TUNEL实验步骤.doc

DeadEndTM Colormetric TUNEL System1. 概述12. 产物成分及贮存条件 33. 测定法规程.4A 规程文献 .4B 组织片段中细胞凋亡的分析步骤5C 细胞培养中细胞凋亡的检测步骤.7D 阳性对照（随机）进行.9E 采用茴香霉素诱导的HL-60细胞凋亡的步骤.94. 故障循迹105. 缓冲液和溶液的成分组成.106. 相关产物.107. 参考文献.121. 概述DeadEndTM Colormetric TUNEL System 是一种非放射性系统，用于单个细胞水平上的平上的原位地简单、准确、快速的检测凋亡细胞。TUNEL通过测量DNA的断裂片段（DNA断裂片段可以作为许多细胞类型的细胞凋亡的重要的生物化学指示因子），以此测定组织片段和培养细胞的凋亡死亡细胞。高等真核生物的绝大多数细胞都能够通过一种内在细胞间的自杀程序（例如程序性细胞死亡和细胞凋亡）来进行自我灭亡。细胞凋亡对于生物发育、内稳态和一些疾病十分重要。细胞凋亡具有一些特定的形态学特征，包括泡状膜、细胞核和细胞质皱缩、染色体凝集。细胞凋亡产生的细胞碎片通过胞膜联合形成凋亡小体，凋亡小体易被巨噬细胞和周围细胞吞噬和消化，并且不产生炎症反应。这与类似细胞坏死的细胞死亡恰恰相反，其特征为细胞膨胀、染色体絮凝、膜完整性的缺失、细胞溶解和局部的炎症反应。 凋亡细胞中，在内源性核酸内切酶的作用下产生了DNA断裂片段，因此其细胞核中发生了形态学变化。最具代表性地是，凋亡细胞的DNA被分为以180200bp为单位长度的多聚体片段，这些片段易在琼脂糖凝胶形成梯度。在外侧膝体核（LGN）、Fas抗体处理后的Jurkat细胞系(急性T细胞白血病细胞系)和茴香霉素处理后的HL-60细胞系中，采用轴突切断术诱导大鼠脑组织的神经死亡，并在振动切片机上切为组织片段，清晰地标记出凋亡细胞。DeadEndTM Colormetric TUNEL System在原位标记DNA断裂片段，并在所有系统中经过了证实。 这本技术公报包含了检测组织切片和茴香霉素诱导处理的HL-60细胞的细胞凋亡的方法。测定原则 DeadEndTM Colormetric TUNEL System 采用修饰的TUNEL末端标记凋亡细胞的DNA断裂片段。 通过使用末端脱氧核苷酸转移酶、重组子（rTdT）酶，将生物素化的核苷酸结合到DNA的3-OH末端。辣根过氧化物酶（HRP）标记的链霉亲和素结合到生物素标记的核苷酸上，并使用过氧化物酶的作用底物、过氧化氢和稳定的铬精色原体二氨基联苯（DAB）进行检测。使用这种方法，凋亡细胞的细胞核被染成深棕色。2. 产物成分及贮存条件产物 反应大小 Cat#DeadEndTM Colormetric TUNEL System 40 reactions G7130包括： （辣根过氧化物酶结合的链霉亲和素）*9.6 mL Equilibration Buffer（平衡缓冲液） *40 uL Streptavidin HRP(0.5 mg/mL)*40 uL Biotinylated Nucleotide Mix(220uL) *200 uL DAB 20Chromogen（铬精色原体）(生物素标记核苷酸混合物) *200 uL DAB Substrate (底物) 20Buffer *220uL Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, *200 uL Hydrogen peroxide 20（过氧化氢）Recombinant (末端脱氧核苷酸转移酶，重组子) *40 Plastic Coverslips (塑料盖玻片) *70 mL SSC,20 *10 mg Proteinase K (蛋白酶K) 产物 反应大小 Cat#DeadEndTM Colormetric TUNEL System 20 reactions G7130包括：*4.8 mL