KJ 201904 水发产品中甲醛的快速检测

附件4水发产品中甲醛的快速检测（KJ201904）1 范围本方法规定了水发产品及其浸泡液中甲醛的快速检测方法。本方法适用于银鱼、鱿鱼、牛肚、竹笋等水发产品及其浸泡液中甲醛的快速测定。AHMT法（比色卡法）2 原理试样中的甲醛经提取后，在碱性条件下与4-氨基-3-联氨-5-巯基-1，2，4-三氮杂茂（AHMT）发生缩合，再被高碘酸钾氧化成6-巯基-S-三氮杂茂4，3-b-S-四氮杂苯的紫红色络合物，其颜色的深浅在一定范围内与甲醛含量成正相关，通过色阶卡进行目视比色，对试样中甲醛进行定性判定。3 试剂和材料除另有规定外，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的二级水。3.1 试剂3.1.1 氢氧化钾（KOH）。3.1.2 盐酸（HCl）。3.1.3 亚铁氰化钾（K4Fe(CN)63H2O）。3.1.4 乙酸锌（C4H6O4Zn2H2O）。3.1.5 冰乙酸（C2H4O2）。3.1.6 乙二胺四乙酸二钠（C10H14N2O8Na22H2O）。3.1.7 高碘酸钾（KIO4）。3.1.8 4-氨基-3-联氨-5-巯基-1，2，4-三氮杂茂 （C2H6N6S ，AHMT）。3.1.9 氢氧化钾溶液（5mol/L）：称取280.5g氢氧化钾（3.1.1），用水溶解并定容至1000mL，混匀。3.1.10 氢氧化钾溶液（0.2mol/L）：称取11.22g氢氧化钾（3.1.1），用水溶解并定容至1000mL，混匀。3.1.11 盐酸溶液（0.5mol/L）：量取41mL盐酸（3.1.2），用水稀释并定容至1000mL，混匀。3.1.12 亚铁氰化钾溶液（106 g/L）：称取10.6 g亚铁氰化钾（3.1.3），用水溶解并定容至100 mL，混匀。3.1.13 乙酸锌溶液（220g/L）：称取22 g乙酸锌（3.1.4），加入3mL冰乙酸（3.1.5）溶解，用水稀释并定容至100mL，混匀。3.1.14 乙二胺四乙酸二钠溶液（100 g/L）：称取10g乙二胺四乙酸二钠（3.1.6），用5 mol/L氢氧化钾溶液（3.1.9）溶解，并定容至100 mL，混匀。3.1.15 AHMT溶液（5 g/L）：称取0.5 g 4-氨基-3-联氨-5-巯基-1，2，4-三氮杂茂（3.1.8），用0.5 mol/L盐酸溶液（3.1.11）溶解，并定容至100 mL，混匀后置于棕色瓶中，有效期6个月。3.1.16 高碘酸钾溶液（15 g/L）：称取1.5g高碘酸钾（3.1.7），用0.2 mol/L氢氧化钾溶液（3.1.10）溶解，并定容至100 mL，混匀。3.2 参考物质甲醛参考物质的中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子量见表1。表1 甲醛参考物质的中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子量中文名称英文名称CAS登录号分子式相对分子量甲醛Formaldehyde50-00-0HCHO30.033.3 标准溶液的配制3.3.1 甲醛标准储备液（100g/mL）：安瓿瓶封装，冷藏、避光、干燥条件下保存。使用前恢复至室温，摇匀备用。安瓿瓶打开后应一次性使用完毕。3.3.2 甲醛标准工作液（10g/mL）：吸取甲醛标准储备液（100g/mL）（3.3.1）1.0mL，置于10mL容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，临用前配制。3.4 材料3.4.1 甲醛快速检测试剂盒（AHMT法-比色卡法）：适用基质为水发产品及其浸泡液，需在阴凉、干燥、避光条件下保存。3.4.2 滤纸：中速定性滤纸。