植物次生代谢产物生物碱的测定 液相色谱质谱法征求意见稿.doc

ICS 01.040.11中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准GB/T XXXXXXXX植物次生代谢产物生物碱测定液相色谱质谱法 Determination of 11 alkaloids in biological human samples点击此处添加与国际标准一致性程度的标识（征求意见稿）XXXX - XX - XX发布 XXXX - XX - XX实施GB/T XXXXX2017I前 言本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。本标准由中国标准化研究院提出并归口。本标准起草单位： 本标准主要起草人： GB/T XXXXX20171植物次生代谢产物生物碱测定液相色谱质谱法1 范围本标准规定了植物组织、动物组织、体液（血液、尿液）中东莨菪碱、番木鳖碱、乌头碱、次乌头碱、新乌头碱、秋水仙碱、阿托品、士的宁、喜树碱、毛果芸香碱、鬼臼毒素含量的液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）测定方法的试验方法、结果计算、回收率与精密度、允许差等内容。本标准适用于植物组织、动物组织、体液（血液、尿液）中东莨菪碱、番木鳖碱、乌头碱、次乌头碱、新乌头碱、秋水仙碱、阿托品、士的宁、喜树碱、毛果芸香碱、鬼臼毒素含量的测定。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法3试验方法样品经提取液超声提取、离心后，用液相色谱串联质谱法测定和确证，外标法定量。4 试剂和材料除非另有说明，所有试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的一级水。4.1 甲醇：色谱纯。4.2 乙腈：色谱纯。4.3 10%乙腈溶液：10mL 乙腈+90mL 去离子水，混匀。4.4 甲酸：色谱纯。4.5 0.1%甲酸水溶液：准确移取甲酸（ 4.4）1.0mL 置于 1L 容量瓶中，用水定容至刻度。4.6 1%甲酸的乙腈溶液：1mL 甲酸（4.4）+ 99 mL 乙腈（4.2），混匀。4.7 无水硫酸镁：分析纯。4.8 乙酸铵：色谱纯。4.9 氨水：色谱纯。4.10 100mM 乙酸铵溶液：称取乙酸铵（ 4.8）3.854g，用去离子水溶解，定容至 500mL。4.11 乙酸铵-氨水缓冲液（pH9）：取 100mL 100mM 乙酸铵溶液（4.10），用氨水（4.9)调 pH 值到90.5。4.12 标准物质：东莨菪碱、番木鳖碱、乌头碱、次乌头碱、新乌头碱、秋水仙碱、阿托品、士的宁、喜树碱、毛果芸香碱、鬼臼毒素的中文名称、英文名称、CAS 号、分子式、相对分子质量及结构式参见附录 A 表 A.1，纯度均不小于 96%。GB/T XXXXX201724.13 混合标准储备溶液：准确称取适量各标准物质（4.12）分别置于 50mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成浓度为 100mg/L 的标准储备溶液（于 4避光保存，有效期 2 个月）。分别准确移取东莨菪碱、番木鳖碱、乌头碱、次乌头碱、新乌头碱、秋水仙碱、阿托品、士的宁、喜树碱、毛果芸香碱、鬼臼毒素标准储备溶液 1mL 于 100 mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成东莨菪碱、番木鳖碱、乌头碱、次乌头碱、新乌头碱、秋水仙碱、阿托品、士的宁、喜树碱、毛果芸香碱、鬼臼毒素浓度为 1mg/L 的混合标准储备溶液，于 4避光保存，可使用一周。4.14 微孔滤膜：0.22 m，有机相。5 仪器和设备5.1 液相色谱-串联质谱仪（LC-MS/MS）：配有电喷雾离子源（ESI）。5.2 电子天平：感量为 0.0001g 和 0.01g。5.3 离心机：转速不低于 9500r/min。5.4 超声波清洗仪。5.5 氮吹仪：带水浴，温度可调。5.6 涡旋混合器。5.7 粉碎机。5.8 离心管：10mL。5.9 离心管：50mL。6 分析步骤6.1 试样制备植物组织、动物组织样品用粉碎机粉碎均匀。6.2 试样提取6.2.1 植物组织、动物组织称取植物组织样品 1g（精确至 0.001g）于 50mL 离心管中，加入 5mL 去离子水，涡旋混合2min，加入 10mL 乙腈（4.2 ），涡旋混合 1min，超声辅助提取 10min，加入 4g 无水硫酸镁（4.7），迅速振摇 1min，9500 rpm 离心 5min。