愈伤组织诱导及观察

.实验二 愈伤组织诱导及观察一.实验目的通过愈伤组织诱导的操作，使同学们了解进行植物组织培养时的一些关键操作技术和方法，如外植体的选择、培养基母液配制、使用液配制、分装灭菌、外植体表面消毒、接种、培养、愈伤组织诱导原理和方法以及接种后污染率，愈伤组织诱导率的统计与观察。使同学们能够亲身体会、了解激素对外植体的作用，还使同学们了解无菌培养的无菌操作，清楚植物体的带菌部位等。二.实验内容（一）、实验原理植物组织培养是指在无菌条件下，对离体植物组织（器官或细胞）分离并在培养基中培养，使其能够继续生长，甚至分化发育成一完整的植株的一门实验技术。组织培养的理论依据是植物细胞的全能性，即植物体的每个细胞携带着一套完整的基因组，因此具有发育成完整植株的潜在能力。植物组织当中原本已经分化的细胞，一旦脱离原有的机体环境，成为离体状态，在适宜的营养和外界条件下，就会表现出全能性，从已经分化定型的细胞，脱分化，成为恢复分裂能力的细胞，并能重新生长发育成完整的植株。愈伤组织就是指一个离体的细胞、一块组织或一个器官的细胞，通过脱分化不断分裂、增生子细胞，这些细胞分裂快，结构疏松，颜色浅而透明，逐渐形成了无序结构的一团细胞。在植物组织培养中，主要目标是诱导愈伤组织形成和形态发生，使一个离体的细胞、一块组织或一个器官的细胞，通过脱分化形成愈伤组织，并由愈伤组织再分化形成植物体。愈伤组织的形成 从一块外植体形成典型的愈伤组织，大致要经历三个时期：起动期、分裂期和形成期。起动期是指细胞准备进行分裂的时期。用于接种的外植体的细胞，通常都是成熟细胞，处在静止状态。起动期是通过一些刺激因素(如机械损伤、改变光照强度、增加氧等)和激素的诱导作用，使外植体细胞的合成代谢活动加强，迅速进行蛋白质和核酸的合成。机械损伤能诱导植物体细胞开始分裂，如伤口上会出现愈伤组织。在植物组织培养中沿用了愈伤组织这一名词，但是植物组织培养中诱导外植体细胞分裂形成的愈伤组织，大都不是损伤的结果。外源的生长素类物质对诱导细胞开始分裂效果很好，因此生长素类物质在植物组织培养中得到广泛应用，常用的有2，4-二氯苯氧乙酸、萘乙酸、吲哚乙酸和细胞分裂素等。分裂期是指外植体细胞经过诱导以后脱分化，不断分裂、增生子细胞的过程。处于分裂期的愈伤组织的特点是：细胞分裂快，结构疏松，颜色浅而透明。外植体的脱分化因植物种类、器官来源及其生理状况的不同而有很大差别。例如，烟草、胡萝卜等植物的脱分化比较容易，禾本科植物的脱分化比较难；花的脱分化比较容易，茎、叶的脱分化比较难；幼嫩组织的脱分化比较容易，成熟的老组织脱分化比较难。分化期是指在分裂期的末期，细胞内开始出现一系列形态和生理上的变化，从而使愈伤组织内产生不同形态和功能的细胞。这些细胞类型有薄壁细胞、分生细胞、色素细胞、纤维细胞，等等。外植体的细胞经过起动、分裂和分化等一系列变化，形成了无序结构的愈伤组织。如果在原来的培养基上继续培养愈伤组织，会由于培养基中营养不足或有毒代谢物的积累，导致愈伤组织停止生长，甚至老化变黑、死亡。如果要让愈伤组织继续生长增殖，必须定期地(如24周)将它们分成小块，接种到新鲜的培养基上，这样愈伤组织就可以长期保持旺盛的生长。