸中嘌呤和嘧啶合成的来源，也是合成磷酸腺苷所需的基本物质。 2. 单糖 主要为六碳糖，是细胞代谢的能量来源，也是合成某些氨基酸、脂肪、核酸的原料，细胞对各种糖的吸收能力不同，葡萄糖最高，半乳糖最低。 3. 无机离子与微量元素：基本元素和微量元素，非培养液固定成分，实验研究中，通常加入不同微量元素，观察对培养细胞的影响。 4. 维生素：在细胞代谢过程中主要扮演辅酶、辅基的作用，必不可少。 促生长因子及激素：主要来源于血清，对于维持细胞功能、保持细胞状态十分重要。各种生长因子的作用明显并具有特异性，激素类物质也具有促进细胞生长增殖的作用。 促细胞贴附物质：体外贴附型细胞在生长过程中，多需要促细胞贴附物质，不同种类的促细胞贴附物质具有不同的促细胞贴附特性。水和平衡盐溶液培养用水：体外培养细胞对水质特别敏感，对水的纯度要求较高。常用的BSS是Hanks液和Earle液： Hanks：NaHCO3量较少，缓冲能力较弱，宜利用空气平衡。 Earle液：含有高浓度NaHCO3，缓冲能力较强，需用5%CO2维持平衡。 注意：配制离散细胞用的消化液和细胞洗涤液时，宜采用无Ca 2+、Mg 2+的D-Hanks液血清的种类： 牛血清：胎牛血清 剖宫产的胎牛 新生牛血清 出生24h内 小牛血清 出生10-30天 人血清、马血清 鸡血清、兔和羊血清（同种细胞的特殊培养） 单牛血清、混合血清血清使用中注意的问题： 血清中补体成分对某些细胞有毒性作用，应56，30 min灭活。 血清长期保存应在-20以下。 分装成小瓶使用，避免反复冻融。 使用浓度： 合成培养基不加血清能维持细胞短期生存 维持液（25%血清） 细胞生长液（1020%血清） 不明成分对分析实验结果增加了困难 无血清培养基的应用。体外培养基 是根据细胞在体内生存的条件，将细胞体外生长所需物质的种类按一定量严格配制而成。DMEM（Dulbeccos modified Eagles medium）：为诺贝尔奖金获得者Dulbecco R.改良的Eagle培养基，多用于哺乳动物与人细胞系的培养。分为高糖型和低糖型。RPMI-1640：最初是由Moor等为小鼠白血病细胞培养而设计，开始的配方特别适合悬浮细胞的生长，主要针对淋巴细胞，经几次改良，从RPMI-1630、RPMI-1634，最后至RPMI-1640。其组分较为简单，后来发现适用于多种细胞的生长，如肿瘤细胞或正常细胞、原代细胞或传代培养的细胞，是目前应用最为广泛的培养基之一。无血清培养基（Serum free medium，SFM）：不需要添加血清就可维持细胞在体外较长时间生长繁殖的合成培养基。 使用方法：细胞转入无血清培养基需要一个过程，在逐步降低血清的过程中要注意观察是否发生变化，是否有部分细胞发生死亡。注意观察存活细胞是否保持原有的生物学特性。细胞在转入无血清培养基培养之前应保存种细胞，按常规培养与含血清培养基中，以保证细胞的特性不发生变化。胰蛋白酶溶液 pH8.0，37时作用能力最强（注意调整pH）。用D-Hanks液配制，因钙、镁离子可降低其活性。 热消化 37 1h 0.25% 冷消化 4 1220h 0.125%EDTA溶液（Versen液）配置时应使用用无Ca2+、Mg2+液体溶解，高压蒸汽灭菌，4保存。pH调整液：NaHCO3。附着底物：细胞贴附在底物上生长的性质呈锚着依赖性。凡对细胞无毒性的物质都可用作底物。常用附着底物如下：（一）玻璃 最常用（二）一次性塑料：（三） 微载体：（由聚苯乙烯或聚丙烯酰氨制成的小球体，附着面大，利于大量繁殖细胞）（四） 饲细胞（Feeder cells）：也称滋养细胞，通常成纤维细胞或其他细胞长成单层后，再用大剂量射线照射，使细胞失去增殖能力，但仍能存活并有代谢活动。可作为支持物，然后接种上其他细胞，饲细胞的代谢产物利于其他细胞生长，用于某些特殊难培养细胞的培养。CO2培养箱，可恒定地提供一定浓度的CO2（2%5%），维持培养液较稳定的pH值，采用NaHCO3- CO2缓冲系统。