取上清液 5mL 在 45水浴中氮吹浓缩至干，用 1mL 10%乙腈溶液（4.3）复溶，过微孔滤膜（4.14），待测定。6.2.2 体液6.2.2.1 血液取血液试样 0.5mL 于 10 mL 离心管中，加入 1 mL 乙酸铵-氨水缓冲溶液（4.11） ，涡旋混合1min，加入 2mL 甲醇（4.1） ，涡旋混合 2min，超声辅助提取 10min，9500 rpm 离心 5min，取上清液；残渣加入 2mL 甲醇（4.1）重复提取一次，合并上清液，45水浴中氮吹浓缩至干，用 1mL 10%乙腈溶液（4.3）复溶，过微孔滤膜（4.14） ，待测定。6.2.2.2 尿液取尿液试样 1mL 于 10mL 离心管中，准确加入 4 mL 含 1%甲酸的乙腈溶液（4.6） ，涡旋混合1min 后，向离心管中加入 1.5g 无水硫酸镁（4.7） ，迅速振摇 1min，9500 rpm 离心 5min。取上清液2mL 在 45水浴中氮吹浓缩至干，用 1mL 10%乙腈溶液（4.3）复溶，过微孔滤膜（4.14） ，待测定。6.3 仪器参考条件6.3.1 液相色谱参考条件a) 色谱柱：C 18 柱，100mm2.1mm（内径），2.5m，或相当者；b) 流动相：A ：0.1%甲酸水溶液（3.2.6），B：乙腈（ 3.2.3），梯度洗脱，梯度洗脱程序参见表1；GB/T XXXXX20173c) 流速：0.30mL/min ；d) 柱温：30；e) 进样量：2L。表 1 梯度洗脱程序表时间 /min A/% B/%0.0 90 102.0 90 106.0 75 2523 75 2523.01 90 1025 90 106.3.2 质谱参考条件a) 电离方式：电喷雾电离，正离子模式；b) 喷雾电压：5.5 kV；c) 离子源温度：500；d) 气帘气压力：0.21MPa ；e) 雾化气压力：0.34MPa ；f) 辅助气压力：0.34MPa ；g) 扫描模式：多反应监测（MRM ）模式，11 种生物碱质谱参数参见表 2。表 2 11 种生物碱质谱参数序号 No. 物质名称Substance name 母离子Parent ion(m/z)去簇电压Declustering potential /V子离子Product ion (m/z)碰撞能Collision energy (V)138.3* 301 东莨菪碱Scopolamine 324.2 70 156.3 25244.2 502 番木鳖碱Brucine 395.1 80 324.3* 45586.3* 473 乌头碱Aconitine 646.3 80 554.5 52556.2* 454 次乌头碱Hypaconitine 616.4 70 524 50572.2* 455 新乌头碱Mesaconitine 632.3 80 354.2 60310.1 356秋水仙碱 Colchicine 400.4 70 358.1* 32124.1* 357 阿托品Atropine 290.3 80 93.1 42184.2* 508 士的宁Strychnine 335.2 90 156.2 60GB/T XXXXX20174305.2* 359 喜树碱Camptothecin 349.2 80 249.2 4094.9* 3410 毛果芸香碱Pilocarpine 209.3 70 163.5 29247.3* 2011 鬼臼毒素podophyllotixin 415.3 80 397.2 15注：*定量离子6.4 混合标准工作溶液的制备 取相应的空白样品，按照 6.1.2 步骤进行处理，用得到的空白样品提取液将混合标准储备溶液（4.13）逐级稀释得到东莨菪碱、番木鳖碱、乌头碱、次乌头碱、新乌头碱、秋水仙碱、阿托品、士的宁、喜树碱、毛果芸香碱、鬼臼毒素浓度为 5g/L、10g/L、20g/L、50g/L、100g/L 的系列混合标准工作溶液，浓度由低到高进行检测，以定量离子峰面积对质量浓度作图，做出标准曲线回归方程。6.5 测定步骤将试样溶液注入液相色谱-串联质谱仪中，得到 11 种生物碱的质谱响应值，根据标准曲线得到待测液中 11 种生物碱的浓度。样品溶液中各组分的响应值应在标准曲线的线性范围内，超过线性范围则应稀释后再进样测定。