4 仪器和设备4.1 移液器：200L，1mL，5mL。4.2 涡旋混合器。4.3 电子天平或手持式天平：感量为0.01g。4.4 离心机：转速4000r/min。4.5 环境条件：温度1535，湿度80%。5 分析步骤5.1 试样制备取适量有代表性试样的可食部分或浸泡液，固体试样剪碎混匀，液体试样需充分混匀。5.2 试样的提取准确称取试样1 g（精确至0.01 g）或吸取试样1.0mL，置于15 mL离心管中，加水定容至10 mL，涡旋提取1 min，静置5 min，取上清液作为提取液（如上清液浑浊，加入1mL亚铁氰化钾溶液（3.1.12）和1mL乙酸锌溶液（3.1.13），涡旋混匀，4000 r/min离心5 min或滤纸过滤，取上清液或滤液作为提取液）。5.3 测定步骤准确移取提取液2 mL于5 mL离心管中，加入0.4 mL乙二胺四乙酸二钠溶液（3.1.14）和0.4 mL AHMT溶液（3.1.15），涡旋混匀后静置10 min，再加入0.1 mL高碘酸钾溶液（3.1.16），涡旋混匀后静置5 min，立即与标准色阶卡目视比色，10min内判读结果。进行平行试验，两次测定结果应一致，即显色结果无肉眼可辨识差异。5.4 质控试验每批试样应同时进行空白试验和加标质控试验。用色阶卡和质控试验同时对检测结果进行控制。5.4.1 空白试验称取空白试样1 g（精确至0.01 g）或吸取空白试样1.0 mL，按照5.2和5.3步骤与试样同法操作。5.4.2 加标质控试验准确称取空白试样1 g（精确至0.01 g）或吸取空白试样1.0 mL，置于15 mL离心管中，加入0.5 mL甲醛标准工作液（10 g/mL）（3.3.2），使试样中甲醛含量为5mg/kg，按照5.2和5.3步骤与试样同法操作。6 结果判定要求观察检测管中样液颜色，与标准色阶卡比较判读试样中甲醛的含量。颜色浅于检出限（5 mg/kg）则为阴性试样；颜色接近或深于5 mg/kg则为阳性试样。色阶卡见图1。甲醛标准比色卡（mg/kg或mg/L） 0 5 10 20 50 100 200图1 甲醛标准色阶卡质控试验要求：空白试验测定结果应为阴性，质控试验测定结果应与比色卡第二点（5mg/kg或mg/L）颜色一致。7 结论由于色阶卡目视判读存在一定误差，为尽量避免出现假阴性结果，读数时遵循就高不就低的原则。当测定结果为阳性时，应对结果进行确证。8 性能指标8.1 检测限5mg/kg或mg/L。8.2 灵敏度灵敏度应95%。8.3 特异性特异性应85%。8.4 假阴性率假阴性率应5%。8.5 假阳性率假阳性率应15%。注：性能指标计算方法见附录A。AHMT法（分光光度法）9 原理试样中的甲醛经提取后，在碱性条件下与4-氨基-3-联氨-5-巯基-1，2，4-三氮杂茂 （AHMT）发生缩合，再被高碘酸钾氧化成6-巯基-S-三氮杂茂4，3-b-S-四氮杂苯的紫红色络合物，其颜色的深浅在一定范围内与甲醛含量成正相关，用分光光度计在550nm处测定吸光度值，与标准系列比较定量，得到试样中甲醛的含量。10 试剂和材料除另有规定外，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的二级水。10.1 试剂同3.1。10.2 参考物质同3.2。10.3 标准溶液的配制同3.3。10.4 材料10.4.1 甲醛快速检测试剂盒（AHMT法-分光光度法）：适用基质为水发产品及其浸泡液，需在阴凉、干燥、避光条件下保存。10.4.2 滤纸：中速定性滤纸。11 仪器和设备11.1 移液器：200 L，1 mL，5 mL。11.2 涡旋混合器。11.3 电子天平或手持式天平：感量为0.01 g。11.4 离心机：转速4000 r/min。11.5 分光光度计或相应商品化测定仪。11.6 环境条件：温度1535，湿度80%。