食品中钩吻碱和钩吻碱子的测定（征求意见稿） 编制说明

附件2 广西食品安全地方标准食品中钩吻碱和钩吻碱子的测定（征求意见稿） 编制说明目录一、工作简况3（一）任务来源与合同编号、起草单位、主要起草人3（二）简要起草过程4二、与我国、我区有关法律法规和其他标准情况的关系4三、标准制定必要性、目的及意义情况说明5四、标准的制订原则5五、各项技术内容的验证及说明61 目标化合物的物理和化学性质61.1 钩吻碱和钩吻碱子的理化性质61.2 钩吻碱和钩吻碱子的应用61.3 钩吻碱和钩吻碱子的毒理作用72 标准溶液的配制及有效期验证82.1 标准品信息82.2 标准溶液的配制82.3 标准溶液有效期验证83本标准的检测范围及本方法检测原理的说明93.1 检测范围93.2 方法检测原理94 高效液相色谱-三重四极杆串联质谱法（方法一）104.1 质谱测定条件104.2 液相测定条件124.3 前处理方法优化144.4 精密度试验154.5 基质效应考察164.6 标准曲线174.7 重复性试验184.8 回收率试验194.9 检测方法的检出限、定量限205 气相色谱-串联质法（方法二）205.1 质谱测定条件205.2 气相测定条件215.3 前处理方法优化225.4 精密度试验235.5 基质效应考察235.6 标准曲线245.7 重复性试验255.8 回收率试验275.9 检测方法的检出限、定量限276 高效液相色谱-串联高分辨质谱法（方法三）286.1 质谱测定条件286.2 液相测定条件296.3 前处理方法316.4 检测方法的灵敏度和专属性31一、工作简况（一）任务来源与合同编号、起草单位、主要起草人本检测方法标准的制订工作，是受广西壮族自治区卫生健康委员会委托，由梧州市食品药品检验所负责研制，合同编号为桂地标食2019005。标准主要起草单位为梧州市食品药品检验所。主要起草人为：罗达龙、陈学松、刘慧妍、黄蘅、叶小强、赖秀梅、王华、陈翠玲、姚泳成、钟家良，详见表1。表1 参加标准项目人员情况研制人员姓名性别年龄职称职务研究方向单位投入时间项目负责人罗达龙男36副主任药师业务科主任兼科研管科主任食品药品检验梧州市食品药品检验所整个研究过程主要参加人员陈学松男46主任药师所长食品药品检验梧州市食品药品检验所整个研究过程刘慧妍女37副主任药师食品室主任食品药品检验梧州市食品药品检验所整个研究过程黄蘅女47副主任药师副所长食品药品检验梧州市食品药品检验所整个研究过程叶小强男56副主任药师副所长食品药品检验梧州市食品药品检验所整个研究过程赖秀梅女37主管药师药品室主任食品药品检验梧州市食品药品检验所整个研究过程王华男26主管药师检验员食品药品检验梧州市食品药品检验所整个研究过程陈翠玲女32中药师检验员食品药品检验梧州市食品药品检验所整个研究过程姚泳成男28药师检验员食品药品检验梧州市食品药品检验所整个研究过程钟家良男25药师检验员食品药品检验梧州市食品药品检验所整个研究过程（二）简要起草过程梧州市食品药品检验所接受制订任务后，成立由实验室专业技术人员组成的研制小组，全面负责标准的研制计划和工作安排。主要成员由正高1人，副高4人，中级职称2人，初级职称3人，共10人组成。制订本标准主要依据中华人民共和国标准化法，GB/T 1.1-2009标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写、GB/T 27404-2008实验室质量控制规范 食品理化检测等标准或规范。制标小组为做好标准的制定工作，广泛收集国内外有关的检测技术资料、检测标准、限量指标，以及相关的法律、法规，召开了有关座谈会，听取各方建议。在研制过程中，遵循科学性、实用性和前瞻性等原则，尊重客观规律，融合科学理论和标准化方法。考虑到我国食品卫生标准分析方法应逐步与国际接轨，以及分析方法应有较强的可操作性的要求，确定了标准制定的关键环节，对本项目作了以下主要制订：（1）确定了检测项目为食品中钩吻碱和钩吻碱子的测定；（2）制定了检测方法为方法一：高效液相色谱-三重四极杆串联质谱法、方法二：气相色谱-串联质谱法、方法三：高效液相色谱-串联高分辨质谱法；（3）规定了检测对象为蜂蜜、酒类及疑似钩吻中毒的食品中钩吻碱和钩吻碱子的测定，其它基质食品可参照执行。2、 与我国、我区有关法律法规和其他标准情况的关系新制地方标准与相关法律、法规及相关标准协调一致，没有冲突。第1， 新制地方标准的检测项目为食品中钩吻碱和钩吻碱子，国内对于食品中钩吻碱类生物碱中毒的应急检测仍未有相关的技术标准和检测方法。第2， 新制地方标准的检测范围较宽。新制地方标准检测对象为蜂蜜、酒类及疑似钩吻中毒的食品中钩吻碱和钩吻碱子的测定，其它基质食品可参照执行。第三，新制地方标准的灵敏度、准确度和精密度较优。新制地方标准的灵敏度、准确度和精密度等相关指标满足国家标准GB/T 27404-2008实验室质量控制规范 食品理化检测中的规定。