愈伤组织的形态发生方式 经过起动、分裂和分化期产生的愈伤组织，其中虽然发生了细胞分化，但是并没有器官发生。只有满足某些条件，愈伤组织的细胞才会发生再分化，产生芽和根，进而发育成完整植株。愈伤组织的形态发生方式主要有不定芽方式和胚状体方式两种。不定芽方式是在某些条件下，愈伤组织中的分生细胞发生分化，形成不同的器官原基，再逐渐形成芽和根。胚状体方式是由愈伤组织细胞诱导分化出具有胚芽、胚根、胚轴的胚状结构，进而长成完整植株。这种由愈伤组织中的薄壁细胞不经过有性生殖过程，直接产生类似于胚的结构，叫做胚状体。在植物组织培养中，不定芽方式和胚状体方式是愈伤组织形态发生的两种最常见和最重要的方式。胚状体方式比不定芽方式有更多的优点，如胚状体产生的数量比不定芽多，胚状体可以制成人工种子，等等。（二）实验材料和用具1植物材料银杏种子2实验仪器和试剂1）仪器设备 超净工作台、高压灭菌锅、微波炉、人工气候箱、电子天平、移液器、恒温磁力搅拌器、酸度计、手术刀、手术剪、称量纸、皮筋、封口膜、三角瓶、量筒、烧杯（1000ml）、试剂瓶（1000ml、100ml）、长镊子、记号笔（或标签纸）、培养皿、酒精灯等。2）试剂 75% 酒精、氯化汞、植物生长激素（NAA、BA1）、蔗糖、琼脂粉、HCl、NaOH、WS母液配方见表1。（三）实验方法1 培养基配制1）. 培养基的选择 植物组织培养中应用的培养基，一般由无机营养物、碳源、维生素、生长调节剂和有机附加物等五类物质组成。无机营养物包括大量元素和微量元素。大量元素：C、H、O、N、P、S、K、Ca、Na、Mg等，微量元素：Mn、Zn、Cu、B、Mo、Fe等。碳源一般为蔗糖。 维生素中只有硫胺素是必需的，而烟酸、维生素B6和肌醇对生长之起促进作用。常用的生长调节剂有IAA （吲哚乙酸）、IBA（吲哚-3-丁酸）、 NAA（萘乙酸）、NOA（萘氧乙酸）、 P-CPA（对氯苯氧乙酸）、2，4-D（二氯苯氧乙酸）、2，4，5-T（三氯苯氧乙酸）；BA P（苄氨基嘌呤）、6-BA（苄基腺嘌呤）、2-Zi（异戊烯氨基嘌呤）、 KT（激动素）等。有机附加物是指甘氨酸、水解酪蛋白、椰子乳等，可促进分化，但如培养基配方适当，则大多数组织是不需要的。培养基的种类、成份直接影响到培养材料的生长发育，故应根据培养植物的种类和部位，选择适宜的培养基。 2）. 培养基的配制 先按表1配制WS培养基贮液。再将贮液与其他成分按比例混合。加入3%的蔗糖作为碳源，起支持作用的琼脂粉8 g/L，愈伤组织培养基配方为WS培养基+NAA1 mg/L +BA1 mg/L。 将上述培养基加热溶解后，加蒸馏水使培养基达到终体积。 再用0.1mol/L NaOH 或0.1mol/L HCl 调节培养基的pH值至56-5.8。 分装至三角瓶内，封口膜封口，等待灭菌后使用。2灭菌1）培养基及器具灭菌 培养基、无菌水需要在高压灭菌锅中灭菌。灭菌作用取决于温度，常用的灭菌温度为121，所需时间20分钟，灭菌结束后待温度下降到50以下，才能取出已灭菌的培养基。 可用同样方法对器具同时进行灭菌，包括：培养皿、解剖刀、剪子、滤纸、镊子等。2）工作环境灭菌 接种前1打开超净工作台和棚面的紫外灯照射40min。杀菌结束后，先关掉棚面的紫外灯，再打开风机，最后关掉超净工作台上的紫外灯。