应用CO2培养箱须注意： 维持一定的CO2浓度 保证开放式培养（通气） 定期消毒（内置紫外灯、酒精） 一定的湿度，避免培养液蒸发第三章 体外培养细胞生物学体内、外细胞的增殖方式相同，均依赖于有丝分裂，其差异的关键在于细胞的分化，细胞分化是检测细胞差异的核心问题。细胞离体的变化 1不适应：表现为细胞原有的分化特性减弱或不显。是因生存条件的改变使分化发生抑制。 2. 去分化或脱分化（Dedifferentiation):即细胞失掉发生分化的能力。可能是基因变异所致。 3体外培养细胞具有分化潜能。很多细胞仍呈现一定程度的分化表达现象。与体内条件越近似，细胞越易发生分化。 4细胞离体培养时间越长，分化能力越弱，二者呈反向关系。 5细胞恶变的本质是细胞增殖和分化调控的失控，诱导癌细胞发生分化是癌细胞逆转的表现。体外培养细胞的形态学 与体内细胞基本相同，形态趋化单一化，依据大体形态可分为： 1悬浮型 2贴附型体外培养细胞的增殖能力 体外培养细胞的两大生命特征是分化增殖和生长发育。 1培养细胞的增殖能力一般与该种细胞在体内的增殖能力相仿。 2胚胎细胞成年组织细胞。 3高度分化的细胞通常增殖能力较弱。 4恶性肿瘤细胞可在体外无限传代。体外培养细胞的 生长类型一、贴附型细胞：1成纤维细胞型：2上皮型细胞：起源于内胚层和外胚层的细胞，体外培养时都可呈现上皮型。如皮肤表皮及其衍生物、消化管上皮、肝、胰和肺泡上皮等组织。 上皮型细胞的三个形态学特征：呈扁平不规则多角形，中央有圆形核，细胞紧密相连成单层膜，细胞增殖数量多时，生长时整块膜随之移动；处于上皮膜边缘的细胞多与膜相连，很少脱落细胞群单独活动。“铺路石样”：细胞紧密排列时，细胞呈多角形或六角形； “拉网现象”（Netting）：在构成上皮细胞膜状生长的细胞群中一些细胞常相互分离卷曲，致使上皮细胞膜中形成网眼状空洞。可能与细胞分泌透明质酸酶有关。3 游走型细胞： 如单核巨噬细胞系统的细胞，如淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞以及某些肿瘤细胞属之。二、悬浮型细胞传代（passage）：细胞增殖达到一定密度时，需要分离出部分细胞并更换新营养液，适应细胞的继续生长和增殖，这一过程称为传代。原代培养期（primary culture）即初代培养，是指从活体内取出组织细胞开始体外培养到第1次进行传代之前的时期，一般持续14周。 特点： 1细胞群是异质性的（heterogeneous），即各细胞的遗传性状互不相同，相互依存性强。 2细胞呈活跃的移动，可见细胞分裂，但不旺盛，细胞的结构和功能与体内仍很相似。 3克隆形成率低 4. 多呈二倍体核型。 5. 是检测药物很好的实验对象。永生性（也称不死性）或恶性性， 即细胞获得持久增殖能力，称无限细胞系（Infinite cell line）或连续细胞系（Continuous cell line）。二倍体细胞系：正常细胞在培养条件较好情况下，细胞增殖旺盛，并能维持二倍体核型，这种细胞称二倍体细胞系（Diploid cell line）。细胞“一代”指从细胞接种到分离再培养时的一段时间，是细胞培养工作中的一种习惯说法，与细胞倍增一代的含义不同。 在细胞一代中，细胞能倍增36次。细胞传“一代”，通常经历三个阶段：1. 潜伏期(latent phage)：2. 指数增生期：3. 停滞期：指数生长期内细胞分裂相数量（即细胞增殖活性）可以作为判断细胞生长是否旺盛的重要标志。一般以细胞分裂指数（Mitotic Index，MI）和细胞群体倍增时间表示。 MI即细胞群中每1000个细胞中的分裂相数。 细胞群体倍增时间是指培养物中细胞数量翻倍的平均时间。一般细胞的MI约为0.1%0.5%；原代培养物的MI比传代培养物的MI低；连续细胞系和肿瘤细胞的MI较高，可达3%5%（肿瘤细胞偏高）。接触抑制（Contact inhibition）：正常细胞指数增生期持续35天，细胞相互接触能抑制细胞进一步的运动，这种现象称为接触抑制，彼此连接成片，生长面积消失。