第四，新制地方标准采用固相萃取净化方法，运用高效液相色谱-三重四极杆串联质谱或气相色谱-串联质谱对食品中钩吻碱和钩吻碱子进行定性和定量测定，用高效液相色谱-串联高分辨质谱对食品中钩吻碱和钩吻碱子进行筛查和定性确证。 三、标准制定必要性、目的及意义情况说明钩吻碱类生物碱主要存在于马钱科植物胡蔓藤Gelsemium elegans(Gardn.et Champ.)Benth.中，习称断肠草，民间有用药史，一般用于跌打损伤，骨折，皮肤湿疹等，因其有大毒，一般外用，误服能致命。2015-2016 年梧州地区共发生2 起因误食钩吻（断肠草）引起的生物碱中毒事件，造成6人中毒1人死亡。查阅文献，报道国内广东茂名市公安局早期曾发表过钩吻碱中毒40例尸检分析的文章，文章称其中利用钩吻投毒致死15人、服钩吻自杀20人、为治病服药5人，由此可见因误食钩吻导致中毒或死亡的案例时有发生。梧州市食品药品检验所作为梧州市食品安全委员会办公室成员中唯一应急检验单位，近四年参与的辖区内应急检验，确证两例共29批样品含钩吻成分，应急处理中发现国标和地标均未有相关的食品钩吻中毒的检测标准，故很有必要在食品中毒领域上找到可行、规范、准确的质量检测技术，为食品中毒钩吻的应急处理提供一个依据和对中毒物质的定性定量做出准确的判断，由于钩吻中含有特征性成分钩吻碱和钩吻碱子，故本研究对食品中钩吻碱和钩吻碱子运用高效液相色谱-三重四极杆串联质谱或气相色谱-串联质谱对食品中钩吻碱和钩吻碱子进行定性和定量测定，并以高效液相色谱-串联高分辨质谱对疑似钩吻中毒的样品进行筛查和定性确证。建立检测法，制定明确标准，为中毒分析检验提供法定依据，为人员抢救抢占时间。为医院的后续治疗处理或中毒物质分析提供有效准确的数据支持。四、标准的制订原则本标准的制定和起草工作遵循统一性、协调性、适用性、一致性和规范性。第一，本标准为现有检测食品中钩吻碱和钩吻碱子的唯一标准。第二，方法确认和验证严谨、全面，适用性强。本标准选择了蜂蜜、酒、保健汤（保健汤为误用钩吻作为原材料加水煮熟后的汁液）作为试样进行方法确认，覆盖钩吻中毒事件中常见的食品。第三，标准按照国家标准GB/T 27404-2008实验室质量控制规范 食品理化检测中的规定，要求进行制定，具有一致性和规范性。五、各项技术内容的验证及说明1 目标化合物的物理和化学性质1.1 钩吻碱和钩吻碱子的理化性质 钩吻碱和钩吻碱子详见表1-1表1-1钩吻碱和钩吻碱子的理化性质名称钩吻碱钩吻碱子 别称钩吻素甲钩吻素子英文名称GelsemineKoumine密度1.33 g/cm31.330.1 g/cm3沸点493.4C at 760 mmHg493.4C at 760 mmHg熔点178C181-183C分子式C20H22N2O2C20H22N2O分子量322.4306.4CAS号509-15-91358-76-5精确分子量322.1681306.1732储存条件应放有毒有害保险箱常温保存应放有毒有害保险箱常温保存分子结构式1.2钩吻碱和钩吻碱子的应用1.2.1钩吻碱应用文献记载钩吻碱是治疗部分坐骨神经结扎（PSNL）小鼠的神经性疼痛和睡眠障碍的有效药物。钩吻碱（4 mg / kg）对PSNL诱导的机械异常性疼痛和热痛觉过敏产生镇痛作用。在PSNL小鼠中，钩吻碱（4mg / kg）使机械阈值增加4小时并延长热潜伏期3小时。此外，钩吻碱能增加非快速眼动（非REM，NREM）睡眠，减少觉醒，但在前3小时内不影响快速眼动（REM）睡眠在PSNL小鼠。免疫组织化学研究表明，PSNL可增加前扣带皮层神经元中c-Fos的表达，而钩吻碱（4 mg / kg）可使c-Fos表达降低58。具有兴奋中枢神经作用，由于毒性很大，很少作药用。1.2.2钩吻碱子应用 钩吻碱子是从钩吻中得到的生物碱，具有高效抗肿瘤活性，在肿瘤细胞中能够增加Bax/Bcl-2 的蛋白比例和 caspase-3 的表达。钩吻碱子具有抗焦虑、抗应激、抗银屑病和镇痛活性。在类风湿性关节炎动物模型中，钩吻碱子能够预防关节炎的发展。1.3钩吻碱和钩吻碱子的毒理作用1.3.1钩吻碱主要抑制延脑的呼吸中枢，引起呼吸中枢麻痹，呼吸衰竭而死亡，同时作用于迷走神经和心肌，引起血液循环障碍，从而加剧了肝、肾等脏器的损害。1.3.2钩吻碱子毒理作用与钩吻碱相似。1.3.3钩吻生物碱的危害钩吻常见于广东、广西、贵州等地区，由于其型与金银花相似，导致民间多见误食钩吻而导致钩吻中毒，中毒患者多见为饮用含钩吻中药材的自酿中药药酒而导致中毒，或误把钩吻当做药用食材用于烹饪方面。钩吻全株都有大毒，根、茎、枝、叶含有8种钩吻生物碱，而当中钩吻碱和钩吻碱子是毒理研究最多的成分，也是钩吻的最具代表性成分。服食钩吻碱过量，即导致消化系统、循环系统和呼吸系统的强烈反应，肠发黑粘连。中毒症状包括流涎、恶心、口渴、吞咽困难、发热、呕吐、口吐白沫、抽搐、四肢麻木、肌肉无力、肌肉纤维颤动、舌硬、言语不清、烦躁不安、心律失常等。