HLA-B27检测及其临床应用.ppt

HLA-B27检测及其临床应用,许泼实河南省人民医院检验科,1,HLA-B27及其临床应用,什么是HLA及HLA-B27MHC、HLA、亚型、关联、RRHLA-B27与哪些疾病相关血清阴性脊柱关节病类型及特点强直性脊柱炎特点及其与B27关联机制HLA-B27怎么检测MLCT、ELISA、IMS-ELISA、FCM、PCR-SSP,2,HLA相关概念,主要组织相容性抗原主要组织相容性复合体（MHC类)：H-2SLAHLAMHC、HLA复合体基因MHC分子、HLA分子抗原HLA：人类白细胞抗原（HumanLeukocyteAntigen）,3,HLA相关概念,4,HLA-B27相关疾病,5,血清阴性脊柱关节病共同特点,RF（一）家族聚集现象与HLA-B27不同程度相关皆可影响脊柱，都有不同程度的骶髂关节炎，也可影响外周关节，下肢关节多于上肢关节，且呈不对称性。与革兰氏阴性杆菌有一定相关性：强直性脊柱炎与肠道肺炎克雷白杆菌相关Reiter综合征与沙眼衣原体、福氏痢疾杆菌相关反应性关节炎与沙门杆菌、痢疾杆菌、耶尔森菌和HP相关,6,血清阴性脊柱关节病共同特点,临床上有很多共同或重叠之处：眼炎，尿道炎，前列腺炎，口腔、肠道和生殖器溃疡结节性红斑，银屑病样皮疹坏死性脓皮病，血栓性静脉炎基本病理变化以肌腱端周围和韧带附着于骨的部位为主(附着端炎)而非滑膜，也可发生在眼、主动脉瓣、肺实质和皮肤，而不同于以滑膜病变为主的类风湿性关节炎，而且无类风湿皮下结节。,7,HLA-B27相关疾病：强直性脊柱炎,AnkylosingSpondylitis，AS患病率：0.3%，20-30岁，男女比例10:1，有家族倾向；主要侵犯：中轴关节（骶髂关节、脊柱骨突、脊柱旁软组织）可伴发外周关节及关节外表现，严重者发生脊柱畸形和关节强直B27检测可作为有相关症状或高危人群AS早期的筛选方法！AS不是RA的一种特殊类型！,8,HLA-B27与AS,9,HLA-B27与AS,10,健康人群HLA-B27阳性率及AS患病率各地区、种族有显著的差异HLAB27与强直性脊柱炎的发病有很强的相关性两种错误认识：HLA-B27阳性AS！HLA-B27阳性不会转阴！,HLA-B27与AS的关联机制,连锁不平衡学说分子模拟学说关节源性肽假说其他：T细胞受体库假说超抗原假说B27修饰因子假说Cys67模型,11,张谷香医学综述，2012,18(4):498-501,HLA基因座位的等位基因和真正的疾病易感基因处于紧密连锁不平衡，而HLA基因本身并不是引起疾病的真正基因，仅仅是遗传标志。,B27抗原与某些G（-）菌之间存在类似的分子结构，能发生分子模拟或交叉反应，机体免疫系统把B27当作病原体抗原产生免疫应答，对机体产生免疫损害。,认为关节源性肽只存在于关节组织中，特异性地由HLAB27提呈，正常情况下递呈水平低，反应T细胞处于耐受状态；当某些具有同源结构蛋白的病毒或细菌感染时，则可致敏耐受的T细胞，从而识别以低水平递呈的关节源性肽，引起自身免疫反应而损伤组织。,HLA-B27检测方法及评价,抗原水平微量细胞毒法84%ELISAIMS-ELISA88%流式细胞术法93%基因水平PCR-SSP96%,12,微量细胞毒法（microlymphocytotoxictest，MLCT）,原理：如果受试者淋巴细胞表面表达有相应的HLA-B27抗原，就可以与B27抗体结合，形成Ag-Ab复合物激活补体，发生对细胞膜的破坏及细胞杀伤作用，通过染色法观察，死细胞的细胞膜通透性改变，染料能够进入使之着色，而活细胞细胞膜完整不被染色。根据死细胞占全部细胞的百分比，可以判断受试者淋巴细胞表面是否存在HLA-B27抗原及其与抗体的反应强度。优点：不需特殊仪器设备，易于操作，一般的实验室都可开展。缺点：标本存放不能超过8小时；感染可以使细胞膜表面的B27分子的数量或结构改变，影响MLCT的结果，易出现假阴性。,13,J.Kirveskari,etal.BritishJournalofRheumatology,1997,36:185-189,ELISA,原理：应用双抗体夹心酶标免疫分析法测定标本中HLA-B27水平。用纯化的B27抗体包被微孔板，依次加入HLA-B27抗原（待检标本）、生物素化的抗HLA-B27抗体、HRP标记的亲和素，形成双抗体夹心反应，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的HLA-B27呈正相关。其结果与MLCT法符合率为99，且不受感染因素的影响，重复性好。,14,瞿良等实用医学杂志，2005,19(21):2190-2191,磁珠酶联免疫分析（IMS-ELISA）,磁珠分离与ELISA结合B27单抗标记磁珠HRP标记CD45单抗通过磁场分离游离相优点：反应时间短（1小时完成）对标本新鲜度要求不高28静置4d之内可用,15,杨雅琼等现代检验医学杂志，2002,17(2):60-62,流式细胞术法,利用荧光标记的HLA-B27单克隆抗体，与细胞表面的B27抗原结合，使结合后的淋巴细胞具有一定的荧光强度，这种荧光强度可由流式细胞仪测得的通道值来反映，以其值的高低判断HLA-B27抗原表达百分比，从而判断HLA-B27是否阳性。优点：全自动仪器检测，减少了人为因素的影响，重复性高，结果判断准确，为目前较为理想的方法，国外已将FCM法检测HLA-B27作为AS诊断的常规检测方法。缺点：仪器昂贵，目前只在较大医院应用，且荧光易淬灭。,16,LeveringWH，etal.JCytometryBClinCytom，2003,54(1):28-38,PCR-SSP,通过设计基因序列特异的引物SSP，特异性的扩增出标本中的HLA-B27基因片段，以琼脂糖凝胶电泳分析PCR扩增产物，若出现目的条带则表示HLA-B27为阳性。优点：基因水平的检测直接对HLA-B27原基因进行扩增分型，灵敏度高，特异性强。缺点：耗时长，需要跑电泳，需要特定的实验仪器及严格的实验条件，在临床上普遍开展此项检查有一定的难处。,17,OlerupOTissueAntigens，1994,43(4):253-256,18,万事有其本源，而不是去教条的接受其存在。,