Equilibration Buffer（平衡缓冲液） *40 uL Streptavidin HRP(0.5 mg/mL)*20uL Biotinylated Nucleotide Mix(220uL) *200 uL DAB 20Chromogen(生物素标记核苷酸混合物) *200 uL DAB Substrate (底物) 20Buffer *20uL Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, *200 uL Hydrogen peroxide 20Recombinant (末端脱氧核苷酸转移酶，重组子) *20 Plastic Coverslips (塑料盖玻片) *20 mL SSC,20 *10 mg Proteinase K (蛋白酶K)贮存条件：在-20 下贮存平衡缓冲液、rTdT酶、生物素标记核苷酸混合物和蛋白酶K。在4 下贮存Streptavidin HRP、20Buffer 的DAB底物、20过氧化氢。在室温条件下贮存20SSC和塑料盖玻片。 本系统的不同成分具有不同的贮存条件。在使用前，将系统提供的蛋白酶K在蛋白酶K缓冲液中重建。在-20 下贮存等份的重组的10mg/mL的蛋白酶K溶解液，在-20 下酶的稳定性至少能保持6个月。安全事项：平衡缓冲液包含二甲胂酸，避免接触皮肤和眼睛。当使用这种试剂时，戴上眼镜和安全手套。DAB可能是致癌物，当使用这种试剂时，戴上眼镜和安全手套。3. 测定方法3.A 方法综述在使用DeadEndTM Colormetric TUNEL System前，阅读以下材料。提供给使用者的材料：* 磷酸盐缓冲生理盐水（PBS）* 0.3% 过氧化氢用于封闭内源性的过氧化物酶* 固定剂（例如，10%的缓冲甲醛，4%多聚甲醛，4%不包含甲醇的甲醛）* 封固剂不要使用系统提供的20过氧化氢去准备用于封闭内源性过氧化物酶0.3%的过氧化氢溶解液。 培养细胞的附加材料：* 多聚-L-赖氨酸* 0.2% PBS溶解的Triton X-100* DNase-I（例如，RQ1 RNase-Free DNase,Cat#M6101）* DNase缓冲液 石蜡包埋的组织切片的附加材料：* 二甲苯或者二甲苯替代物例如Hemo-De 清除剂（Fisher Cat#15-182-507A）* 去离子水稀释的乙醇（100%，95%，85%，70%和50%）* 0.85% NaCl溶液 * 蛋白酶K缓冲液* DNase-I（例如，RQ1 RNase-Free DNase,Cat#M6101）* DNase 缓冲液组织切片和细胞培养的附加设备 *多聚-L-赖氨酸包被或者硅烷化的显微镜玻片例如，Poly-Prep 玻片（Sigma Cat#P 0425），重磨砂的玻璃玻片（Fisher Cat#12-550-15）或者其他预处理的玻片* 玻片染色缸（需要一个单独的缸用于随意的DNase-I阳性对照玻片染色）* 钳状骨针 * 微量移液器* 用于显微镜玻片的增湿箱 * 玻璃盖玻片* 37 的保温箱 * 显微镜 * 干净的指甲油和胶布3.B 组织切片中的凋亡细胞的分析步骤适用于组织切片的测定步骤需要很多方式准备，包括石蜡组织包埋的切片，冰冻切片和振动切片。对于冰冻切片和振动切片，在第4步开始。1. 将石蜡包埋切片和脱蜡组织切片（贴敷于显微镜玻片上）置于染色缸中新鲜的二甲苯，室温浸没5 min。重复1次本操作。2. 将玻片浸没在100%的乙醇中漂洗，室温5 min.3. 重复浸没在100% 乙醇中漂洗3 min，将玻片连续地浸没在不同浓度梯度的乙醇中（95%，85%，70%，50%），室温，每种3 min，以此使样品再水化。4. 室温，浸没在0.85% NaCl，5 min。5. 室温，浸没在PBS，5 min6. 固定组织切片：室温，浸没在4% 多聚甲醛或者10% 甲醛缓冲液中，15 min。7. 室温，浸没在PBS，5 min。重复1次。8. 