而恶性细胞无接触抑制现象，可继续移动和增殖，细胞向三维空间运动，发生细胞堆积（piled up），因此接触抑制可作为区别正常细胞和癌细胞的标志之一。密度抑制（Density inhibition）：细胞发生接触抑制后，只要营养充分，仍能进行增殖分裂，但当细胞密度进一步增大，培养液中营养成分减少，代谢产物增多时，因营养的枯竭和代谢物的影响，则发生密度抑制，导致细胞分裂停止。永生化和恶变(immortalization and malignancy)：前者也称不死性，是细胞获得体外持续生长增殖能力的特性，可恶变；后者指细胞不仅能无限增殖生长，而且具有异体接种致瘤性。两者是细胞两种不同的性状。群体依赖性(PD，Population Dependence) 单个细胞不是细胞永久存在的形式，不能长期生存。一个有活力的细胞终需经过繁殖形成群体，只有群体细胞才是培养细胞的基本存在形式。单个细胞虽能生长繁殖，但不如群体细胞生存能力强，细胞量多时比少时易于培养，说明细胞之间能相互沟通信息，呈现着相互依存性或群体依赖性。（正常细胞群PD比转化细胞大，转化细胞和恶性细胞PD小，即PD与细胞恶性成反比关系，恶性细胞独立生存能力增大。）提高细胞在体外培养的成功率的关键在于初代培养。影响培养成功的因素：一、供体年龄 1成活率，胚胎幼年成年。 2同一个体的组织，分化低的组织细胞高分化的组织细胞。 3组织细胞的异质性，个别细胞优势生长 4干细胞非干细胞。二、培养条件 1不同细胞对培养基需求不同，应选择相应的培养基，尤其是正常细胞。 2无限细胞系和肿瘤细胞系适应性强，可在各种培养基中生存。三、贴附底物 1贴附细胞：贴附是细胞增殖生长的条件， 只有细胞贴附到底物上才能增殖，初代培养尤为重要。不同细胞对附着底物要求不同。 2 一旦成为细胞系后，多能顺利贴壁。（ 特殊细胞培养，如：神经元鼠尾胶原处理，乳腺上皮、大肠上皮细胞饲细胞）四、培养方法（酶的应用） 不同消化分散组织的方法对细胞的贴壁和生长增殖有影响，胶原纤维多的组织用胶原酶消化，上皮细胞适用胰蛋白酶消化。选择适宜消化法和培养法是培养成功不可忽视的条件。已鉴定的细胞（Certified Cells） 各种已被命名Cell line和经过细胞生物学鉴定Cell Strain具有以下特征：形态均一；生长增殖稳定；生物学性状清楚，即已鉴定的细胞（Certified Cells），可用于各种实验研究和生产生物制品。细胞克隆：从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培养或通过筛选的方法，由单细胞增殖形成的细胞群，称细胞克隆。NIH3T3（小鼠胚胎成纤维细胞）：美国国立卫生研究所建立，每3天传代一次，每次接种3105cells/ml。 高温湿热灭菌 以压力蒸汽灭菌最为常用，压力蒸汽灭菌器消毒好的物品应注意烘干。第五章 细胞培养技术几种组织分离方法 1离心分离法：适用于血液、羊水、胸腹水等细胞的培养。 2切割分离法：用眼科剪或手术刀。 组织块培养时，剪切成1mm3大小的组织块，所取组织多为1cm3，注意用Hanks液漂洗。 3机械分散法：适用于软组织（如脑组织、胚胎 及一些肿瘤组织等） 压挤法，用注射器粉碎组织。 不锈钢筛网（1mm、100m、20m网眼） 钝物压取法 仅适用于处理软组织。 4消化分散法：在组织剪切成较小体积基础上，应用生化和化学手段进一步分散组织的方法最终使被处理的组织分散成细胞团或单个细胞制成细胞悬液进一步培养。细胞容易生长增殖。 根据组织的不同，可选用特定的消化手段。（1） 胰蛋白酶消化法： Ca2+、Mg2+对胰蛋白酶的活性有一定的抑制作用，故需用D-Hanks液配制。血清可抑制胰蛋白酶的活性，因此细胞传代时，用胰蛋白酶消化细胞后，不必用Hanks冲洗。 使用浓度0.01%-0.5%，以0.25%最常用，pH8-9 两种消化方法 温消化：37，1h 冷消化：4 ，1220h（2）胶原酶（Collagenase）消化法： Collagenase是一种由细菌提取出的酶，适用消化纤维组织、癌组织和上皮组织。消化作用缓和，无需振荡。 (3) EDTA消化法：EDTA消化细胞后，一定要用Hanks液冲洗干净，血清对其无中和作用，而培养环境中残留的EDTA对细胞生长有不良影响。 Trypsin Collagenase 消化特性 适应于消化软组织 消化纤维多的组织使用浓度 0.010.5% 0.10.3mg/ml消化时间 0.52h 112hpH 89 6.57.0作用强度 强烈 缓和细胞影响 时间过长有影响 无大影响血清抑活 有 无Ca2+和Mg2+ 有影响 无影响 细胞冻存的基本原理不附加任何条件下，直接冻存细胞时，细胞内外环境的水会结成冰晶， 能导致细胞发生一系列变化，如机械损伤、电解质升高，渗透压改变、脱水、pH改变、蛋白质变性等 细胞死亡。如向细胞培养液中加入保护剂甘油或二甲基亚砜（DMSO），可使冰点降低，在缓慢冻结条件下，能使细胞内水分在冻结前渗出细胞外，避免细胞损伤。细胞冻存的原则 （1）为保存细胞最大存活率，一般都采用慢冻快融的方法，掌握好冻存速度。冻存速度1/min存活率最高（程序冻存仪），冻存管置15-20mm厚泡沫盒再放入-70冰箱，可保持该速率，在转移至液氮前，-70过夜更安全。 （2）冻存一年后，应再复苏培养1次，然后继续冻存。-196 保存时间数年数十年，-70数月。 （3）待冻存细胞应具有较高的活力，即处于对数生长期的细胞。 （4）常温下DMSO对细胞有毒副作用，因此冻存液需在4下放置4060min后使用。复苏效果取决于复温速度，细胞在-50最易受损，速融可迅速通过该温度，避免细胞损伤。必须在12min内使冻存液完全融化。二倍体细胞培养法 是指培养的细胞始终维持二倍体生物学性状的培养方法。正常细胞的原代培养即为二倍体细胞，但长期旺盛地增殖生长，并保持二倍体性状并非易事。l措施： 低温冻存：采用妥善的培养方法：1.严格控制pH，最好CO2培养箱。 2.换液时间间隔不能太长，部分换液。3.高质量血清和培养基，尽量维持不变。每次传代均一分为二（细胞数量、营养液量、培养瓶空间和面积不变）。4.传代期不能过长，掌握好传代时机，细胞不能过于密集，应及时传代。5.传代后如细胞不用于实验，立即低温冻存。单细胞分离（克隆）培养又称细胞克隆，即把单个细胞从群体内分离出来单独培养，使之重新繁衍成一个新的细胞群体的培养技术。 细胞群体单细胞培养新的细胞群体纯系，称细胞株 不论用什么方法克隆细胞，都必须保证分离出来的细胞确为一个而不是两个或更多。这是进行细胞克隆时应遵守的最基本原则。克隆形成率（Coloning Efficiency）： 细胞群中单个细胞形成克隆的百分数称克隆形成率。细胞制成悬液后，以低密度（25个细胞/cm2)接种到底物上，贴壁并能存活生长形成细胞小群（克隆）的百分数称接种存活率（克隆形成率），除表示细胞活力外，主要表示细胞增殖能力。 克隆形成率=形成克隆数接种细胞数100%提高克隆形成率的措施1.培养基：自制适应性培养基或条件培养基是一种不含细胞而已被细胞生活过或同化过的培养基。 2.血清：胎牛血清小牛血清马血清，用时先做克隆形成率实验，选最佳者使用。灭活处理56，0.5h.3.激素：含110u/ml的胰岛素培养液能促进很多细胞克隆的形成。地塞米松4.CO2：CO2对绝大多数细胞克隆形成率都有提高，多用5%，成纤维细胞和胶质细胞2%.5.适应性底物：无限细胞系塑料底物；原代培养细胞胶原层或血浆纤维蛋白层。6.饲细胞：不分裂，但生存并同化营养液。稀释法_微孔板克隆培养 注意：稀释法克隆生长过程中的换液,每周一次补充营养但增加污染，两周换液合理，半量换液.软琼脂培养（ soft agar culture）主要应用双层软琼脂培养（也可单层琼脂），检测转化细胞和恶性细胞最常用的方法，与细胞恶性程度有很大的符合率。第六章 组织培养的污染、检测和排除真菌污染是细胞培养过程中最常见的一种，最常见的真菌有烟曲霉、黑曲霉、孢子霉、毛霉菌、白念珠菌和酵母菌。细菌污染：最常见的有革兰氏阳性菌，如枯草杆菌、白色葡萄球菌以及大肠杆菌、假单胞菌等革兰氏阴性菌，其中又以白色葡萄球菌较常见。支原体污染：是细胞培养中最常见、不易被察觉和干扰实验结果的一种污染。