神经系统的信号传递与电生理学研究方法ppt.ppt

神经系统的信号传递与电生理学研究方法 一 神经系统的信号传递二 电生理学方法介绍 一 神经系统的信号传递 1 电信号 局部电位 localizedgradedpotential 感受器 突触后膜 运动终板 动作电位 actionpotential 在神经纤维上传到的AP称为神经冲动 2 化学性信息 化学性突触传递 神经递质 激素 1 神经元轴突内神经活动的电变化 在神经机制探索中 唯一最重要的发现是神经冲动与电位变化相一致 神经活动的电信号给予研究者一个研究神经系统功能的手段 电信号像一个失踪物 通过它 研究者可在活体的复杂结构中跟踪神经冲动的去向 同时 也是了解信息如何在神经系统内编码的唯一线索 Measuringtherestingmembranepotential 1 电信号 MethodsofRecondingActionPotentials 1 电信号 Flippingthemembranepotentialbychangingtherelativeionicpermeabilityofthemembrane 神经纤维静息电位与动作电位波形与产生机制 Thevoltage gatedchannel Structureofthevoltage gatedsodiumchannela Themoleculeconsistsoffourdomains I IV b AnexpandedviewofonedomainshowingthevoltagesensorofalphahelixS4andtheporeloop red c Themoleculearrangeofdomainsformaporebetweenthem 2 神经元 神经元间化学性突触传递 SynapticarrangementsintheCNS VarioussizesofCNSsynapses 突触神经生理学是神经科学重要分支 研究突触电生理学 结构 功能和神经化学 人类神经系统每个细胞处在不同的反复分支的神经网络中 突触种类和大小复杂的 2 神经元 神经元间化学性突触传递 2 神经元 神经元间化学性突触传递 Amembraneionchannel Theproperties ionselectivityandgating Amembraneionchannel Theproperties ionselectivityandgating TransmitteractionsatG protein coupledreceptors ThebindingofneurotransmittertothereceptorleadstotheactivationofG proteins ActivatedG proteinsactivateeffectorproteins whichmaybe a ionchannelsor b enzymesthatgenerateintracellularsecondmessengers 神经纤维上传导的动作电位 allornon 不衰减性传导 分析其频率 潜伏期 传导速度 神经元胞体及树突产生的局部电位 幅度总和 感受器 突触后膜EPSP IPSP 运动终板 神经递质和受体 电压和化学门控通道 理 化性质 总结 电生理学研究的指标 二 电生理学方法 细胞外纪录 extracellularrecording 细胞内纪录 intracellularsingleunitrecording 电压钳 voltageclamp 膜片钳 patchclamp 脑电图 EEG 诱发电位 evokedpotential 微电泳 microelectrophoresis 抗体微量注射正电子发射断层扫描术磁共振成像术 1 阴极射线示波器 oscillograph 显示电信号 电子流惰性小 是记录神经非常短促和微弱电流最好的方法 2 生物电放大器 amplifier 频率相应范围大 通频带从0 100kHz 有足够高的放大能力 低噪声 高输入阻抗 高的辨差比 3 电子刺激器 electronicstimulator 矩形脉冲 刺激强度 幅度 最大瞬时值 0 001 200V之间 连续可调 时间 波宽 10 s 1s 频率 波宽和延迟时间之和小于频率的倒数 延迟 刺激方式 单 连续 双脉冲刺激 同步输出 触发其他需要与刺激同步的仪器 示波器 微电泳 照相等 一起工作 刺激隔离器 insulator 4 储存和分析电生理实验结果的仪器 示波器照相机 录音机 计算机 叠加 直方图 平均等 常用的主要仪器 电记录的技术 A 细胞外记录法记录法记录单个细胞或一群细胞的电活动 B 微电极细胞内记录法记录膜内外的电位差 静息电位和动作电位 C 全细胞膜片钳记录法记录当膜上单个通道开启或关闭时的电流 工作原理 把引导电极安放在神经组织的表面或附近引导神经组织的电活动 