去除组织切片的水分，并将玻片置于平面上。制备20 ug/mL的蛋白酶K：将10 mg/mL的蛋白酶K原液按1:500 的比例在PBS中稀释。取100 uL的20 ug/mL蛋白酶K加到每张玻片上，并将组织切片覆盖，室温培育玻片10-30 min。：蛋白酶K有助于组织的水分渗透，但是培育时间延长可能会使组织滑下玻片。为了获得最佳结果，需要优化培育的时间。较薄的组织切片（例如5-10 um的石蜡切片）培养时间较短，较厚的组织切片（例如50 um的振动切片）培育时间较长。9. 室温，浸没在PBS，5 min。10. 进一步固定组织切片：室温，浸没在4% 多聚甲醛或者10% 甲醛缓冲液中，5 min。11. 室温，浸没在PBS，5 min。重复1次。注意：准备阳性对照：用DNase I处理样品，从而生成DNA断裂片段。DNase的处理方法参见3.D。12. 敲击玻片以去除多余的水分。用100 uL的平衡缓冲液覆盖细胞组织。室温，平衡 5-10 min。13. 切片平衡时，在冰上解冻生物素标记的核苷酸混合物，并制备足够的rTdT 反应混合物，从而用于所有的实验组反应和对照组反应。每张玻片加100 uL的反应混合物，以足够覆盖组织切片。rTdT 反应混合物的制备细节详见表1.表 1 rTdT 反应混合物的制备缓冲液成分 每100 uL标准 反应数 组分体积 反应的体积 （实验组+阳性对照）平衡缓冲液 98 uL _ =生物素标记的 核苷酸混合物 1 uL _ =rTdT 酶 1 uL _ = 至于阴性对照：制备不含rTdT酶的培育缓冲液：98 uL平衡缓冲液，1 uL生物素标记的核苷酸混合物和1 uL高压的去离子水。通过以下14-24步骤的方法。14. 用面巾纸吸干平衡部分周围的水分，并加上100 uL的rTdI反应混合物到玻片的组织片段上。不要让切片干燥了。15. 用塑料盖玻片盖上切片，以此保证试剂的分布。37 下，在增湿箱中培育玻片60 min，以保证发生末端反应。16. 用去离子水按1:10比例稀释20SSC。去除塑料盖玻片，终止反应：室温，浸没在2SSC，15 min。注意：在稀释前，确保20SSC中的盐粒都溶解了。17. 室温下，浸没在新鲜的PBS中，5 min。重复此漂洗，2次，以去除未结合的生物素标记的核苷酸。18. 封闭内源性过氧化物酶：室温下，浸没在PBS溶解的0.3% 过氧化氢，3-5 min。：不要用系统提供的20过氧化氢，去配置封闭过氧化物酶的0.3% 的过氧化氢溶液。19. 室温，浸没在PBS，5 min。重复2次。20. 用PBS按1:500比例稀释链霉亲和素HRP。滴加100 uL此液到每张玻片，室温下培育30 min。21. 室温，浸没在PBS，5 min。重复2 次。22. 在使用前才混合DAB。加50 uL DAB Substrate 20Buffer到950 uL去离子水中，然后加50 uL DAB 20Chromogen 和50 uL 20过氧化氢。滴加100 uL DAB溶解液到每张玻片，并显色，直到有了浅棕色的背景。：保证DAB溶解液避光，并在30 min内使用。23. 用去离子水冲洗几次。24. 在含水的或者持久的封固剂中封固玻片。例如，100 % 丙三醇或者Permount封固剂（Fisher Cat.#SP-100）。对于含水的封固剂，需要用指甲油封闭盖玻片的边沿。采用光学显微镜观察染色。3.C 培养细胞细胞凋亡的检测步骤准备足够的多聚-L-赖氨酸包被的玻片，用于所有的实验组和对照组。 准备多聚-L-赖氨酸包被的玻片 用移液管将多聚-L-赖氨酸溶解液（Sigma Cat.#P8920,按1:10比例在水中稀释）加到每个经过空气粗滤器的玻璃玻片的表面。分布一薄层的多聚-L-赖氨酸溶解液覆盖整个区域，以此固定细胞。在玻片干燥后，马上在去离子水中冲洗，随后将包被的玻片风干 30-60 min。多聚-L-赖氨酸玻片在使用前能在4下贮存7天。为了能在这种玻片上生长附着细胞，要使用不含防腐剂的多聚-L-赖氨酸（Sigma Cat.