是细胞培养研究中重点预防对象。荧光染色法是现有检测方法中最方便和最有效的一种。荧光显微镜下可见支原体呈颗粒或纤丝荧光染色，散在细胞周围，或附于细胞表面。第七章 个别细胞核组织的培养上皮组织特征性生长状态：1.膜状生长（细胞紧密相连），细胞数量多时最为明显；2.不规则多角形，呈铺路石样；3.以及“拉网”现象（Netting）。上皮细胞培养的3个要点： 需特殊底物； 需特殊培养基：多用DMEM和HamF12纯化和延长上皮细胞生存期是上皮细胞培养的关键之一。表皮细胞培养的要点: 皮肤是表皮细胞培养来源，小儿包皮、早产流产儿皮肤组织最为理想，也可采用乳腺或腹部皮肤。16岁好，不要超过60岁，注意消毒。 培养液：DMEM/F12(3:1，V/V)、10%FBS、胰岛素、 转铁球蛋白、氢化可的松、霍乱毒素、腺嘌呤、促表皮生长因子(EGF)等。采用胶原底物或NIH3T3为饲养层细胞表皮和真皮分离培养法可获得纯上皮细胞。胰蛋白酶-EDTA冷消化法（使表皮和真皮结合松散）；胶原酶消化效果较好，对结缔组织有较强消化作用，对表皮细胞损伤小。排除成纤维细胞的处理： (1)酶消化法 在消化培养细胞时，常是成纤维细胞先脱壁，而上皮细胞要消化相当长的时间才脱壁，特别是在原代培养和培养早期这种差别尤为明显，因而可以利用这种差异采用多次差别消化方法将上皮细胞和成纤维细胞分开。 （2）机械划除法 原代培养成功后，上皮细胞和成纤维细胞混杂生长，常常分区成片，每种细胞都以小片或区域性分布的方式生长在瓶壁上。因此可以采用机械刮除的方法去除不需要的细胞。（3）反复贴壁法 成纤维细胞贴壁过程快（10-30min），而上皮细胞大部分在短时间内不能附着或附着不稳定，稍加振荡即浮起，这样可以利用此差别来纯化细胞。 （4）克隆法 采用细胞克隆法将细胞分成单个细胞，使之分别生长成克隆，选择出所需要的克隆。 （5）培养及限定方法 某些细胞在生长过程中必须存在或去除某种物质，否则无法生长，可以利用这种技术来纯化细胞。如选用不含血小板生长因子的无血清培养基可去除表皮细胞中的成纤维细胞。 （6）流式分选亦可用全皮消化法或组织块培养法培养，但表皮细胞和成纤维细胞混合生长，难以纯化。 表皮细胞采用角蛋白的特异性抗体鉴定。 3T3饲养层上，3-5d形成细胞集落，10d左右开始汇集融合，进而形成整片细胞皮片，细胞增殖减缓（细胞覆盖培养瓶底的70%-80%时需传代）。复合培养时，能形成棘细胞层、颗粒细胞层和角质细胞层等皮肤各层结构。巨噬细胞培养技术要点 M属免疫细胞，具有多种生物学功能，是研究细胞吞噬、细胞免疫和分子免疫学的重要实验工具。1. 来源于人胸水、腹水、血液和透析液等。若欲获取多量M，可于取材前向小鼠腹腔注射刺激物，通常取细胞前向动物腹腔内注射510ml 4%硫代乙醇酸盐，缺点是很多刺激物能激活吞噬细胞并被其吞噬，进行培养后，刺激物不能很快被消化掉，残留在细胞内，能干扰细胞代谢。全血可获得大量单核细胞，缺点是混有血小板及其他白细胞。2.其他细胞（LC、NC、PC和成纤维细胞等）成分的排除，大多数单核巨噬细胞有极易附着玻璃表面的特性，可用附着分离法去除其他细胞成分，纯度可达95%。3.巨噬细胞对胰蛋白酶和EDTA均不敏感，不易使之离壁，借此可与其他细胞相区别，也是淘汰其他细胞的方法。纯利多卡因37 5分钟可使细胞分离。4.正常M能附着瓶壁，胞质延展，胞质有皱褶，胞核呈特有的肾形，细胞较多时可形成单层，有时细胞呈多角形并连接成网状。5强烈的吞噬活动，如向培养中加入淀粉、乳胶粒和红细胞等，可见巨噬细胞能吞噬5个以上的颗粒。6直接从腹腔获取的巨噬细胞为静止性细胞，呈圆形，伪足不明显。经硫代乙醇酸盐诱导可获得大量的炎性巨噬细胞，细胞多呈梭型，有较强的运动和吞噬能力。7. 巨噬细胞易获得，便于培养，并可进行纯化。但属不繁殖细胞群，难以长期生存，多用作初代培养。8.状态不良时，胞质常不延展，胞体变圆，不透明，或脱离瓶壁漂浮在培养液中，失去吞噬能力。