1.3.4 钩吻的小鼠半数致死量洪息君、陆文光等在断肠草不同部位毒性的研究中指出用钩吻植物的不同部位以1:10的煎剂来测定小鼠的半数致死量（LD50）植物中各部位的LD50分别为：钩吻根0.0798g /kg，老茎1.309 g/kg，嫩茎1.830 g/kg，叶0.255 g/kg，花0.458 g/kg，果实1.275 g/kg。据相关文献报道钩吻根3g左右或嫩芽7个，或流浸膏3.5mL，或钩吻碱0.150.3g经口摄入可使人致死。钩吻碱摄入量在0.150.3g，人体即有中毒迹象。张永志、何宏源等在钩吻素甲对小鼠的急性毒性实验研究中指出使用钩吻碱灌胃的小鼠30分钟内半数致死浓度为78.23mg/kg，95%置信区间69.7587.75mg/kg，而使用51.2mg/kg浓度灌胃的小鼠30分钟内小鼠无死亡，并且较低浓度的钩吻碱子（10mg/kg）亦对小鼠具有抗焦虑的治疗作用，说明低剂量的钩吻碱与钩吻碱子对机体基本无毒性影响。 2 标准溶液的配制及有效期验证2.1 标准品信息钩吻碱和钩吻碱子标准品均购自中国广州分析测试中心，详见表2-1 表2-1 钩吻碱、钩吻碱子标准品信息名称别称货号状态纯度剂型剂量生产单位钩吻碱钩吻素甲NACC60513粉末98%20mg/瓶中国广州分析测试中心钩吻碱子钩吻素子NACC60512粉末98%20mg/瓶中国广州分析测试中心2.2 标准溶液的配制2.2.1标准储备液（1mg/mL）分别精密称取钩吻碱、钩吻碱子标准品各10 mg，用甲醇溶解并稀释至10mL，摇匀，制成浓度为1mg/mL标准储备液。-20 避光贮存，有效期6个月。2.2.2混合标准中间工作溶液（1 g/mL）分别准确吸取标准储备液（1mg/mL）（2.2.1）各0.10 mL，用甲醇稀释至100mL，摇匀，制成1 g/mL的混合标准中间工作液。2.2.3混合标准工作溶液分别准确吸取混合标准中间工作液（1 g/mL）（2.2.2）适量，用甲醇稀释，摇匀，作为系列混合标准工作溶液，各化合物浓度依次为1 g/L200 g/L，临用新制或依仪器响应情况配制适当浓度的混合标准工作溶液。2.3 标准溶液有效期验证分别取适量标准品粉末（对照组）、储存时间为1个月的标准储备液（含单标和混标）和储存时间为6个月的标准储备液（含单标和混标），分别按“2.2”的方法配制成10g/L标准工作液，每个组设置3个平行。在相同条件下同时进样检测，每组单标和每组混标均检测钩吻碱、钩吻碱子。分析比较不同储存时间的每种单标同时检测两种化合物的峰面积结果。该结果提示钩吻碱、钩吻碱子在正常储存条件下稳定，配制成混合标准溶液不影响定量。分析比较不同储存时间的标准混合液检测两种化合物的峰面积结果，详见表2-2，存储1个月和6个月的各个化合物的峰面积与对照组的峰面积比较，均没有显著性差异（p 0.05）。结果表明钩吻碱、钩吻碱子可以稳定储存于甲醇等介质中，高浓度的储备液有效期至少为6个月，标准中间液有效期至少为1个月。表2-2 不同储存时间的标准混合液检测结果储存时间对照组1个月6个月化合物名称Area 1Area 2Area 3Area 1Area 2Area 3P值Area 1Area 2Area 3P值钩吻碱2878929547312013100131520304110.2213014129898301120.789钩吻碱子3025931544322113044329201319850.4662921029985321440.4433本标准的检测范围及本方法检测原理的说明3.1 检测范围3.1.1 酒基质和保健汤基质的选取2015年，在梧州地区发生一起农民工中毒事件，通过检测现场收集疑似引起中毒材料，包括钩吻植物、钩吻植物泡制的酒、以及中毒时农民工所饮用的用钩吻作为食材煮的“保健汤”，最终确认为钩吻中毒，据相关人员反馈，农民工在山上采集的“钩吻”植物误认为鸡血藤，继而通过泡酒，煲汤，以想达到活血补血，舒筋活络等功效，但由于植物鉴定知识和技能限制，误认植物而引起了食物中毒。而钩吻最长用的误服途径为泡酒和煲汤，所以本标准选取了酒基质和保健汤基质为主要研究对象。3.1.2 蜂蜜基质的选取2016年，在梧州地区也发生一起食品中毒事件，经过检测与有关部门的调查，其中毒样品为野生蜂蜜，蜜蜂经采集蜂巢附近的钩吻花蜜回巢形成了有毒蜂蜜，从而引起采集野生蜂蜜中毒事件，故本标准也选取了蜂蜜基质作为主要研究对象。由于近年来，我们接收到的案件样品有蜂蜜基质、酒基质和保健汤基质等。规定了检测对象为蜂蜜、酒类及疑似钩吻中毒的食品中钩吻碱和钩吻碱子的测定，其它基质食品可参照执行。3.2 方法检测原理由于钩吻含钩吻碱、钩吻碱子等生物碱，其可在酸性条件下形成非离子状态，更容易溶解于水中，继而经过与强阳离子交换反相吸附剂固相萃取柱的作用吸附，用水与有机相淋洗除去杂质后，用碱性溶液洗脱，收集洗脱液，达到净化的作用。