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12 基因工程的基本操作程序,专题1 基因工程,学习导航,专题1 基因工程,一、基因工程的基本操作程序 目的基因的获取 _的构建 将_导入受体细胞 目的基因的_,基因表达载体,目的基因,检测与鉴定,二、目的基因的获取 1目的基因：主要是指_的基因，也可以是一些具有调控作用的因子。 2目的基因的获取方法 (1)从基因文库中获取 基因文库：将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入_中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。,编码蛋白质,受体菌的群体,提取依据：基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色体上的位置、基因的转录产物_，以及基因的表达产物蛋白质等特性。 (2)利用PCR技术扩增目的基因 PCR的含义：是一项在生物_复制特定DNA片段的核酸合成技术。 目的：短时间内大量扩增目的基因。 原理：_。,基因组,mRNA,体外,DNA双链复制,过程： 第一步：加热至9095 ，_； 第二步：冷却至_，引物结合到互补DNA链； 第三步：加热至7075 ，热稳定DNA聚合酶(Taq酶)从引物起始进行互补链的合成。 如此重复循环多次。 特点：指数形式扩增。 (3)人工合成 如果目的基因较小，核苷酸序列又已知，可通过DNA合成仪用_人工合成。,DNA解旋,5560,化学方法,三、基因表达载体的构建 1构建基因表达载体的目的： (1)使目的基因在_中稳定存在，并且可以_给下一代。 (2)使目的基因能够_和_。,受体细胞,遗传,表达,发挥作用,2基因表达载体组成：,3基因表达载体的功能：通过基因表达载体将_导入受体细胞。 巧记 两子启动和终止； 目的基因在中间； 标记基因来筛选。,目的基因,四、将目的基因导入受体细胞 1转化的概念：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内_的过程。 2将目的基因导入植物细胞 (1)_法:将目的基因导入双子叶植物和裸子植物。 (2)基因枪法：将目的基因导入单子叶植物常用的方法。 (3)_法：我国科学家独创的一种方法。,维持稳定和表达,农杆菌转化,花粉管通道,3将目的基因导入动物细胞 (1)方法：_。 (2)常用受体细胞：受精卵。,显微注射法,4将目的基因导入微生物细胞 (1)方法： 用_处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态(这种细胞称为_)。 感受态细胞吸收_。 (2)受体细胞：原核细胞(使用最广泛的是大肠杆菌细胞)。 (3)原核生物的特点：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少等。,Ca2,感受态细胞,重组表达载体DNA分子,五、目的基因的检测与鉴定 1分子水平检测 (1)检测转基因生物DNA上是否插入了目的基因。 方法：_技术。 (2)检测目的基因是否转录出mRNA。 方法：_杂交技术。 (3)检测目的基因是否翻译成蛋白质。 方法：_杂交技术。 2个体生物学水平鉴定：抗虫、抗病、抗逆性状的有无及程度。,DNA分子杂交,分子,抗原抗体,1判一判 (1)所有的目的基因都可从基因文库中直接获得。( ) (2)标记基因的作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因,从而将含有目的基因的细胞筛选出来。( ) (3)目的基因导入双子叶植物一般采用农杆菌转化法。( ) (4)基因工程常用的受体细胞都是动植物的体细胞。( ) (5)基因工程是否成功需进行个体生物学水平上的鉴定。