活动部位的神经元去极化 未活动部位极化状态 在容积导体中两部位电位不同 电流流动 放置在细胞表面的电极会纪录出两者间的电位差 优点 方便 电极不插入细胞 特点 细胞外电位的波形因记录细胞的不同部位而异 神经纤维外纪录 细胞外纪录ExtracellularRecording CNS神经元细胞外记录 在接受其他神经元传来的兴奋性或抑制性的信息被激活后 可再所记录神经元的被激活部位 电穴 和该神经元的其他部位 电源 间形成局部电流 玻璃微电极 尖端直 0 5 m 电极电组 5 20M 充灌液 3mol LKCI 4mol LNaCI 2 旁胺天蓝 0 5mol L醋酸钠溶液pH7 7 钨丝金属微电极 尖端40 70 m 电阻低 机械强度高 直接穿透硬脑膜 电噪声低 可反复使用 细胞外纪录ExtracellularRecording 根据细胞外记录微电极处于电源或电穴的位置关系 能记录一个极性不同的电位 正或负 胞外电极记录的电位大小和波形会有多种变化 因此 重点分析放电频率和潜伏期 而不去比较放电的幅度 工作原理 在膜两侧各置一个电极形成一个回路 记录膜电位 membranepotential EPSP IPSP 动作电位 优点 准确测量膜电位的绝对值 因膜内到膜外电阻很大 值可高达100mV 意义 是研究神经元基本生物物理特性的有效手段 关键问题 成功而持久的胞内记录 1 稳定 排除机械和动物呼吸和循环功能引起的运动 2 合格的玻璃微电极 细胞内纪录IntracellularSingleUnitRecording HodgkinandHuxley 细胞内纪录IntracellularSingleUnitRecording 由于插入神经元内胞体并记录细胞内电位的微电极技术的发展 Eccles等首先将微电极插入脊髓运动神经元的胞体 记录哺乳类动物脊髓的大运动神经元胞内电位 运动神经元的胞体直径70 m 微电极尖端直径0 5 m 跨膜电位差60 80mV 图7 3 用微电极在猫脊髓运动神经元内记录的突触后电位A B C 三种不同的阈下刺激 40秒扫描的叠加 D 10次刺激引起的峰电位 图7 12 刺激神经在单根肌纤维的终板上所诱发的电位a 正常终板电位和相继发生的肌肉峰电位 b c d e 箭毒进行性地阻滞肌反应 e只留下终板电位 神经肌肉传递被箭毒阻滞了 图7 2 枪乌贼星状神经节的突触前纤维表现的动作电位和在突触后神经元诱发的局部电位 20世纪50年代 HodgkinandHuxley首次应用电压钳技术对枪乌贼的标本进行膜电流的测定 工作原理 离子流过通道所形成的离子流是形成动作电位的基础 电生理实验以电流作为刺激源 使可兴奋细胞产生兴奋 然后测定其膜电压以确定离子通道的状态 但在形成动作电位时所产生的离子流可影响膜电位 而膜电位的变化又会影响该离子的通透性的变化 因而 须人为地使膜电位在一定时间内维持在一个固定水平 电压钳技术是通过插入细胞内的一根微电极人为向胞内补充电流 补充的电流正好等于跨膜流出的反相离子电流 大小相等方向相反 意义 1 确保膜通透性发生改变时 控制膜电位始终维持在指令电位的水平 不变 2 通过电流检测装置 记录到补充入胞内的注入电流 它相当于离子电流的反相电流 这样可测定在不同膜电位水平的离子电流 从而了解膜通道的电导及功能活动 电压钳voltageclamp 应用 定量分析刺激与细胞后膜电导的变化 反映整个细胞膜上所有通道活动的综合结果 不足 此项技术不能了解单个离子通道的功能活动状态 另外 牵制的面积大 包含大量的随机开放和关闭的通道 形成的背景噪音也大 掩盖单一通道的微弱电流 另外 小神经元插入两个电极不容易 电压钳装置图和电压钳实验记录的膜电流 1976年由德国Neher和Sakmann发明 1991NobelPrize 工作原理 同电压钳 即在人为设置电压并固定的情况下记录分析离子通道 膜片钳技术使用玻璃微电极吸管把只含1 3个离子通道 面积为几个mm2的细胞膜通过负压吸引封接起来 由于电极尖端与细胞膜的高阻封接 在电极尖端下的那片膜与膜的其他部分从电学上隔离 因此 片膜内通道开放所产生的电流流进玻璃吸管 用一个极为敏感的膜片钳放大器测量此电流强度 即代表单一离子通道电流 性能 电极尖端 1 5 m 与膜之间电阻 109 G 10G 100G 的高封接 giga seals 大大提高了膜片钳的可靠性和灵敏性 可测量0 06pA的电流 1 m的空间分辨力和10 s时间的分辨力 意义 膜上电压依赖型离子通道有开与关两种电导状态 通道膜片钳技术可直接观察离子通道 开启 和 关闭 膜片钳PatchClamp Patchclampingrecordioniccurrentsthroughsinglechannels Thepatchcontainsavoltage gatedNa channel Changingthemembranepotentialfrom 