由于高效液相色谱-三重四极杆串联质谱和气相色谱-串联质谱为实验室常配仪器，故本标准还采用了高效液相色谱-三重四极杆串联质谱和气相色谱-串联质谱分别作为方法一和方法二使用，根据欧盟委员会2002/ 657/ EC 决议的“四分法原则”，高效液相色谱-三重四极杆串联质谱法选取一个母离子和两个子离子可得到较好的定性，气相色谱-串联质谱法选取四个特征离子也可得到较好的定性，同时该两个方法也是常用的定量方法，经方法适用性考察后，两个方法的定性与定量效果也能满足日常使用要求，且两个方法的检出限与定量限设定远低于钩吻碱和钩吻碱子的经口摄入中毒剂量，能满足食品中钩吻碱和钩吻碱子的常量与痕量分析。由于高效液相色谱-串联高分辨质谱可得到目标物的准确分子量，根据欧盟委员会2002/ 657/ EC 决议的“四分法原则”，只需有2个准确分子匹配，即可快速、准确的定性，故本标准方法三仅作为定性方法。经优化，本标准选用试样经1%盐酸超声提取，经MCX柱净化后，运用高效液相色谱-三重四极杆串联质谱或气相色谱-串联质谱对食品中钩吻碱和钩吻碱子进行定性和定量测定，用高效液相色谱-串联高分辨质谱对食品中钩吻碱和钩吻碱子进行筛查和定性确证。4 高效液相色谱-三重四极杆串联质谱法（方法一）4.1 质谱测定条件本试验使用质谱仪为Agilent QQQ-6490仪器购于安捷伦科技有限公司。用溶剂50%甲醇水（含0.1%甲酸）分别配制钩吻碱、钩吻碱子，浓度分别为1g/mL。在仪器调谐通过后分别对上述两个物质进行全扫描，得到全扫描一级质谱数据后再进行二级质谱数据采集，对所得到的子离子的质谱参数进行逐个优化，最终仪器参数如下：离子源为ESI源，MRM正离子模式；毛细管电压3000V；离子源温度150；干燥气流量15L/min；雾化气压力25Psi；鞘气温度350；鞘气（N2）流量12L/min。化合物质谱参数详见表4-1，二级质谱图见图4-24-3。表4-1化合物名称、分子式、母离子、子离子、碎裂电压、碰撞电压序号化合物名称分子式母离子(m/z)子离子(m/z)碎裂电压/V碰撞能量/V1钩吻碱C20H22N2O2323.170.0a/236.138035/252钩吻碱子C20H22N2O307.2220.1a/180.038035/40注：a为定量离子图4-2钩吻碱二级质谱图图4-3钩吻碱子二级质谱图4.2 液相测定条件4.2.1色谱柱条件色谱柱：ACE UltraCore 2.5m C18 2.1x75 mm；柱温: 35。4.2.2 流动相选择本试验使用液相色谱仪为Agilent LC-1290仪器购于安捷伦科技有限公司。使用溶剂50%甲醇水（含0.1%甲酸）配制100 ng/mL和1000 ng/mL标准混合溶液，每个浓度设置6平行（进样量0.5 L）。在液相色谱仪上以乙腈为有机相，0.1%甲酸水溶液为水相，泵系统自动灌注10 min，初始流动相平衡30 min后进样。待进样完毕后，以100%乙腈冲洗柱子30 min，然后更换0.1%甲酸水溶液（含5mmol/L甲酸铵）为水相，泵系统自动灌注10 min，初始流动相平衡30 min后重复进样。比较分析乙腈+0.1%甲酸水溶液和乙腈+0.1%甲酸水溶液（含5mmol/L甲酸铵）两组流动相下各检测项目的峰面积，结果以乙腈+0.1%甲酸水溶液（含5mmol/L甲酸铵）作为流动相时钩吻碱的峰面积明显高于乙腈+0.1%甲酸水溶液组，而钩吻碱子无明显差异，因此本检测方法选择乙腈+0.1%甲酸水溶液（含5mmol/L甲酸铵）作为流动相。4.2.3洗脱程序优化以乙腈为有机相（A），以0.1%甲酸水溶液（含5mmol/L甲酸铵）为水相（B）。经过优化的最终流动相洗脱程序详见表4-4，0 min有机相为5%，为初平衡；01.00 min有机相由5%升至10%，1.001.50 min有机相由10%升至35%，1.502.50 min有机相由35%升至90%为分离阶段；2.503.00 min有机相升到95%，为冲洗阶段；3.015.50 min有机相降至5%；为后平衡。在该条件下各物质的峰形对称、锐利，能完全分离，保留时间落在2.02.3 min，详见图4-54-7。表4-4 梯度洗脱程序表梯度时间/min流动相A/%流动相B/%0.005951.0010901.5035652.5090103.009553.015955.50595图4-5钩吻碱提取离子色谱图 图4-6钩吻碱子提取离子色谱图 图4-7钩吻碱、钩吻碱子提取离子色谱叠加图4.3 前处理方法优化4.3.1提取液优化 我们对比了纯化水、0.5%盐酸水溶液、1%盐酸水溶液、1.5%盐酸水溶液和2%盐酸水溶液对同一株钩吻茎的粉碎样进行钩吻碱和钩吻碱子碱同步提取、稀释后，通过比较在高效液相色谱-三重四极杆串联质谱上测得的响应值来对比提取效率，由于钩吻碱和钩吻碱子均为生物碱物质，在酸性溶液提取下物质转为非离子化状态，使其在水中不易解离，提高了其溶解性。本试验结果表明用1%盐酸水溶液提取的钩吻碱和钩吻碱子响应最高，故选用1%盐酸水溶液作为提取溶剂。不同溶剂提取下的响应值详见表4-8。表4-8不同溶剂提取下的响应值溶剂钩吻碱响应值钩吻碱子响应值纯化水110650135230.5%盐酸水溶液200650208991%盐酸水溶液277056315691.5%盐酸水溶液266044305472%盐酸水溶液26694530449 4.3.2净化方法优化我们对比了1%盐酸水直接提取样品（无净化）、经MCX固相萃取柱净化和C18固相萃取柱净化后的样品。