( ),2连一连 将下列方法技术与其对应内容连线,目的基因的获取,1基因文库：基因组文库和cDNA文库 (1)基因文库的含义(如图所示),(2)cDNA文库与基因组文库的主要区别：,小,大,无,有,无,有,某种生物的部分基因,某种生物的全部基因,可以,部分基因可以,2提取目的基因方法的比较,操作简单,专一性强,可在短时间内大量扩增目的基因,专一性强,可产生自然界中不存在的新基因,工作量大、盲目性大、专一性差,操作过程较麻烦，技术要求过高,需要严格控制温度、技术要求高,适用范围小,3PCR技术与生物体内DNA复制的比较,DNA在高温下变性解旋,解旋酶催化,场所,体外复制,主要在细胞核内,酶,热稳定的DNA聚合酶,细胞内含有的DNA聚合酶,温度条件,需控制温度，在较高温度下进行,细胞内温和条件,结果,在短时间内形成大量的DNA片段,形成整个DNA分子,原理,DNA双链复制(碱基互补配对),原料,四种游离的脱氧核苷酸,条件,模板、ATP、酶等,特别提醒 获取目的基因需在受体细胞中表达 (1)真核细胞的基因编码区含有不能表达的区域，因此不能直接用于基因的扩增和表达。获得真核细胞中的目的基因时，一般用人工合成的方法。 (2)基因工程操作中，只有使用受体生物自身基因的启动子才比较有利于基因的表达。 (3)通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体细胞中无法转录。,下列获取目的基因的方法中需要模板的是( ) 从基因文库中获取目的基因 利用PCR技术扩增目的基因 反转录法 通过DNA合成仪利用化学方法人工合成DNA A B C D 解析 PCR技术利用的是DNA双链复制原理。即将DNA双链之间的氢键打开，变成单链DNA，作为聚合反应的模板。反转录法是以目的基因转录成的信使RNA为模板，在反转录酶的作用下，先反转录形成互补的单链DNA，再合成双链DNA。则均不需要模板。,D,(2014甘肃兰州一中高二检测)获取目的基因的方法有多种，下列不属于目的基因获取方法的是( ) A从基因组文库中获取 B从cDNA文库中获取 C直接从受体细胞中获取目的基因 D利用PCR技术获取 解析：应该直接从供体细胞中获取目的基因。,C,基因表达载体的构建,2构建方法：,特别提醒 启动子和终止子、起始密码子与终止密码子的区别 启动子起始密码(子)；终止子终止密码(子)。 (1)启动子和终止子都在DNA上，在遗传信息转录时起作用。启动子是启动转录的开始，终止子是DNA分子上决定转录停止的一段DNA序列，其组成单位都是脱氧核苷酸。 (2)起始密码子和终止密码子都是mRNA上三个相邻碱基。起始密码子决定翻译的开始，终止密码子决定翻译的停止。,(2014聊城高二检测)下列关于基因表达载体的构建描述错误的是( ) A基因表达载体的构建是基因工程的核心 B基因表达载体的构建包括目的基因、启动子、终止子、标记基因等部分 C目的基因主要是指编码蛋白质的基因 D构建的基因表达载体都是相同的 解析 基因表达载体的构建是基因工程的第二步，也是基因工程的核心；一个基因表达载体的组成除目的基因外还必须具有启动子、终止子、标记基因等部分；目的基因主要是指编码蛋白质的基因；由于受体细胞不同，基因表达载体的构建也会有差别，不可能都是相同的。,D,由于受体细胞有植物、动物、微生物之分，加上目的基因导入受体细胞的方法不同，因此，基因表达载体的构建也会有差别，不可能千篇一律。,(2014安徽屯溪一中高二质检)人们常选用的细菌质粒分子往往带有一个抗生素抗性基因，该抗性基因的主要作用是 ( ) A提高受体细胞在自然环境中的耐药性 B有利于对目的基因是否导入进行检测 C增加质粒分子的分子量 D便于与外源基因连接 解析：抗生素抗性基因为标记基因，便于对目的基因是否导入进行检测。,B,1目的基因导入受体细胞的过程：,目的基因导入受体细胞,2不同受体细胞的常用导入方法,显微注射法,Ca2处理法,体细胞,受精卵,原核细胞,目的基因插入Ti质粒的T-DNA上导入植物细胞整合到受体细胞的DNA中表达,目的基因表达载体提纯取卵 (受精卵)显微注射受精卵发育获得具有新性状的动物,Ca2处理细胞感受态细胞表达载体与感受态细胞混合感受态细胞吸收DNA分子,特别提醒 目的基因能否稳定遗传的判断 目的基因能否在受体细胞内稳定保存并表达的关键是目的基因是否插入到受体细胞染色体上的DNA分子中。图中过程b与过程a相比，b会使目的基因的遗传特性得以稳定维持和表达，而a细胞分裂时，细胞质是不均分的，子细胞不一定含有目的基因。,(2014山东济南高二检测)农杆菌是一种在土壤中生活的微生物，能在自然条件下感染植物，因而在植物基因工程中得到了广泛的运用。如图为农杆菌转化法的示意图，试回答下列问题：,(1)一般情况下农杆菌不能感染的植物是_，利用农杆菌自然条件下感染植物的特点，能实现_。