65mVto 40mV Causethechanneltoopen andcurrent I willflowthroughit e Theamplitudeofthemeasuredcurrentataconstantmembranevoltagereflectsthechannelconductance andthedurationofthecurrentreflectsthetimethechannelisopen a Aglasselectrodeontothemembraneoftheneuron B Applyingsuctionthroughtheelectrodetip c Withdrawtheelectrodefromthecell themembranepatchwastornaway D Ioniccurrentswasmeasuredassteadyvoltagesacrossthemembrane TheopeningandclosingofNa channelsuponmembranedepolarization a Theelectricalpotentialacrossapatchofmembrane Whenthemembranepotentialischangedfrom 65 40mV theNa channelspopopen b Threedifferentchannelsrespondtothevoltagestep C AmodelforhowchangesintheconformationoftheNa channelproteinmightyielditsfunctionalproperies Theshortcutpathway a G proteinsinheartmuscleareactivatedbyAChbindingtomuscanrinicreceptors b TheactivatedG subunitdirectlygatesaK channel Apatch clamprecordingfromatransmitter gatedionchannel Ioniccurrentpassesthroughthechannelswhenthechannelsareopeninthepresenceofneurotransmitter 1924年德国Jena HansBerger第一次纪录人类脑电图 脑电流描记术的大部分基础知识和脑电图的用途 生理 神经 精神和心理 双极或单极引导法 将引导电极放在颅骨表面之上 记录脑活动时微弱电流 通过强力放大记录出来的电位成为脑电图 EEG 单极引导可更好地确定电信号的发源地 有利于临床病灶诊断定位 反映皮层锥体细胞的总和电位活动 锥体细胞的尖端树突相互平行 产生细胞外电流的总和 正常脑电图 两种节律 脑电图Electroencephalogram 图 正常成年人的典型脑电图注意 节律在头的后部占优势 ThegenerationoflargeEEGsignalsbysynchronousactivity a InapopulationofpyramidalcellsunderanEEGelectrod eachneuronreceivesmanysynapticinputs b Iftheinputsfireatirregularintervals thepyramidalcellresponsesarenotsynchronized andthesummedactivitydetectedbytheelectrodehassmallamplitude c Ifthesamenumberofinputsfirewithinanarrowwindowsothatthepyramidalcellresponsesaresynchronized theresultingEEGsumismuchlarger 影响脑电图的因素 1 神经细胞代谢 缺氧 低血糖和酒精 脑电图出现慢节律 电压降低 2 药物 抗痉挛药 麻醉药 乙醚 巴比妥盐 EEG与知觉水平相关 3 睡眠 EEG变化非常复杂 发现 诱发电位电生理学始于1913prevdish Neminsky的实验 电刺激坐骨神经 皮层脑电图上出现明显的电波偏移 一种分布非常广泛的活动 是追踪外周冲动到达皮层通路的一种工具 定义 中枢神经系统任何部位对于感受器官 感受神经 感觉通路上的任何一点受刺激时所产生的电变化 性质 慢电位变化 主要是突触后电位总和而成 波幅一般在0 1 20 V之间 由于波幅小 多在自发放电的背景上产生诱发电位 平均诱发电位 AEP 诱发电位出现与施加的刺激有一定时间关系 相同实验条件下 同一系统 潜伏期的长短是恒定的 用计算机平均叠加技术把多次反应的微弱电信号叠加起来 使其从背景电波中清晰地记录 