结果显示，在1%盐酸水直接提取的基础上通过MCX固相萃取柱将生物碱成分富集后再净化的效果非常明显，C18固相萃取柱使生物碱损失量较大，生物碱含量明显低于用MCX净化的样品；而1%盐酸水直接提取样品（无净化），则干扰物质较多，且酸水作为提取溶剂对气相用毛细管色谱柱损伤较大，因此不宜采用。本实验最后采用MCX固相萃取柱作为净化方式。MCX固相萃取柱以混合型强阳离子交换反相吸附剂为基础，由PLS吸附剂键合磺酸基团得到，兼具阳离子交换和反相两种保留模式，适用于其共轭酸的pKa值处于210之间的碱性化合物。其保留机理以强阳离子交换相互作用和非极性相互作用为主，极性相互作用为次。适用于碱性化合物萃取。通过把待测物富集在MCX柱上，用水、甲醇淋洗除去除去试样中的糖和酯类等非极性干扰物，用碱性溶液洗脱收集，浓缩后溶解上机测定，最终优化的前处理方法如下： 对无结晶的蜂蜜样品，将其搅拌均匀。对有结晶的样品，在密闭情况下，置于不超过 60的水浴中温热，振荡，待样品全部融化后搅匀，迅速冷却至室温，分出0.5kg作为试样置于样品瓶中，密封，并标明标记，室温保存，待用。保健汤样品应将汤与汤渣混合均匀后作为试样。制备均匀的试样应置于样品瓶中，密封，并标明标记，置于28保存，待用。 称取1g（精确至0.01g）制备均匀的样品置于100mL一次性离心管中，加入1%盐酸水溶液至50mL，涡旋振荡2min后超声处理（100 W，40 kHz）30分钟，3000r/mim离心5分钟，吸取上清液5.00mL到已活化的Creole MCX柱（MCX柱依次用甲醇3mL、水3mL活化），依次用水5mL、甲醇5mL淋洗，弃去全部流出液，抽干MCX柱，用5%氨化甲醇5mL洗脱，收集洗脱液，并于40氮吹至干，加入溶剂50%甲醇水（含0.1%甲酸）1.00mL溶解残渣，过0.22m有机滤膜，备用。或根据实际浓度适当稀释，备用。MCX填料结构详见图4-9。图 4-9 MCX填料图4.4 精密度试验钩吻碱在2870g/kg、钩吻碱子在2050g/kg（蜂蜜基质、酒基质、保健汤基质）低、中、高3个加标浓度，连续进样6针，计算其相对标准偏差，钩吻碱的蜂蜜基质相对标准偏差为0.9%3.0%，酒基质的相对标准偏差为0.6%2.5%，保健汤基质的相对标准偏差为1.0%2.5%；钩吻碱子的蜂蜜基质相对标准偏差为0.8%2.7%，酒基质的相对标准偏差为0.7%2.2%，保健汤基质的相对标准偏差为1.5%3.2%。该试验中3种基质的精密度试验RSD均小于5%，说明仪器精密度良好。结果详见表4-10。表4-10高效液相色谱-三重四极杆串联质谱法精密度试验基质类型蜂蜜酒 保健汤*物质种类添加浓度/（g/kg）相对标准偏差(RSD)相对标准偏差(RSD)相对标准偏差(RSD)钩吻碱283.0%2.5%2.5%562.7%1.1%2.0%700.9%0.6%1.0%钩吻碱子202.7%2.2%3.2%402.5%1.0%1.7%500.8%0.7%1.5%*保健汤为误用钩吻作为原材料加水煮熟后的汁液。4.5 基质效应考察基质效应(matrix effect，ME)是指在样品测试过程中，目标化合物以外的其他物质直接或间接影响质谱检测的现象。目前一般采用空白样品前处理净化后添加标准品的方法来评价基质效应。当ME10，提示基质效应较小，可用溶剂标准曲线进行定量；当10 50，提示基质效应很强，严重影响定量，需要重新优化样品前处理方法。将空白基质试样按标准前处理方法进行提取、净化后获得空白基质提取液，分别使用空白基质提取液和50%甲醇水（含0.1%甲酸）溶剂将钩吻碱和钩吻碱子配制为浓度2 ng/mL、8ng/mL、20ng/mL的基质标准溶液和溶剂标准溶液；进行检测，计算基质效应，结果都在95%105%范围内，说明经本方法提取和净化后，基质效应不明显，故标准曲线用50%甲醇水（含0.1%甲酸）溶剂配制标准系列浓度也适用于本标准的检测。考察结果详见表4-11。表4-11基质效应考察结果基质类型蜂蜜酒 保健汤*项目添加浓度(ng/mL)S+空白基质/S /%S+空白基质/S /%S+空白基质/S /%钩吻碱2101.799.798.7899.698.697.510102.398.799.6钩吻碱子2104.7102.399.28101.4101.6101.510102.6100.7100.6*保健汤为误用钩吻作为原材料加水煮熟后的汁液。4.6 标准曲线钩吻碱标准品溶液工作曲线在14g/kg284g/kg（浓度为1.4ng/mL28.4ng/mL）线性关系良好，线性方程y=5116.072769x-1015.616631，相关系数R=0.999；钩吻碱子标准品溶液工作曲线在10g/kg200g/kg（浓度为1.0ng/mL20.0ng/mL）线性关系良好，线性方程y=644.826518x- 56.355908，相关系数R=0.999，详见图4-12，图4-13。 