具体原理是在农杆菌的Ti质粒上存在T-DNA片段，它具有可转移至受体细胞并整合到受体细胞_上的特点，因此只要将携带外源基因的DNA片段插入到_(部位)即可。,单子叶植物,目的基因导入植物细胞,染色体的DNA,T-DNA片段(内部),(2)根据T-DNA这一转移特点，推测该DNA片段上可能含有控制_(酶)合成的基因。 (3)图中c过程中，能促进农杆菌向植物细胞转移的物质是_类化合物。 (4)植物基因工程中除了农杆菌转化法之外，还可采取_。(至少写出两种),DNA连接酶、限制酶,酚,基因枪法、花粉管通道法,解析 (1)一般农杆菌不能感染的植物是单子叶植物，可感染双子叶植物和裸子植物。利用其感染性，可实现目的基因导入植物细胞。真正可转移至受体细胞并整合到受体细胞染色体的DNA上的是农杆菌T-DNA片段，因此目的基因必须插入到该部位才能成功。(2)根据T-DNA这一转移特点，可以推测该DNA片段能控制合成DNA连接酶、限制酶以实现与双子叶植物细胞染色体DNA的整合。(3)植物细胞受伤后可产生酚类物质，促进农杆菌向植物细胞转移。(4)植物基因工程中除了农杆菌转化法之外，还有基因枪法和花粉管通道法等。,(1)能促进含目的基因的重组Ti质粒转入农杆菌中的常用方法是什么？ (2)怎样操作可促进单子叶植物受农杆菌的感染？ 提示：(1)用Ca2(或CaCl2溶液)处理可增加农杆菌细胞壁的通透性而达到促进含目的基因的重组Ti质粒转入农杆菌中的目的。 (2)可在单子叶植物受损处加涂酚类物质来吸引更多的农杆菌感染。,下列关于目的基因导入受体细胞的描述不正确的是( ) A基因枪法导入植物体细胞的方法比较经济有效 B显微注射技术是转基因动物中采用最多的方法 C.大肠杆菌最常用的转化方法是使细胞的生理状态发生改变 D农杆菌转化法是将目的基因导入植物细胞最常用的方法 解析：不同生物目的基因导入的方法不同，每种方法都有利有弊。目的基因导入植物细胞常用的方法是农杆菌转化法，该方法比较经济有效，基因枪法成本较高；目的基因导入动物细胞常用的方法是显微注射法；大肠杆菌细胞最常用的转化方法就是用钙离子处理细胞，使细胞的生理状态发生改变,完成转化过程。,A,目的基因的检测与鉴定,目的基因是否进入受体细胞,DNA分子杂交技术(DNA和DNA之间),目的基因是否转录出mRNA,分子杂交技术(DNA和mRNA之间),目的基因是否翻译出蛋白质,抗原抗体杂交技术,是否成功显示出杂交带,包括抗虫、抗病的接种实验，以确定是否有抗性以及抗性的程度；基因工程产品与天然产品的活性比较，以确定功能是否相同,特别提醒 在DNA分子、mRNA分子上检测目的基因是否插入、目的基因是否转录时，所用的探针都是用放射性同位素等标记的含有目的基因的单链DNA片段。,回答有关基因工程的问题： (1)构建基因工程表达载体时，用不同类型的限制酶切割DNA后，可能产生黏性末端，也可能产生_末端。若要在限制酶切割目的基因和质粒后使其直接进行连接，则应选择能使二者产生_(相同、不同)黏性末端的限制酶。,平,相同,(2)利用大肠杆菌生产人胰岛素时，构建的表达载体含有人胰岛素基因及其启动子等，其中启动子的作用是_。在用表达载体转化大肠杆菌时,常用_处理大肠杆菌，以利于表达载体进入;为了检测胰岛素基因是否转录出了mRNA，可用标记的胰岛素基因片段作探针与mRNA杂交,该杂交技术称为 _。为了检测胰岛素基因转录的mRNA是否翻译成_,常用抗原抗体杂交技术。,RNA聚合酶识别和结合的部位,Ca2,分子杂交技术,蛋白质,解析 (1)限制酶切割产生两种末端；黏性末端和平末端；若用DNA连接酶连接两个末端，两个末端必须是相同的。 (2)基因工程检测的方法：检测目的基因是否导入，使用DNA分子杂交技术；检测目的基因是否转录，使用分子杂交技术;检测是否形成蛋白质，使用抗原抗体杂交技术。,(2014陕西西安高二检测)下列哪项表述说明了目的基因表达成功( ) A用DNA探针检测目的基因出现杂交带 B用DNA探针检测mRNA出现杂交带 C用抗原抗体杂交检测蛋白质出现杂交带 D以上都不能说明 解析：由于基因工程产生与天然产品的功能不一定相同，往往需要进行活性的比较，才能确定功能程度，最终说明目的基因是否表达成功。,D,
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