碱性磷酸酶染色(NAP).ppt

碱性磷酸酶染色 NAP 目的掌握卡氏偶氮偶联法测定中性粒细胞碱性磷酸酶染色的原理 方法 注意事项和临床意义 原理中性粒细胞胞质中的碱性磷酸酶在pH9 6的碱性条件下能水解磷酸萘酚 生成萘酚 后者与重氮盐偶联形成不溶性的有色沉淀定位于胞质中的酶活性处 重氮盐有多种 常用的有坚牢蓝RR 坚牢蓝BB 坚牢紫酱等 新鲜干燥的涂片用冷10 甲醛甲醇固定液固定30s 流水轻轻冲洗30 60s 待干 把涂片浸入基质孵育液中 在室温 冬季放水浴箱 下温育10 15min 流水冲洗1 2min 加苏木素染色液中复染5 8min 流水冲洗 待干 镜检 结果判断胞质中出现紫黑色或棕红色颗粒为阳性 判断标准如下 0分 胞质中无阳性染色颗粒 1分 胞质中含少量颗粒或呈弥漫浅色 2分 胞质中含中等量的颗粒或呈弥漫着色 3分 胞质中含较多颗粒或弥漫较深色 4分 胞质中充满粗大颗粒或弥漫深色 5计算阳性率和积分值 方法步骤 磷酸萘酚盐和重氮试剂品种繁多 应根据基质选择相适应的重氮盐 坚牢蓝等重氮盐的质量好坏是本法成败的关键 基质孵育液必须临用前新鲜配制 先应将血膜固定干燥后 才开始配制基质液 若无2 氨基 2 甲基 1 3 丙二醇 可用巴比妥缓冲液 pH9 2 或0 2mol LTris缓冲液 pH9 2 代替 注意事项 临床上主要用于鉴别 1 慢性粒细胞白血病与类白血病反应 慢性粒细胞白血病 无继发性感染者 时 NAP积分一般明显下降 积分常 13分 甚至为零分 类白血病反应时则显著增高 积分常 200分 2 阵发性睡眠性血红蛋白尿症与再生障碍性贫血 阵发性睡眠性血红蛋白尿症常降低 再生障碍性贫血常增高 病情好转时 NAP积分则可逐渐下降 3 急性白血病的细胞类型 ALL增高 AML下降 临床意义 铁染色 Ironstain 目的掌握骨髓铁染色的原理 方法 注意事项及临床意义 原理骨髓小粒中的含铁血黄素称细胞外铁 其所含的三价铁经稀盐酸处理后而游离 并能与酸性亚铁氰化钾溶液发生普鲁士蓝反应 生成蓝色亚铁氰化铁沉淀 定位于含铁的部位 细胞内铁也可用此法显示 根据反应的强弱可了解骨髓中铁的含量 干燥涂片用甲醇固定10min 待干 玻片上滴满酸性亚铁氰化钾 37 染色30min 用蒸馏水冲洗后用核固红染液复染10 15min 流水冲洗 待干 镜检 结果判断 1 幼红细胞核呈鲜红色 胞质呈淡黄红色 铁粒呈蓝绿色 2 细胞外铁用低倍镜观察涂片 特别是涂片尾部和髓粒附近 注意翠蓝色颗粒的存在 可分五级标准 3 细胞内铁用油镜计数100个中 晚幼红细胞 记录胞质中含有蓝色铁颗粒的细胞 铁粒幼细胞 的百分率 根据细胞内铁颗粒的数目 大小 染色深浅和颗粒分布的情况 将铁粒幼细胞分为四型 方法步骤 细胞外铁的划分标准 无颗粒 有少数铁颗粒或偶见铁小珠 颗粒体积大于嗜酸性粒细胞的颗粒者称为铁小珠 有较多的铁颗粒或小珠 有很多的铁颗粒 小珠和少数小块状 有极多铁颗粒 小珠 并有很多的小块 密集成堆 铁粒幼细胞划分 型 幼红细胞内含1 2个小铁颗粒 型 幼红细胞内含3 5个小铁颗粒 型 幼红细胞内含6 10个小铁颗粒 或1 4个大铁颗粒 型 幼红细胞内含10个以上小铁颗粒 或5个以上大铁颗粒 环形铁粒幼细胞 是指幼红细胞含铁粒 6个 绕核2 3以上者 玻片需经去铁处理将新玻片用清洁液浸泡24h 取出后反复水洗浸入95 酒精中24h 晾干 再浸泡在5 盐酸中24h 用双蒸水反复浸洗玻片 取出烤干后备用 骨髓取材要满意 外铁一定要有骨髓碎块或颗粒 取材不佳时 往往影响结果 酸性亚铁氰化钾溶液须新鲜配制 注意事项 鉴别缺铁性贫血和非缺铁性贫血 IDA时骨髓细胞外铁显著减少或消失 铁粒幼红细胞明显减少 所见铁粒细小色浅 且以 型为主 型极少见 型以上不见 经铁剂治疗后细胞外铁及内铁可迅速增多 此检查是诊断IDA及指导铁剂治疗的一种辅助方法 非IDA 如HA MA AA等病人的细胞外铁通常增高 内铁亦增高 以 型 型为主 可以见到 型 罕见 型 因此 有助于鉴别IDA与非IDA 用于诊断铁粒幼细胞性贫血 能找到数量不等的环形铁粒幼细胞 多见粗颗粒的 型与 型铁粒幼细胞 用于诊断伴环形铁粒幼细胞增多的MDS 骨髓中环形铁粒幼细胞 15 临床意义