图4-12钩吻碱标准工作曲线图4-13钩吻碱子标准工作曲线4.7重复性试验分别称取三种基质各5份1.00g样品置于离心管中，分别加入标准液使钩吻碱含量为280g/kg，钩吻碱子含量为200g/kg。按4.3.2前处理方法，提取，净化并检测。结果蜂蜜基质中钩吻碱的相对标准偏差为1.8%，酒基质中钩吻碱的相对标准偏差为2.9%，保健汤基质中钩吻碱的相对标准偏差为2.2%；蜂蜜基质中钩吻碱子的相对标准偏差为3.2%，酒基质中钩吻碱子的相对标准偏差为2.8%，保健汤基质中钩吻碱子的相对标准偏差为2.2%。该试验中3种基质的重复性试验RSD均小于5%，说明方法重现性良好。详见表4-14。表4-14重复性试验结果蜂蜜基质名称CF1CF2CF3CF4CF5取样量m/g1.001.001.001.001.00钩吻碱检出量/(g/kg)检出量/(g/kg)检出量/(g/kg)检出量/(g/kg)检出量/(g/kg)265260259270266RSD/%1.8钩吻碱子检出量/(g/kg)检出量/(g/kg)检出量/(g/kg)检出量/(g/kg)检出量/(g/kg)190188185196200RSD/%3.2酒基质名称CF1CF2CF3CF4CF5取样量m/g1.001.001.001.001.00钩吻碱检出量/(g/kg)检出量/(g/kg)检出量/(g/kg)检出量/(g/kg)检出量/(g/kg)258276 269 262 273 RSD/%2.9钩吻碱子检出量/(g/kg)检出量/(g/kg)检出量/(g/kg)检出量/(g/kg)检出量/(g/kg)201 198 203 209 194 RSD/%2.8保健汤基质（保健汤为误用钩吻作为原材料加水煮熟后的汁液）名称CF1CF2CF3CF4CF5取样量m/g1.001.001.001.001.00钩吻碱检出量/(g/kg)检出量/(g/kg)检出量/(g/kg)检出量/(g/kg)检出量/(g/kg)259269272282277RSD/%3.2钩吻碱子检出量/(g/kg)检出量/(g/kg)检出量/(g/kg)检出量/(g/kg)检出量/(g/kg)210 210 208 200 204 RSD/%2.24.8 回收率试验钩吻碱在28280g/kg、钩吻碱子在20200g/kg（蜂蜜基质、酒基质、保健汤基质）低、中、高3个加标浓度回收率详见下表4-15，该试验中3种基质的回收率试验RSD均小于5%，说明方法准确度高。表4-15 钩吻碱、钩吻碱子在不同基质中的回收率基质类型蜂蜜酒 保健汤*物质种类添加浓度/（g/kg）回收率相对标准偏差(RSD)回收率相对标准偏差(RSD)回收率相对标准偏差(RSD)钩吻碱2889.3%95.9%2.0%3.9%90.3%95.0%1.3%2.9%89.6%93.0%2.5%3.6%5691.0%96.1%2.0%3.4%94.1%98.1%1.1%2.4%90.2%96.0%2.3%3.4%28092.3%98.1%2.0%2.9%96.2%98.1%1.0%2.0%91.6%98.1%2.1%2.8%钩吻碱子2086.2%91.2%2.2%4.0%89.9%95.1%1.1%3.0%85.9%92.1%1.7%3.8%4088.2%93.2%2.2%3.5%90.2%96.2%1.2%2.8%88.2%94.1%1.6%2.9%20089.6%95.1%2.1%2.8%91.0%97.3%1.1%2.2%90.0%95.4%1.7%2.1%*保健汤为误用钩吻作为原材料加水煮熟后的汁液。4.9 检测方法的检出限、定量限以加标试验来进行方法灵敏度的确定。以钩吻碱、钩吻碱子定性离子信噪比3来确定检出限，经试验钩吻碱检出浓度可做到0.28ng/mL（2.8g/kg），钩吻碱子检出浓度可做到0.2ng/mL（2g/kg）。以钩吻碱、钩吻碱子定量离子信噪比10来确定定量限，经试验钩吻碱检出浓度可做到0.56ng/mL（5.6g/kg），钩吻碱子检出浓度可做到0.4ng/mL（4g/kg）。由于考虑各执行单位仪器灵敏度的差异以及钩吻碱和钩吻碱子为常量检测指标，经口摄入引起中毒量为毫克级，最终确定当称样量为1 g（精确至0.01g），稀释倍数为10时，本方法中钩吻碱检出限为14g/kg，钩吻碱子检出限为10g/kg，钩吻碱定量限为28g/kg，钩吻碱子定量限为20g/kg。详见下表4-16。表4-16 钩吻碱、钩吻碱子在食品中的检出限、定量限序号化合物名称检出限（g/kg）定量限（g/kg）1钩吻碱14282钩吻碱子10205 气相色谱-串联质法（方法二）5.1 质谱测定条件本试验使用质谱仪为Agilent 7000C仪器购于安捷伦科技有限公司。用溶剂甲醇分别配制钩吻碱、钩吻碱子，浓度分别为1g/mL。