骨骼肌细胞培养特点 胚胎或幼体的大腿肌组织最好 胰蛋白酶消化，培养液中可加入1%胎汁以促进分化 胶原底物或明胶可促进分化 细胞生长开始呈纺锤形，50 52h后出现多核纤维（细胞融合），数日后融合停止， 可见横纹及收缩现象（融合后23天），有时可导致细胞从底物脱离 可进行传代培养成为有限细胞系，但易失去分化现象；表现为肌细胞不发生融合， 从而不能形成多核肌纤维和出现收缩现象。胚胎干细胞 指从着床前的胚胎内细胞团（桑椹胚）或原始生殖细胞获得的一种具有多潜能性、可发育成为各种细胞、同时可保持不分化状态而持续生长的克隆细胞系。胚胎干细胞的体外培养 1.有饲养层（feeder layer）培养法：以小鼠成纤维细胞耐硫代鸟嘌呤和耐乌苯苷亚系（STO）或小鼠胚胎成纤维细胞（ Mouse Embryo Firbroblasts, MEF）制备饲养细胞单层，主要是利用其分泌的生长因子FGF和抑制干细胞分化因子白血病抑制因子（LIF）共同作用，保持干细胞在体外克隆而不分化。2.无饲养层培养法：利用各种能分泌抑制分化因子的细胞制备条件培养基或在基础培养基中加入重组的LIF制备条件培养基。ES细胞的鉴定- 细胞的形态结构- 核型分析- 碱性磷酸酶（AKP）染色- SSEA-I 免疫荧光标记- 分化能力检测 1.体外分化试验2.体内分化试验3.嵌合体形成试验4.核移植试验成体干细胞 是成体组织内具有自我更新及分化一种或一种以上子细胞的未成熟细胞。来源于成年组织或器官，一般具有组织特异性，只能分化成特定的细胞或组织。为多能干细胞或单能干细胞，如造血干细胞和上皮干细胞等。成体干细胞分离纯化-利用细胞表面标志分离单克隆抗体的特异性和多样性使利用不同抗体的合理组合分离不同类型的细胞成为可能。阳性细胞分选法：从混杂细胞群体中获得表达与抗体相应膜抗原的细胞群；阴性细胞分选法：除去表达与抗体相应膜抗原的细胞，而收集其余的细胞群体，称为阴性细胞分选法。 技 术：1.抗体/补体介导细胞溶解法：阴性细胞分选法2.流式细胞仪分选法3.平面粘附分离法4.免疫磁珠分离法 诱导式多能性干细胞（induced pluripotent stem cell，iPS细胞）。 最初是日本人山中申弥（Shinya Yamanaka）于2006年利用病毒载体将四个转录因子（Oct4, Sox2, Klf4 和c-Myc）的组合转入分化的体细胞中，使其重编程而得到的类似胚胎干细胞的一种细胞类型。造血干细胞（hematopoietic stem cell , HSC）概念：是指存在于造血组织内的一类能分化生成各种血细胞的原始细胞。造血干细胞不是纯一的细胞群体，而是由不同年龄等级的干细胞组成。这些不同年龄等级的干细胞的表面抗原、免疫表型和粘附分子的表达不一，生物学特性也有一定的差异。造血干细胞的分离纯化 通常先利用密度梯度离心等方法去除待分离物中的红细胞和成熟粒细胞等成分，获得单个核细胞。然后利用CD34等分子特异的抗体标记单个核细胞，通过流式细胞分选、免疫吸附系统（包括淘洗技术、免疫吸附柱层析、免疫磁珠等）等方法将被标记细胞与未被标记细胞分离开来。 另外，也可以利用造血干细胞大多处于静止期，对活体染料拒染的特性对其进行富集纯化。肿瘤干细胞（CSC） 存在于肿瘤组织中、数量稀少的、具有干细胞性质的细胞群体，具有自我更新的能力，是形成不同分化程度肿瘤细胞和肿瘤不断扩大的源泉。 生物学特性 1.自我更新；2.产生分化程度不同、表型特征不同、增殖潜能不同的细胞，以及构成组织；3.激活抗凋亡途径；4.迁移和转移。分离和鉴定 CSC筛选最常用的手段是利用CSC细胞表面特异标志物，通过流式细胞术或磁珠分选法分离得到CSC。根据肿瘤细胞中一群称为SP细胞(side population cell)能将核酸染料Hoechst33342排出胞外的特性，通过流式细胞术来分选虽然一些SP细胞也具备自我更新和分化能力，但究竟是不是CSC还需进一步研究。根据CSC的克隆形成能力来筛选。将肿瘤细胞放在软琼脂培养基上培养，CSC在无血清添加生长因子条件仍具有很强的自我更新和保持非分化状态的能力，进而能形成克隆，而其他肿瘤细胞则在传代过程中消亡。