EGFR基因突变(ARMS法)检测标准操作规范.doc

EGFR基因突变（ARMS法）检测标准操作规范1、 目的：明确EGFR基因突变（ARMS法）检测操作、结果判断、报告内容及质控管理规程，保证检测结果的可靠性。2、 执行人：李文辉、郭志云3、 试剂来源：苏州为真生物医药科技有限公司4、 质控物：阴性、阳性对照均为试剂配套。5、 实验操作步骤：5.1 DNA提取 FFEP样本DNA的提取(QIAGEN)（1）切片、烤片：切35张厚度为810m的组织片，捞至普通玻片上（若为小组织，则切10张，同一玻片可捞多张），60考片30分钟；大组织另外切一张3m组织片进行常规HE染色，作病理评估之用。（2）脱蜡：将组织切片置于二甲苯中室温脱蜡2次，每次10min；随后浸入100%乙醇3min。将组织切片依次室温置于100%、80%、70%梯度乙醇中各2min，复水后，室温浸入去离子水3min。（3）评估、刮片：组织片经病理评估后，用洁净盖玻片刮取癌组织密集区域，并转移至洁净的1.5ml EP管中；小组织全部刮取至1.5ml EP管中。（4）消化：加入180l ATL和20l蛋白酶K，震荡混匀，根据组织大小可增加消化液的用量，56，1h，根据组织大小可延长消化时间甚至过夜消化（期间可以适当摇晃颠倒样品，使之混匀裂解充分；可裂解至组织消化完）。（5）升温：将温度调至90，作用1h（注意管盖，90高温可能会导致爆盖以致液体被蒸发；时间不要太长1小时足够；一个水浴锅时，56到90之间过渡时应将样本置于室温中，待温度完全升到90后再将样本放进去）。（6）短暂离心使液体聚于管底，加入200l AL，震荡混匀，然后加入200l无水乙醇，震荡混匀。（7）短暂离心使液体聚于管底，将整个液体全部移入收集柱中，然后8000rpm离心1min，丢弃收集管后将收集柱至于新的收集管中。（8）加入500l AW1漂洗液，离心8000rpm，1min，丢弃收集管后将收集柱至于新的收集管中。（9）加入500l AW2漂洗液，离心8000rpm，1min，丢弃收集管后将收集柱至于新的收集管中。（10）离心14000rpm，3min，以去除收集柱中的残余液体。（11）开盖后放置5-10min，以去除残余乙醇。（12）加入洗脱液20l，然后室温静置5min。（13）离心14000rpm，1min，收集洗脱液。新鲜组织样本（TIANGEN）（1）新鲜组织取量30-50mg（脾组织用量应小于10mg），使用剪刀或者匀浆器将组织剪碎（尽量越碎越好，形成细胞悬液），然后10000rpm离心1分钟，倒尽上清后加入200l缓冲液GA，震荡悬浮。（2）加入20l蛋白酶K溶液，混匀后在56放置，直至组织熔解（1-3小时，期间注意颠倒样本几次，以混匀使裂解充分）。（3）短暂离心使液体聚于管底，加入200l缓冲液GB，充分颠倒混匀，70放置10分钟。（加入GB时可能会产生白色沉淀，70之后会消失变清亮，如果未变清亮说明细胞裂解不彻底）。（4）短暂离心使液体聚于管底，加入200l无水乙醇，充分振荡混匀15秒，此时可能会出现絮状沉淀。（5）短暂离心使液体聚于管底，将管中全部液体及絮状沉淀全部加入到吸附柱中，12000rpm离心30秒，倒掉废液后将吸附柱继续放回收集管中。（6）加入500l缓冲液GD，12000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱放回收集管中。（7）加入700l漂洗液PW，12000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱放回收集管中。加入500l漂洗液PW，12000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱放回收集管中。（8）12000rpm离心2分钟，丢掉收集管，将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干残余漂洗液。（9）将吸附柱置于一个新的干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50l洗脱缓冲液TE，室温静置5分钟，12000rpm离心2分钟，收集洗脱液。5.2实验仪器及试剂的准备（1）打开仪器开关，仪器进行自检后，确认指示灯显示正常可以使用时，进行后续操作，仪器待用。（2）冰盒的准备：制备碎冰，以便放置试剂以及冰上进行实验操作。（3）试剂的处理：将试剂盒中的试剂置于冰上自然解冻，其中聚合酶需要插入冰中，以保护酶的活性。（4）移液器及耗材的准备：准备好无菌干净的移液器、吸头、PCR管等，确保使用的材料不能对实验结果产生影响。5.3 DNA浓度测定（PCR法）（1）将已解冻的试剂包括八连管、DNA样本、纯化水，振荡混匀后进行快速离心，然后再置于冰上；DNA聚合酶快速离心后置于冰上。（2）对需要配制的试剂进行成分计算：加入组分体积n.2（如三份样本则3.2）PCR MIX10ulDNA聚合酶0.2ul纯化水7.8ul总体系10ul（3）在PCR管冰架上，架上洁净的八联管。