临床应用 听觉诱发电位 视觉诱发电位 躯体感觉诱发电位 诱发电位EvokedPotential 躯体感觉诱发电位 在躯体感觉系统中 从楔核 丘脑和皮层可记录到刺激外周神经引起的反应 刺激右侧上肢皮肤在左侧中央后回纪录的诱发电位 a 感受器电位 b 双极细胞 C 色素细胞 图10 7 注意 时皮层反应的变化不论受试者是否 注意 短声或警惕短声即将来临 耳蜗神经反应无显著变化 而皮层反应出现明显的CNV 微音器电位 多个毛细胞感受器电位的总和 A与B对比说明 声音位相改变时 微音器电位位相倒转 而听神经复合动作电位位相不变 应用光学记录技术 把特别研制的荧光染料与细胞膜结合 在有动作电位发生时 这种燃料的光吸收特性发生改变 正电子发射断层扫描术 positronemissiontomography PET 磁共振成像术 magneticresonaceimaging 显示清醒人的大脑中受刺激区域 或发动运动时的活动状态 神经元活动的无创伤技术 正电子发射断层扫描术PositronEmissionTomography PET A 看一个词B 听一个词C 说一个词D 想一个词 利用正电子湮灭反应的物理学特性 以及脑激活时脑的能量代谢加强 血流量增加及血液容积改变等生物学特性 总和而成的最先进的脑功能检侧技术 PET扫描首先将能发射正电子的放射性核素 18F或15O 标记到选定的化合物上 然后将它引入体内 放射性核素在衰变过程中发射出正电子 与邻近组织中的电子相遇后湮灭 探测器确定其位置 脑功能性磁共振成像术MagneticResonaceImaging 功能性磁共振成像技术检测视皮层的功能活动A未刺激时组织的去氧血红蛋白比例高 B 刺激后组织氧合血红蛋白增高 C 视觉刺激后脑影像视皮层活动区 突触前神经末梢的递质以量子式释放的 量很微少 因此在进行神经递质功能测定时 只能用最小而有效的剂量模拟神经递质的生理功能 这是与药理学方法明显的区别 药理学研究可能用很大的剂量 所引起的效应可能与生理效应不同甚至相反 微电泳 microelectrophoresis 抗体微量注射 神经递质的功能测定 定义 借助微电极通以一定的电流将解离物质电泳到神经元附近 观察神经递质或其他药物对该神经元的作用 基本原理 外加电流通过含解离物质溶液的微电极时 会将微电极内的解离物质从管尖释放出来 例如在微电极接正极 动物头皮接负极时 带阳离子的物质从微电极中释出 相反 微电极接负极 头皮接正极 内向电流 时 微电极释出的是带负离子的物质 微电泳时解离物质从微电极释出量 与它通过的电荷量成正比 因此 通常用微电极的电流强度表示解离物质的释放量 3 方法 1 拉制微电极 五管 每管尖端直径1 3 m 五管总直径5 10 m 其中 一管为纪录 一管为对照 三管为药物 2 微电极充满溶液后 在立体定位以帮助下 姜微电极插至所需要观察的脑核团内的神经元附近 微电泳仪上的输出接头通过Ag AgCI细丝插入微电极各管中 另一共用接头连在动物头皮上 是每一管电极与头皮电极之间形成回路 然后 立即施加滞留电流防止自发性外溢 微电泳时选择一定强度 nA 的电流通过微电极 微电极中的解离物质释放量与通电电流强度成正比 微电泳Microelectrophoresis Microionphoresis Thismethodsenablesaresearchertoapplyverysmallamountsofdrugsorneurotransmittercandinatestothesurfaceofneurons 基本原理 抗体抗原中和反应 特异性抗体注射在某一脑区 可中和神经末梢释出而进入突触间隙的神经肽 防止其与受体结合 因此 用此方法可解释消除该神经肽的生理效应的结果 从而推测内源性神经递质的作用 中枢内直接注射法包括 脑室内注射 通过脑内买治慢性慢性套管和脊髓蛛网膜下腔慢性插管进行恒速微量注射等方法 或通过玻璃微电极项纪录的神经元附近微量注射 抗体微量注射 Theneuropharmacologyofcholinergicsynaptictransmission Sitesoftransmitterreceptorscanbindthetransmittersitself ACh anagonistthatmimicstransmitter oranantagonistthatblockstheeffectsofthetransmitterandagonists Theneuropharmacologyofglutamatergicsynaptictransmission Therearethreemainsubtypesofglutamatereceptors eachofwhichbindsglutamateandeachofwhichisactivatedselectivelybyadifferentagonist