6.6 定性判定在相同条件测定样品溶液和标准溶液，如果样品溶液中检出的色谱峰的保留时间与标准溶液中的某种组分峰的保留时间一致（变化范围在2.5%），并且所选择的两对子离子的质荷比一致，样品溶液中定性离子相对丰度与浓度相当标准工作溶液中定性离子的相对丰度进行比较时，相对偏差不超过表3规定的范围，则可判断样品中存在该组分。11种生物碱标准物质的总离子流图参见附录B图B.1 。表 3 定性确定时相对离子丰度的最大允许偏差相对离子丰度 50% 20%至 50% 10%至 20% 10%允许的相对偏差 20% 25% 30% 50%6.7 空白试验除不加试样外，均按上述测定条件和步骤进行。7.结果计算7.1 植物组织、动物组织结果按式（1）计算，计算结果保留小数点后两位。GB/T XXXXX20175（1） 式中：Xi样品中待测组分含量，g/kg；Ci由标准曲线得出的测试液中某种组分的浓度，g/L；V定容体积，mL；K稀释倍数；m样品质量，g。7.2 体液结果按式（2）计算，计算结果保留小数点后两位。（2）式中：Xi样品中待测组分含量，g/L；Ci由标准曲线得出的测试液中某种组分的浓度，g/L；V定容体积，mL；K稀释倍数；v样品体积，mL。8 精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。9其他本标准的方法检出限，植物组织、动物组织：阿托品为0.4g/kg，次乌头碱、新乌头碱为0.6g/kg，东莨菪碱、番木鳖碱、乌头碱、秋水仙碱、士的宁、喜树碱、毛果芸香碱为1.0g/kg，鬼臼毒素为2.0g/kg ；血浆、尿液：阿托品为0.4g/L ，次乌头碱、新乌头碱为 0.6g/L，东莨菪碱、番木鳖碱、乌头碱、秋水仙碱、士的宁、喜树碱、毛果芸香碱为1.0g/L，鬼臼毒素为2.0g/L 。本标准的方法定量限，植物组织、动物组织：阿托品为1.0g/kg，次乌头碱、新乌头碱为2.0g/kg，东莨菪碱、番木鳖碱、乌头碱、秋水仙碱、士的宁、喜树碱、毛果芸香碱为4.0g/kg， 鬼臼毒素为5.0g/kg ；血浆、尿液：阿托品为1.0g/L ，次乌头碱、新乌头碱为 2.0g/L，东莨菪碱、番木鳖碱、乌头碱、秋水仙碱、士的宁、喜树碱、毛果芸香碱为4.0g/L，鬼臼毒素为5.0g/L 。GB/T XXXXX20176附 录 A（资料性附录）11种生物碱的中文名称、英文名称、CAS 号、分子式、相对分子质量及结构式11 种生物碱的中文名称、英文名称、CAS 号、分子式、相对分子质量及结构式参见表 A.1。表 A.1 11 种生物碱的中文名称、英文名称、CAS 号、分子式、相对分子质量及结构式序号 中文名称 英文名称 CAS 号 分子式 相对分子质 量 结构式1 东莨菪碱 Scopolane 51-34-3 C17H21NO4 303OOHONCH3O2 番木鳖碱 Brucine 357-57-3 C23H26N2O4 394.5 NNOHHOHHOO3 乌头碱 Aconitine 302-27-2 C34H47NO11 645.7HOOOHHOOHO OOHOOOHNH4 次乌头碱 Hypaconitine 6900-87-4 C33H45NO10 615.7HOOOHHOOOOHOOOHN5 新乌头碱 Mesaconitine 2752-64-9 C33H45NO11 631.7HOOOHOOOOHOOOHNHOHHGB/T XXXXX20177表 A.1(续)序号 中文名称 英文名称 CAS 号 分子式 相对分子质 量 结构式6 秋水仙碱 Colchicine 64-86-8 C22H25NO6 399.4OOOOO NHO7 阿托品 Atropine 51-55-8 C17H23NO3 289.4OH O NO8 士的宁 Strychnine 57-24-9 C21H23N2O2 335.4 N OO HHHHN9 喜树碱 Camptothecin 7689-03-4 C20H16N2O4 348.3O NNO OOH10 毛果芸香碱 Pilocarpine 92-13-7 C11H16N2O2 208.3 NNOO11 鬼臼毒素 Podophyllotoxin 4354-76-1 C22H22O8 414.4OOOOHOOCH3OCH3OCH3GB/T XXXXX20178附 录 B（资料性附录）11种生物碱标准物质的总离子流图11 种生物碱标准物质的总离子流图参见图 B.1。1毛果芸香碱； 2东莨菪碱； 3士的宁； 4番木鳖碱；5阿托品； 6.秋水仙碱； 7喜树碱； 8新乌头碱；9次乌头碱； 10乌头碱； 11鬼臼毒素图 B.1 11种生物碱标准物质的总离子流图_ _