12 分析步骤12.1 试样制备同5.1。12.2 试样的提取同5.2。12.3 测定步骤准确移取提取液（12.2）2 mL置于5 mL离心管中，另准确吸取10 g/mL的甲醛标准工作液（3.3.2）0 mL、0.1 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL（相当于0 g、1 g、2 g、4 g、6 g、8 g、10 g甲醛）分别置于5mL带刻度的具塞刻度试管中，加水定容至2 mL，涡旋混匀。于标准管和试样管中分别加入0.4 mL乙二胺四乙酸二钠溶液（3.1.14）和0.4 mL AHMT溶液（3.1.15），涡旋混匀静置10 min，再加入0.1mL高碘酸钾溶液（3.1.16），静置5 min后用1cm 比色杯，以零管调节零点，于波长550 nm 处测定吸光度，绘制标准曲线比较。同时做试剂空白。12.4 质控试验每批试样应同时进行空白试验和加标质控试验。12.4.1 空白试验称取空白试样1 g（精确至0.01 g）或吸取空白试样1.0mL，按照12.2和12.3步骤与试样同法操作。12.4.2 加标质控试验准确称取空白试样1 g（精确至0.01 g）或吸取空白试样1.0 mL，置于15 mL离心管中，加入0.5 mL甲醛标准工作液（10 g/mL）（3.3.2），使试样中甲醛含量为5 mg/kg，按照12.2和12.3步骤与试样同法操作。13 分析结果的表述13.1 结果计算试样中甲醛的含量按式（1）计算：（1）式中：X试样中甲醛的含量，单位为毫克每千克或毫克每升（mg/kg或mg/L）；由标准曲线得到的试样提取液中甲醛的含量，单位为微克（g）；0由标准曲线得到的空白提取液中甲醛的含量，单位为微克（g）；V试样定容体积，单位为毫升（mL）；V1测定用试样体积，单位为毫升（mL）；m试样的取样量，单位为克或毫升（g或mL）；1000单位换算系数。计算结果保留两位有效数字。13.2 结果判定当测定结果5 mg/kg或mg/L时，判定为阳性，阳性结果的试样需要重复检验2次以上。13.3 质量控制要求空白试验测定结果应为阴性，加标质控试验测定结果回收率应60%。14 结论当测定结果为阳性时，应对结果进行确证。15 性能指标15.1 检测限5mg/kg或mg/L。15.2 灵敏度灵敏度应95%。15.3 特异性特异性应85%。15.4 假阴性率假阴性率应5%。15.5 假阳性率假阳性率应15%。注：性能指标计算方法见附录A。乙酰丙酮法（分光光度法）16 原理试样中的甲醛经提取后，在沸水浴条件下与乙酰丙酮发生反应，生成黄色物质，其颜色的深浅在一定范围内与甲醛含量成正相关，用分光光度计在413 nm处测定吸光度值，与标准系列比较定量，得到试样中甲醛的含量。17 试剂和材料除另有规定外，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的二级水。17.1 试剂17.1.1 无水乙酸钠（CH3COONa）。17.1.2 乙酰丙酮（C5H8O2）。17.1.3 乙酰丙酮溶液：称取25.0 g无水乙酸钠（17.1.1）溶于适量水中，移入100 mL容量瓶中，加0.40 mL乙酰丙酮（17.1.2）和3.0 mL冰乙酸（3.1.5），加水定容至刻度，混匀，移至棕色试剂瓶中，28保存，有效期1个月。17.2 参考物质同3.2。17.3 标准溶液配制同3.3。17.4 材料17.4.1 甲醛快速检测试剂盒（乙酰丙酮法-分光光度法）：适用基质为水发产品及其浸泡液，需在阴凉、干燥、避光条件下保存。17.4.2 滤纸：中速定性滤纸。18 仪器和设备18.1 移液器：200 L，1 mL，5 mL。18.2 涡旋混合器。18.3 电子天平或手持式天平：感量为0.01 g。18.4 离心机：转速4000r/min。