（4）将反应混合物依次加入八联PCR管中，每孔加入18ul，然后小心盖上八联PCR管管盖（不要污染膜或者管盖的表面，以致影响荧光检测）。（5）依次加入样本DNA、10倍稀释DNA、100倍稀释DNA、标准品DNA、纯化水（阴性对照）各2ul，反应总体系20ul。（6）将加样后封闭好的PCR板或八联管振荡混匀，然后离心使液体聚于管底。（7）按下PCR仪上的出舱按钮，将PCR板或八联管放于舱中，然后再按以下按钮进舱送入荧光定量PCR仪中。（8）仪器显示正常，然后编辑反应程序，选择SYBE GREEN反应程序（如果是第一次使用，请保存此反应模板，以便下次进行实验）：第一阶段 酶激活阶段： 95 5min40循环第二阶段PCR扩增阶段：95 10s 60 15s 72 35s（荧光）第三阶段 冷却过程： 40 10s（9）实验结束后，选择浓度（Ct值）接近标准品（10ng/ul）的样本DNA稀释度进行下一步操作。5.4试剂配制及程序设置（1）将已解冻的试剂包括八连管、样本DNA、纯化水，振荡混匀后进行快速离心，然后再置于冰上；DNA聚合酶快速离心后置于冰上。（2）对检测需要配制的试剂进行成分计算：加入组分体积8.2样本DNA/阳性质控/纯化水2ul16.4ulDNA聚合酶0.2ul1.64ul纯化水7.8ul63.96ul总体系10ul82ul 按照上表计算的量配制各各样本的MIX混合液。（3）在PCR管冰架上，轻轻揭开八联管管盖。（4）将MIX依次加入八联PCR管中，每孔加入10ul，一个MIX对应一条八联管，然后小心盖上八联PCR管管盖（不要污染膜或者管盖的表面，以致影响荧光检测）。（5）将加样后封闭好的PCR板或八联管振荡混匀，然后离心使液体聚于管底。（6）按下PCR仪上的出舱键，将PCR板或八联管放于舱中，然后点击进舱送入荧光定量PCR仪中。（7）仪器显示正常，然后编辑反应程序，选择Tapman反应程序（如果是第一次使用，请保存此反应模板，以便下次进行实验）：40循环第一阶段 酶激活阶段： 95 5min第二阶段PCR扩增阶段：95 20s 60 40s （荧光）第三阶段 冷却过程： 40 10s6、结果分析（1）软件操作流程参照ABI7500操作手册。（2）实验结束以后在FAM通道，运行外控（Control）Ct值的计算，一般Ct值34.0，可以继续分析，如果Ct值34.0，则说明样本DNA降解严重，不适合实验需求。（3）运行无模板对照（NTC）时，FAM信号无曲线升起，说明实验无污染存在，可以继续分析实验情况。当Ct值35.0时，有微弱的扩增信号，对实验的影响极微，可以继续分析实验情况。（4）运行阳性质控品，所有阳性质控Ct值一般小于30.0，但可能会由于不同仪器的不同阈值设置而发生波动。（5）在FAM通道中运行Ct的计算，结果判断见下表。E19-delE20insG719XT790ML858RL861QS768I阳性曲线呈S型且C34.0曲线呈S型且Ct34.0曲线呈S型且Ct34.0曲线呈S型且Ct34.0曲线呈S型且Ct34.0曲线呈S型且Ct34.0曲线呈S型且Ct34.0阴性无扩增曲线或Ct值35.0无扩增曲线或Ct值35.0无扩增曲线或Ct值35.0无扩增曲线或Ct值35.0无扩增曲线或Ct值35.0无扩增曲线或Ct值35.0无扩增曲线或Ct值35.0可疑阳性34Ct3534Ct3534Ct3534Ct3534Ct3534Ct3534Ct357、质量控制7.1判断项目（1）HE染色片：实验之前必须设置HE切片对照并对样本进行病理评估，手术标本须明确肿瘤组织集中区域，避开坏死和炎症组织；活检标本须保证有足够的肿瘤细胞。（2）设置阴阳对照：每次实验以ddH2O作阴性对照，阳性标准品作阳性对照（均为试剂盒内提供），以排除实验操作失误引起的判断误差。7.2实验结果无效的判断标准（1）样本外控（Control）没有扩增曲线，或Ct值34.0。（2）阴性对照出现扩增曲线，且Ct值35。（3）阳性对照没有扩增曲线，或Ct值30.0（会由于不同仪器的不同阈值设置而发生波动）。7.3实验结果有效性判断（1）样本外控（Control）出现扩增曲线且Ct值34.0。（2）阴性对照没有扩增曲线，或Ct值35.0。（3）阳性对照出现扩增曲线且Ct值30.0（会由于不同仪器的不同阈值设置而发生波动）。7.4实验结果判断为无效时的处理（1）阳性对照及阴性对照信号有效而待检样本结果判断无效，则根据该标本特征，分析可能失败的原因（除组织本身因素外），改良实验细节，重新检测。（2）如对照及待检样本结果判断均不理想时，注意检查试剂适用日期，更换试剂，重新检测。（3）如仍无法检测出信号，确定为组织本身因素（如组织处理不当或肿瘤成分过少）时，应向临床或患者提出能否更换样本重新检测，如仍无法检测，应在报告中指出检测失败原因，附结果图，由主任复查后签出报告，并在分子病理结果异常登记表上做好登记。8、报告内容8.1检测成功依据检测结果判断，报告检测标本有无基因突变。8.2检测失败除操作及试剂因素外，简要说明检测失败原因，例如：由于标本质量欠佳，扩增信号不出，未能检测EGFR基因突变状况。