鉴定CSC细胞的金标准是看分选得到的CSC能否在移植动物体内形成新肿瘤。将分离出来的各细胞亚群按不同细胞浓度梯度接种NODSCID小鼠比较各细胞群成瘤能力，从而筛选出优势细胞表面标志，或者将几种优势细胞表面标志进行组合，筛出各种组合的细胞群，这一方法又称系列原位移植法。非粘附球囊分析法相比于系列原位移植法更简便，逐渐被用来分选鉴定CSC，CSC细胞能在无血清添加生长因子的培养基中保持未分化状态并形成致密球体，非CSC则贴壁缓慢生长，CSC得以富集。非粘附肿瘤细胞具备裸鼠体内致瘤能力和分化能力。但非粘附肿瘤球囊细胞是否是由于渗人的正常干细胞引起的效应还有待进一步证实。第八章 培养细胞生物学性状的检测单层细胞固定观察的特点: 细胞层次少，固定穿透快，固定效果好。 单层细胞不需包埋和切片。常用固定液（与一般固定组织所用相同）分两类： 简单固定液：用单一化学物质配制而成，主要有甲醇、乙醇、甲醛、丙酮、戊二醛等 。 混合固定液：用两种或两种以上的化学物质配制而成，如Mueller固定液、Flemming固定液、FAA固定液 、Carnoy固定液等。 几种常用的固定液 4%甲醛-PBS（中性缓冲福尔马林）： 甲醛是一种气体，其饱和水溶液无色，约含40%甲醛。用40%甲醛水溶液：PBS1：9配方制备甲醛固定液，对细胞染色体、线粒体和高尔基体的固定效果较好。 4%多聚甲醛-PBS固定液：多聚甲醛为白色固体，该固定液适于固定纤维蛋白和细胞骨架蛋白，进行核酸原位杂交时多用此固定液。 丙酮：多用分析纯的冷丙酮，固定细胞内酶的效果较佳，免疫组化时多用。 戊二醛：对组织的渗透率高，与蛋白质反应快，能较好地保存蛋白质，对微管和膜性结构保存也比较好，透射电镜分析时常用。 甲醇/醋酸固定液：甲醇：醋酸为3：1的固定液，是应用最广的一种培养细胞固定剂，甲醇穿透力好、易于挥发，醋酸固定蛋白效果好，且有使细胞膨胀作用，两者结合能使细胞形态固定不变。最适用于观察染色体，注意该固定液宜现用现配。 常用的染色方法 (1) Giemsa染色： 是最常用的方法之一，简便、快速，适用于多种细胞和染色体的染色。 (2) 苏木精-伊红(HE)染色法 (3) Feulgen染色法 ( 4)丫啶橙（acridine orange，AO）荧光染色法丫啶橙是一种常用荧光染料，与细胞内的DNA和RNA都有亲和力，但结合后却发出不同颜色的荧光，DNA呈翠绿色，而RNA呈橘红色至火红色。该法简便快捷，有一定的特异性，对活细胞毒性小，既可染活细胞进行荧光显微镜观察（但不持久），又可染固定细胞（效果更好）。 (5) 甲基绿-派若宁(methyl green-pyronin method)染色法:透射电镜 培养细胞透射电镜观察（戊二醛固定）免疫荧光技术【原理】用荧光素标记已知抗体或抗原，检测细胞内或组织标本中相应的抗原或抗体。 在荧光显微镜下，抗原抗体特异性结合部位的荧光素受激发光照射而发出明亮的荧光。根据荧光物存在的位置和强度，可以确定抗原抗体在组织细胞的部位和数量。 【注意事项】 需荧光显微镜观察，在暗视野下完成。 应立刻观察，荧光容易衰退，标本不能长期保存，应及时照相记录。 非特异性荧光对结果的影响，细胞内某些物质的自发荧光以及在免疫染色中产生的非特异性染色。 每次实验均需做阴、阳性对照。原位杂交 【特点】 1.应用广泛，如可对染色体中特定DNA序列精确定位、RNA杂交可观察组织细胞中特定基因的表达水平等。 2.不需从组织细胞中提取核酸，对组织细胞中含量极低的靶序列有极高的敏感性。 3.可完整地保持组织与细胞的形态，更能准确地反映细胞的功能关系。 4.能在复杂的组织中进行单一细胞的研究而不受同一组织中其它成分的影响，尤其适于那些细胞数量少且散在与其它组织中的细胞内DNA或RNA的研究。 细胞增殖情况检测 细胞增殖生长力是判定细胞活力的重要指标。 1. 细胞计数：是测定细胞绝对增长数值常用的最简单的方法。 方法：接种21孔/24孔细胞板，分7组，每组3孔，每日检测1组计数，最后将7天的数值绘成图，即为细胞生长曲线。此法不精确，有2030%的误差。 