#P 9155）。 玻片上细胞的准备 将离心控制和凋亡诱导的细胞在PBS中冲洗并重悬浮，然后加到多聚-L-赖氨酸包被的玻片上。在固定前，将细胞在细胞培养兜中大约风干15 min。还可以采用Lab-Tek Chamber 玻片生长附着细胞。采用下述的控制手段或者实验处理诱导细胞凋亡，用PBS漂洗玻片2次，再用下述细胞凋亡的检测方法进行检测。 细胞凋亡检测1 细胞固定：室温，浸没在4%的多聚甲醛或PBS溶解的10%的福尔马林缓冲液中， 25 min。2 漂洗玻片：室温，浸没在新鲜配置的PBS，5 min。重复1次。注：完成第2步后，4 下贮存在PBS中，或者在-20 下贮存在70%的乙醇中。3 透化处理细胞：室温，浸没于溶解在PBS的0.2% 的Triton X-100溶液中，5 min。4 漂洗玻片：室温，浸没在新鲜的PBS中，5 min。重复1次。5 接着跟着3.B 部分的12-24步骤，采用3.D部分描述的方法准备阳性对照的玻片。3.D （随机）阳性对照采用DNase 处理的步骤每个实验大多可能包括用于检测DNA断裂片段的阳性对照。对于培养的细胞，按照3.C部分的1-4步骤进行操作。在第4步后，按照如下步骤，通过使用DNase I 处理细胞制备阳性对照。注：使用DNase I处理固定的细胞，会造成染色体DNA的断裂，并暴露DNA的多聚的3-OH末端（此末端也可以可以结合生物素联接的核酸）。下述方法：使用一个单独的染色缸用于处理阳性对照玻片。阳性对照玻片上残留的DNase I可能会使实验组玻片产生较深的背景。1. 加入100 uL的DNase I缓冲液到固定的细胞玻片，室温，培育，5 min。2. 轻轻敲击，去除玻片上的水分，再加上100 uL含有5-10 unit/mL DNase I的DNase I缓冲液。 （DNase I：Cat#M6101,RQ1 RNase-free DNase；当使用其他DNase时，可能需要优化的过程）。室温，培育，10 min。3. 轻轻敲击玻片，去除多余的水分，在阳性对照专用的染色缸中装上去离子水，以此充分漂洗3-4次。4. 室温，浸没在PBS中漂洗，5 min。5. 按照3.B部分的12-24步骤，在专用的染色缸中处理阳性对照。3.E 使用茴香霉素诱导HL-60细胞凋亡的步骤 使用蛋白质中综合抑制剂-茴香霉素处理细胞，能诱导人类前髓细胞（早幼粒细胞）HL-60发生细胞凋亡。1. 在温度为37 ，湿度为5% 的CO2培养箱中，用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中培养HL-60细胞系。2. 培养调节细胞密度为5105 cells/mL，采用终浓度为2 ug/mL的茴香霉素（溶解于DMSO）处理。在温度为37 ，湿度为5% 的CO2培养箱中培育2 小时。使用等量体积的DMSO处理阴性对照细胞，并在相同条件下培养。3. 收集细胞，并用PBS重悬浮至1.5106 cells/mL，随后加一小薄层的细胞悬液到多聚-L-赖氨酸包被的玻片上。随后进行3.C部分描述的1-5步骤分析细胞凋亡。4. 故障循迹现象 原因和注解背景颜色较深（非凋亡细胞的强染色）生物素标记的核苷酸的非特异性结合。不要让细胞脱水。在 3.B部分的第17步骤，在含有0.1%的Triton X100和5 mg/mL BSA的PBS中，漂洗玻片3 次，每次5 min，随后采用一步PBS洗涤以去除非特异性结合产生的背景颜色。在制备组织的过程中，DNA发生了递减。保证组织样品被迅速固定和冷冻。总体背景颜色较深DAB溶解液培育样品的时间太长。减少DAB的染色显影时间。没有封闭内源性的过氧化物酶。增加采用0.3% 过氧化氢进行封闭的时间。染色较少或者较浅Triton X100或者蛋白酶K的与透化作用（使通透性增加）的不足。通过调节透化试剂的培育时间优化透化作用。玻片上组织切片的缺失玻片上的组织被酶消化。减少蛋白酶K的培育时间。