18.5 水浴锅。18.6 分光光度计或相应商品化测定仪。18.7 环境条件：温度1535，湿度80%。19 分析步骤19.1 试样制备同5.1。19.2 试样的提取同5.2。19.3 测定步骤准确移取提取液（19.2）2 mL置于5 mL离心管中，另准确吸取10 g/mL的甲醛标准工作液（3.3.2）0 mL、0.1 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL（相当于0 g、1 g、2 g、4 g、6 g、8 g、10 g甲醛）分别置于5 mL带刻度的具塞刻度试管中，加水定容至2 mL，涡旋混匀。于标准管和试样管中分别加入0.2 mL 乙酰丙酮溶液（17.1.3）涡旋混匀后沸水浴5 min，取出冷却至室温后用1 cm 比色杯，以零管调节零点，于波长413 nm 处测定吸光度，绘制标准曲线比较。同时做试剂空白。19.4 质控试验每批试样应同时进行空白试验和加标质控试验。19.4.1 空白试验称取空白试样1 g（精确至0.01 g）或吸取空白试样1.0 mL，按照19.2和19.3步骤与试样同法操作。19.4.2 加标质控试验准确称取空白试样1 g（精确至0.01 g）或吸取空白试样1.0 mL，置于15 mL离心管中，加入0.5 mL甲醛标准工作液（10 g/mL）（3.3.2），使试样中甲醛含量为5 mg/kg，按照19.2和19.3步骤与试样同法操作。20 分析结果的表述20.1 结果计算同13.1。20.2 结果判定同13.2。20.3 质量控制要求同13.3。21 结论当测定结果为阳性时，应对结果进行确证。22 性能指标22.1 检测限5mg/kg或mg/L。22.2 灵敏度灵敏度应95%。22.3 特异性特异性应85%。22.4 假阴性率假阴性率应5%。22.5 假阳性率假阳性率应15%。注：性能指标计算方法见附录A。23 其他本方法所述试剂、试剂盒信息及操作步骤是为给方法使用者提供方便，在使用本方法时不作限定。方法使用者在使用替代试剂、试剂盒或操作步骤前，须对其进行考察，应满足本方法规定的各项性能指标。本方法参比标准为SC/T 3025-2006水产品中甲醛的测定 液相色谱法或其他现行有效的甲醛检测标准。附录A快速检测方法性能指标计算表表A.1 性能指标计算表试样情况a检测结果b总数阳性阴性阳性cN11N12N1.=N11+N12阴性N21N22N2.=N21+N22总数N.1=N11+N12N.2=N21+N22N=N1.+N2.或N.1+N.2显著性差异(2)c2=(|N12-N21|-1)2/(N12+N21)，自由度（df）=1灵敏度(p+，%)p+=N11/N1.特异性(p-，%)p-=N22/N2.假阴性率(pf-，%)pf-=N12/N1.=100-灵敏度假阳性率(pf+，%)pf+=N21/N2.=100-特异性相对准确度，%d(N11+N22)/(N1.+N2.)注：a由参比方法检验得到的结果或者试样中实际的公议值结果；b由待确认方法检验得到的结果。灵敏度的计算使用确认后的结果。用于确认方法时，结果5mg/kg时，判定为阳性（仅用于计算性能指标）；c本方法规定：用于计算灵敏度和假阴性率的阳性试样，由参比方法检验得到的结果回收率应60%。N：任何特定单元的结果数，第一个下标指行，第二个下标指列。例如：N11表示第一行，第一列，N1.表示所有的第一行，N.2表示所有的第二列；N12表示第一行，第二列。d为方法的检测结果相对准确性的结果，与一致性分析和浓度检测趋势情况综合评价。本方法负责起草单位：南京工业大学（国家轻工业食品质量监督检测南京站）验证单位：南京市产品质量监督检验院、厦门市食品药品质量检验研究院、江西省药品检验检测研究院主要起草人：熊晓辉、汪开银、聂小林、肖有玉、骆和东、章红 9