NCBI基本功能与引物设计.ppt

,NCBI常用功能与引物设计,2010级博士：谢鹏,导师：邹晓庭,Your site here,为何要接触NCBI？,如何使用NCBI？,如何设计引物？,Your site here,NCBI简介,NCBI：National Center for Biotechnology Information 美国国家信息技术中心 （http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/）,1992年10月，NCBI承担起对GenBank DNA序列数据库的责任。NCBI工作人员通过来自各个实验室递交的序列和同国际核酸序列数据库（EMBL和DDBJ）交换数据建立起数据库.,Genebank是遗传序列数据库，一个所有可以公开获得的DNA序列的注释过的收集。 GenBank以指数形式增长，核酸碱基数目大概每14个月就翻一个倍。最近，GenBank拥有来自47,000个物种的30亿个碱基。,Sub title,NCBI常用功能,查找核酸/氨基酸序列,序列相似性分析,引物验证,Your site here,一、查找核酸、氨基酸序列,1.以鸡FAT/CD36为例，search：,2.调整右侧检索目录，tree-list：,Your site here,3.浏览信息，下载序列，并以Genebank、FASTA格式保存,点击Genebank:,氨基酸序列：,Genebank核酸序列：, ,FASTA格式的核酸序列：, ,Your site here,二、序列相似性分析,序列相似性分析： 就是将待研究序列与DNA或蛋白质序列库进行比较，用于确定该序列的生物属性，也就是找出与此序列相似的已知序列是什么。完成这一工作只需要使用两两序列比较算法。常用的程序包有BLAST、FASTA等 序列同源性分析： 是将待研究序列加入到一组与之同源，但来自不同物种的序列中进行多序列同时比较，以确定该序列与其它序列间的同源性大小。这是理论分析方法中最关键的一步。完成这一工作必须使用多序列比较算法。常用的程序包有DNAMAN、CLUSTAL等,Blast简介,BLAST ： “局部相似性基本查询工具”(Basic Local Alignment Search Tool)的 缩写，是由NCBI开发的一个基于序列相似性的数据库搜索程序。,主要的Blast程序：,Blast 序列相似性分析,1.修改测序结果，剔除克隆载体序列,在测序结果中找到上下游引物对应位置，剔除引物外的多余部分,以鸽子的I-FABP片段为例：,GCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACGATTAGGAAGTTAGGAGCCCACGATAATCTGAAGATCACTATTCAACAAGATGGAAACAAATTTACGGTCAAAGAATCAAGCAACTTCCGTACTATAGATATTGAATTCACTCTGGGAGTCAATTTTGACTACAGTCTCGCTGACGGAACGGAAATCTCTAGAGGATCCCCGGGTACCGAGCTCGAATTCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGT ,上游引物：5-AGRAARYTDGSAGCYCAC-3 下游引物： 5- TCHGTYCCRTCWGCBAGA-3,TAGGAAGTTAGGAGCCCACGATAATCTGAAGATCACTATTCAACAAGATGGAAACAAATTTACGGTCAAAGAATCAAGCAACTTCCGTACTATAGATATTGAATTCACTCTGGGAGTCAATTTTGACTACAGTCTCGCTGACGGAACGGA,Your site here,2.进入NCBI 3.点击Basic BLAST中的nucleotide blast选项,Your site here,Your site here,4.寻找相近物种，比较相似性,Your site here,点击score，获得相似性比较具体信息,NCBI官方说明：http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/tutorial/Altschul-1.html,Your site here,引物设计与简并PCR,RTPCR原理与技术简介 引物设计过程 简并PCR技术 后续研究,Your site here,RTPCR原理与技术简介,DNA mRNA 蛋白质,酶活力 Western blot,Northern blot 半定量RTPCR 定量RTPCR,Your site here,RTPCR原理与技术简介,1,2,Your site here,常规引物设计,引物设计原则 Primer5和Oligo6进行引物分析,Your site here,引物设计原则,引物的长度一般为15-30bp，常用的是18-27bp，但不能大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74，即Taq 酶的最适温度。 引物3端的序列要比5端重要。引物3端的碱基一般不用A，因为A在错误引发位点的引发效率相对比较高。另外引物间3端的互补、二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。5端序列对PCR 影响不大。 引物的GC含量一般为40-60%，以45-55为宜，过高或过低都不利于引发反应。PCR引物的GC/AT比率应当等于或高于所要放大的模板的GC/AT比。 G值(自由能)反映引物与模板结合的强弱程度。一般情况下，引物的G值最好呈正弦曲线形状，即5端和中间G值较高，而3端G值相对较低，且不要超过9（G值为负值，这里取绝对值）。 引物二聚体及发夹结构的能量一般不要超过4.5，否则容易产生引物二聚体带。,Your site here,以鸡的I-FABP为例，设计常规引物：,1.输入I-FABP的已知序列，点击primer:,Your site here,2.点击search进行引物条件设置：,3.Search criteria 筛选,Your site here,4.选择最优引物,5.手动修改，调整引物,Your site here,Blast 引物验证,最为重要的环节：对自己设计的引物或文献报道的引物进行测试,1.登陆NCBIBlastPrimer-BLAST: http:/blast.ncbi.nlm.nih.gov/,Your site here,以文献报道鸡的MUC2的引物为例：,Your site here,Your site here,Your site here,简并引物设计,More of an art than a science 降低简并度（500以下） 例如：上游 D Y N L F D L L 下游 P V N G N G K Q 根据密码子表建立引物系列http:/www.kazusa.or.jp/codon/ 谨慎使用次黄嘌呤,GAYTAYAAYYTNTTYGAYYTNYTN,CCNGTNAAYGGNAAYGGNAARCAR,Symbol Definition B not A D not C H not G I Inosine K G or T/U M A or C N A,C,G or T/U R A or G S C or G V not T/U W A or T Y C or T/U,简并引物：在常规引物的某些位点上以简并核苷酸代替。,Your site here,简并引物设计过程,传统方法（适用于保守度高序列） 应用BLAST进行同源序列搜索 应用DNAMAN选择保守区域（氨基酸或核苷酸） 简并引物设计原则 Primer5和Oligo6进行引物分析 CODEHOP法（适用于保守度低序列）,Your site here,应用BLAST进行同源序列搜索,剪切然后粘贴DNA或蛋白序列； 使用FASTA格式的序列； FASTA格式的序列以一个单行的说明开始，说明行以其开始处的一个大于号（）与序列数据区分开。说明行以下是序列数据。 简单使用访问编号：RefSeq或Genebank序号。 http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/,Your site here,Your site here,DNAMAN分析序列保守区,对Gallus、Taeniopygia、Mus、Ruttus的I-FABP的CDS进行分析得到保守区序列,Your site here,CODEHOP,原理 方法： http:/bioinformatics.weizmann.ac.il/blocks/codehop.html,Your site here,简并PCR技术,RNA,cDNA,cDNA,反转录,合并产物,分装产物,-actin,样 品,PCR,Your site here,简并PCR技术,使用标准的反应体系并适当增大引物浓度（1-3 M） 退火温度是最关键点： 采用Touchdown方法优化条件 采用梯度PCR优化条件 使用热启动PCR 循环数增加至50 cycles 电泳检测至关重要 不用二次扩增重复结果,Your site here,应用半定量或定量PCR法研究营养物质等对该基因表达水平的影响 使用RACE法进行基因cDNA全长扩增 进行蛋白质结构预测 原核表达 系统进化树 为RNAi法研究基因功能提供基础,后续研究,Thank You!,