在接种后休息时，要先打开台面的紫外灯，再关风机，最后打开棚面紫外灯。不能将风机与台面上的紫外灯同时关闭或先关闭风机再开紫外灯。3） . 植物材料的灭菌 植株各部分的表面携带着各种微生物，他们是植物组培的污染源，所以在接种培养前必须进行彻底的表面消毒；组织内部侵染的真菌或细菌很难消除，这些组织一般淘汰不用。消毒前需用流水清洗植物材料表面污垢，再用无菌洁净滤纸吸干水分。 植物材料的灭菌需在超净工作台内进行，可选择不同的灭菌剂进行植物组织表面消毒。同时注意，表面消毒剂对植物组织也是有毒的。因此，应当选择消毒剂的浓度和时间，尽量减少组织的死亡。灭菌后，需用无菌水反复冲洗，彻底洗去表面消毒剂。如：银杏种子消毒：将银杏种子去外种皮。进超净工作台后，在0.1%氯化汞中浸泡10分钟，用无菌水冲洗3-5次，无菌滤纸吸干，在无菌滤纸上，用解剖刀取出种胚。准备工作就绪后，可以进行接种。3接种1）. 进台 工作人员进入接种室前，需要洗净手和手腕。进入超净工作台内需用75%酒精纱布擦拭手、手腕，再擦培养基瓶和超净工作台。2）. 接种(1) 剪、镊消毒：接种前剪、镊、解剖刀应插入75%酒精瓶中，取出后置于酒精灯外焰上彻底灼烧，灼烧时应将镊口张开，烧至剪、镊上火焰熄灭为止，冷却后方可进行接种。接种后仍需灼烧并插回75%酒精的磨口瓶待用。注意每次取出时镊子不可接触瓶口和其它器皿。(2) 插植外植体：左手拿三角瓶，解开封口膜，将三角瓶几乎水平拿着，靠近酒精灯焰，将瓶口外部在酒精灯火焰上燎数秒钟，使瓶口的水气散发掉。用右手拇指、食指、中指拿消毒过的镊子夹一块外植体（银杏种胚）送入瓶内轻轻的插入培养基上，再把封口膜在酒精灯火焰上燎数秒，灼燎时应旋转，避免烧坏，盖好封口膜，扎紧皮筋，便完成了第一瓶的操作，接着再做第二瓶，如此直到外植体全部接完。3） 注意事项(1) 操作人员的头、胳膊等不得进入台内。(2) 操作人员不得随意谈话、说笑，以免造成污染。(3) 用酒精对双手消毒时，务必待酒精彻底挥发后再靠近酒精灯火焰，以免火焰伤手。(4) 台外人员走动要轻、动作要小。 4.培养接种后置于培养室培养，温度232，适当光照强度和光周期。10天计算愈伤组织诱导率和污染率。培养过程如果有的培养物被微生物污染，应当马上将其清理，以免影响其它培养物，并做好记录。WS培养基MS 1：20*（20倍浓）g/LKNO3 ：38； NH4NO3：33MS2：100* g/LCaCl2.2H2O：44（CaCl2：33.2）W3：100* g/LMgSO47H2O：37；甘油磷酸钠：27MS4：100* g/LH3BO3：0.62； MnS044H20：2.23 （MnS04H20：1.69）；ZnSO47H20：0.86MS5：1000* g/LNa2MoO42H20：0.25；COCl26H20：0.025； KI：0.83W6 1000CuSO45H2O 0.08H2MoO4H2O 0.02W7：100* g/LFePO4 0.19W8: 1000* g/L甘氨酸： 2.0； 烟酸 ：5；维生素B1： 0.5；维生素B6： 0.5维生素H(生物素)： 0.05W9：100* g/L肌醇 ：10.0半胱氨酸 1.