在仪器调谐通过后分别对上述两个物质在EI源70 eV轰击下进行全扫描记录所产生的子离子，最终优化得到的仪器参数如下：离子源电子轰击源(EI) 70 eV；离子源温度230 ；接口温度280 ；四极杆温度150 ； 全扫描（SCAN）质量范围40-350 amu；详见表5-1，图5-2。接口温度需保证目标物完全汽化到质谱端，故选用280，而质谱扫描范围需尽可能包含两个目标物的碎片离子分子量，低质量端从40amu开始可避免采集如氧气、氮气等空气干扰，高质量端截止至350amu可包含了钩吻碱的分子离子322amu。表5-1 化合物名称、分子式、定量离子、定性离子序号化合物名称分子式定量离子 （m/z）定性离子 （m/z）1钩吻碱C20H22N2O2322.0279.0，251.0，108.02钩吻碱子C20H22N2O306.0263.0，223.0，70.0 图5-2钩吻碱、钩吻碱子全扫描图5.2 气相测定条件图5-3钩吻碱子提取离子色谱图本试验使用气相色谱仪Agilent GC 7890B仪器购于安捷伦科技有限公司。用HP-5MS 0.25 mm30 m0.25 m 色谱柱在作为分离色谱柱通过调节气相色谱条件使钩吻碱和钩吻碱子达到完全分离，最终仪器参数如下：色谱柱HP-5MS 0.25 mm30 m0.25 m；载气高纯氦气；进样口温度280；进样量1.0L不分流进样；程序升温(初始温度为150 ，保持2 min，然后15min-1升至280 ，保持4 min)，详见图5-35-5。图5-4钩吻碱提取离子色谱图图5-5钩吻碱、钩吻碱子提取离子色谱叠加图5.3 前处理方法优化考虑到含水的溶剂汽化后会体积膨胀引起过载，容易造成反冲，以致目标物损失，另外含水的溶剂也容易造成非极性色谱柱（HP-5）的损害，故在方法气相色谱-串联质法中最后的定容溶剂选择用甲醇替代50%甲醇水溶液（含0.1%甲酸），最终前处理方法为： 对无结晶的蜂蜜样品，将其搅拌均匀。对有结晶的样品，在密闭情况下，置于不超过 60的水浴中温热，振荡，待样品全部融化后搅匀，迅速冷却至室温，分出0.5kg作为试样置于样品瓶中，密封，并标明标记，室温保存，待用。保健汤样品应将汤与汤渣混合均匀后作为试样。制备均匀的试样应置于样品瓶中，密封，并标明标记，置于28保存，待用。 称取1g（精确至0.01g）样品置于100mL一次性离心管中，加入1%盐酸水溶液至50mL，涡旋振荡2min后超声处理（100 W，40 kHz）30分钟，3000r/mim离心5分钟，吸取上清液5.00mL到已活化的Creole MCX柱（MCX柱依次用甲醇3mL、水3mL活化），依次用水5mL、甲醇5mL淋洗，弃去全部流出液，抽干MCX柱，用5%氨化甲醇5mL洗脱，收集洗脱液，并于40氮吹至干，加入溶剂甲醇1.00mL溶解残渣，过0.22m有机滤膜，备用。或根据实际浓度适当稀释，备用。5.4 精密度试验钩吻碱在140350g/kg、钩吻碱子在100250g/kg（蜂蜜基质、酒基质、保健汤基质）低、中、高3个加标浓度，连续进样6针，计算其相对标准偏差，钩吻碱的蜂蜜基质相对标准偏差为1.9%3.7%，酒基质的相对标准偏差为1.7%3.1%，保健汤基质的相对标准偏差为1.9%2.9%；钩吻碱子的蜂蜜基质相对标准偏差为1.6%3.8%，酒基质的相对标准偏差为1.0%2.2%，保健汤基质的相对标准偏差为1.9%3.1%。详见表5-6。表5-6气相色谱-串联质法精密度试验基质类型蜂蜜酒 保健汤*物质种类添加浓度/（g/kg）相对标准偏差(RSD)相对标准偏差(RSD)相对标准偏差(RSD)钩吻碱1403.2%2.5%2.9%2803.7%3.1%2.4%3501.9%1.7%1.9%钩吻碱子1003.8%2.2%2.8%2003.5%1.0%3.1%2501.6%1.8%1.9%*保健汤为误用钩吻作为原材料加水煮熟后的汁液。5.5 基质效应考察基质效应(matrix effect，ME)是指在样品测试过程中，目标化合物以外的其他物质直接或间接影响质谱检测的现象。目前一般采用空白样品前处理净化后添加标准品的方法来评价基质效应。当ME10，提示基质效应较小，可用溶剂标准曲线进行定量；当10 50，提示基质效应很强，严重影响定量，需要重新优化样品前处理方法。将空白基质试样按标准前处理方法进行提取、净化后获得空白提取液，分别使用空白基质提取液和50%甲醇水（含0.1%甲酸）溶剂将钩吻碱和钩吻碱子配制为浓度5 ng/mL、20 ng/mL、25 ng/mL的基质标准溶液和溶剂标准溶液；进行检测，计算基质效应，结果都在95%105%范围内，说明经本方法提取和净化后，基质效应不明显，故标准曲线用50%甲醇水（含0.1%甲酸）溶剂配制标准系列浓度也适用于本标准的检测。考察结果详见表5-7。表5-7基质效应考察结果基质类型蜂蜜酒 保健汤*项目添加浓度(ng/mL)S+空白基质/S /%S+空白基质/S /%S+空白基质/S /%钩吻碱5103.7102.4103.320100.2102.1102.52598.699.4100.6钩吻碱子5103.4102.4101.620100.5100.3101.12599.498.697.3*保健汤为误用钩吻作为原材料加水煮熟后的汁液。