细胞数量增加1倍的时间称倍增时间。 2. 细胞分裂指数（Mitotic Index，MI）：被测细胞群中每1000个细胞中的分裂细胞数，用以表示细胞增殖的旺盛程度。 细胞分裂指数细胞分裂相数/1000个细胞 100% 细胞分裂可以直接观察到，但细胞分裂是动态变化过程，故分析细胞分裂指数需用固定标本。盖片培养固定染色。 3.接种存活率和克隆形成率 细胞制成悬液后，以低密度（25个细胞/cm2)接种到底物上，贴壁并能存活生长形成细胞小群（克隆）的百分数称接种存活率（克隆形成率），用以表示细胞群的活力。与细胞活力成正比。 接种存活率=形成克隆数接种细胞数100%注意与细胞接种率的区别：细胞接种率为冻存细胞复苏培养时测定的指标，与细胞接种存活率不完全相同。 细胞接种率贴壁存活数接种细胞数100%4.流式细胞仪（Flow cytometer, FCM）检测细胞周期时相和DNA合成 流式细胞仪是一种将流体喷射技术、激光技术、空气计数、g射线能谱术以及计算机与显微荧光光度计密切结合的仪器，已广泛应用于生命学科的几乎所有分支，特别是细胞生物学、肿瘤学、免疫学、血液学和药物学等的研究。可测量多种细胞参数：细胞大小、细胞形态、胞浆颗粒、色素含量、DNA含量、碱基比、RNA含量、总蛋白和表面抗原等。浸润生长性检测：浸润性生长是细胞浸入或穿透其他组织增殖生长的能力，是检测恶性细胞的一项有意义的指标。检测方法需用其他正常组织和癌细胞共同培养，观察癌细胞向正常组织浸润生长的情况。 体外浸润实验最常用的宿主组织是鸡胚胎组织，包括皮肤、肾、肝、肺和心脏组织，也可用羊膜组织，甚至是骨组织。裸鼠（nude mouse)： 是20世纪60年代作为无毛变种被发现，后来查明该类小鼠先天性胸腺缺陷，此性状由隐性遗传基因“nu”传递。裸鼠缺乏T细胞免疫应答，而移植瘤的免疫排斥反应主要有T淋巴细胞完成，因此将肿瘤细胞移植在裸鼠体内，能成功建立移植瘤。裸鼠成瘤标准 待肿瘤体积直径达1cm后进行观察（两周或更多）。12个月肿瘤生长后解剖，固定，包埋，切片染色检测。第九章 组织培养细胞工程技术突变体 凡有机体或细胞群中细胞发生与标准体（野生型：Wild Type）相异的、可遗传的变异体，称突变体（Mutant）。诱变剂：人工诱发突变可用物理如射线、温度，化学如药物试剂，以及生物病毒等。 注意：不论用哪种诱变剂，剂量以不过分损伤细胞（杀伤率不超过30%）为准。HGPRT基因： 人和动物的HGPRT基因位于X染色体上，其基因产物为次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT），该酶能促次黄嘌呤和鸟嘌呤与磷酸核糖焦磷酸（PRPP）间的转磷酸核糖基作用，而生成一磷酸次黄苷（IMP），这是细胞合成嘌呤核苷酸的补救通路。但次酶特异性不强，也能把嘌呤拟似物6-巯基嘌呤（MP）和6-杂氮鸟嘌呤（AG）掺入DNA中，后两者可引起细胞死亡。故当HGPRT基因突变时，细胞就表现出对MP和AG的抗性，在有MP或AG的条件下，能够生存。而野生型（正常型）细胞却因摄取MP或AG而死亡。细胞选择：选用适宜的野生型细胞。以增殖速度克隆形成率高、培养条件要求较低的细胞为佳。细胞融合 两个或两个以上的细胞合并形成一个细胞的过程 。 诱导剂 仙台病毒：早年使用。为RNA病毒。聚乙二醇（PEG）：易得，用法简单，融合效果稳定，已取代仙台病毒。第十章 体外培养细胞的转化 和DNA转导技术DNA转导或导入 把DNA或基因导入细胞内的技术。是研究基因重要的方法。转化类型： 1细胞自发转化：是指在未用任何诱变剂处理的情况下，细胞自发出现转化的现象，实质上是一种原因不明的转化现象。自发转化表现为：细胞核型异倍化，获得永生性，接触抑制消失等，但不一定是恶性。.2.人工诱发细胞恶性转化：细胞转化的基本过程 致突变作用是诱发细胞DNA损伤的过程；致癌是诱发细胞发生癌变的过程。体外培养细胞转化研究证明，细胞从正常到发生恶性转化大致经过以下几个阶段： 1.诱发（Initiation）：又称启动，是致突变或诱发