5.6 标准曲线钩吻碱标准品溶液工作曲线在142g/kg2842g/kg（浓度为14.2ng/mL284.2ng/mL）线性关系良好，线性方程y=1527.868234x+42475.917066，相关系数R=0.999；钩吻碱子标准品溶液工作曲线在101g/kg2018g/kg（浓度为10.1ng/mL201.8ng/mL）线性关系良好，线性方程y=3138.588520x- 2940.386876，相关系数R=0.999，详见图5-8，图5-9。图5-8钩吻碱标准工作曲线图5-9钩吻碱子标准工作曲线5.7 重复性试验分别称取三种基质各5份1.00g样品置于离心管中，分别加入标准液使钩吻碱含量为284g/kg，钩吻碱子含量为201.6g/kg。按5.3前处理方法，提取，净化并检测。结果蜂蜜基质中钩吻碱的相对标准偏差为2.3%，酒基质中钩吻碱的相对标准偏差为1.6%，保健汤基质中钩吻碱的相对标准偏差为2.9%；蜂蜜基质中钩吻碱子的相对标准偏差为2.9%，酒基质中钩吻碱子的相对标准偏差为2.2%，保健汤基质中钩吻碱子的相对标准偏差为2.5%，详见表5-10。表5-10重复性试验结果蜂蜜基质名称CF1CF2CF3CF4CF5取样量m/g1.001.001.001.001.00钩吻碱检出量/(g/kg)检出量/(g/kg)检出量/(g/kg)检出量/(g/kg)检出量/(g/kg)273268284278280RSD/%2.3钩吻碱子检出量/(g/kg)检出量/(g/kg)检出量/(g/kg)检出量/(g/kg)检出量/(g/kg)203206205192198RSD/%2.9酒基质名称CF1CF2CF3CF4CF5取样量m/g1.001.001.001.001.00钩吻碱检出量/(g/kg)检出量/(g/kg)检出量/(g/kg)检出量/(g/kg)检出量/(g/kg)276280282280288RSD/%1.6钩吻碱子检出量/(g/kg)检出量/(g/kg)检出量/(g/kg)检出量/(g/kg)检出量/(g/kg)208 204 209 198 207 RSD/%2.2保健汤基质（保健汤为误用钩吻作为原材料加水煮熟后的汁液）名称CF1CF2CF3CF4CF5取样量m/g1.001.001.001.001.00钩吻碱检出量/(g/kg)检出量/(g/kg)检出量/(g/kg)检出量/(g/kg)检出量/(g/kg)279 271 285 287 292 RSD/%2.9钩吻碱子检出量/(g/kg)检出量/(g/kg)检出量/(g/kg)检出量/(g/kg)检出量/(g/kg)203 198195 199208 RSD/%2.55.8 回收率试验钩吻碱在2802800g/kg、钩吻碱子在2002000g/kg（蜂蜜基质、酒基质、保健汤基质）低、中、高3个加标浓度回收率详见下表5-11，该试验中3种基质的回收率试验RSD均小于5%，说明方法准确度高。表5-11 钩吻碱、钩吻碱子在不同基质中的回收率基质类型蜂蜜酒保健汤*物质种类添加浓度/（g/kg）回收率相对标准偏差(RSD)回收率相对标准偏差(RSD)回收率相对标准偏差(RSD)钩吻碱28084.3%90.9%2.0%4.2%85.3%91.2%2.0%3.5%83.9%91.2%2.7%3.8%56086.2%90.7%2.0%3.4%88.2%92.1%1.8%3.0%85.2%91.6%2.5%3.4%280090.2%93.6%2.0%3.0%89.8%93.9%1.9%2.6%88.5%93.1%2.1%2.9%钩吻碱子20084.2%89.6%2.1%4.2%86.9%90.2%1.6%3.2%85.9%91.1%1.9%3.9%40086.3%91.2%2.3%3.7%87.2%91.3%1.5%2.9%87.3%92.2%1.8%3.5%200088.5%92.1%2.1%2.9%89.0%92.3%1.13%2.8%89.7%92.3%1.7%2.9%*保健汤为误用钩吻作为原材料加水煮熟后的汁液。5.9 检测方法的检出限、定量限以加标试验来进行方法灵敏度的确定。以钩吻碱、钩吻碱子定性离子信噪比3来确定检出限，经试验钩吻碱检出浓度可做到2.8ng/mL（28g/kg），钩吻碱子检出浓度可做到2.0ng/mL（20g/kg）。以钩吻碱、钩吻碱子定量离子信噪比10来确定定量限，经试验钩吻碱定量浓度可做到5.6ng/mL（56g/kg），钩吻碱子定量浓度可做到4.0ng/mL（40g/kg），由于考虑各执行单位仪器灵敏度的差异以及钩吻碱和钩吻碱子为常量检测指标，经口摄入引起中毒量为毫克级，最终确定当称样量为1 g（精确至0.01g），稀释倍数为10时，本方法中钩吻碱检出限为140g/kg，钩吻碱子检出限为100g/kg，钩吻碱定量限为280g/kg，钩吻碱子定量限为200g/kg。详见表5-12。表5-12 钩吻碱、