响应面法优化香菇多糖发酵培养基.ppt

响应面分析法优化香菇多糖发酵培养基,主要内容,1.香菇多糖与提取方法简介2.Plackett-Burman设计法与响应面分析法3.实验材料与方法4.Plackett-Burman优化培养基实验设计5.响应面法优化培养基组成6.结论,1.香菇多糖与提取方法简介,香菇多糖：是一种生理活性物质。它具有抗病毒、抗肿瘤、调节免疫功能和刺激干扰素形成等功能。提取方法：从香菇子实体或经深层发酵后的发酵液中提取。香菇子实体生长周期长，产量和多糖得率均较低。而深层发酵培养香菇菌丝体不仅发酵液中含有与子实体相当或更高的营养物质，同时还可利用农副产品作原料，成本低，周期短，易于大规模生产，因此已得到广泛应用于重视。但目前香菇菌丝体发酵水平较低，通过优化条件以提高多糖含量是发酵过程中急需解决的问题。,2.Plackett-Burman设计法与响应面分析法,同：都是20世纪中叶后发展起来的的优化实验条件的统计学方法。能用较少的实验次数推算出目标值的优化条件，优化效率高。异：Plackett-Burman试验就是筛选实验设计，主要针对因子数较多，且未确定众因子相对于相应变量的显著性，采用的试验方法。响应面分析法是一种优化实验条件寻优的方法，它通过试验设计、建模、检验模型的合适性，寻求最佳组合条件的众多试验和统计技术。,本实验优化香菇多糖培养基方法,用Plackett-Burman实验设计筛选影响香菇产多糖的主要因素,用Box-Behnken实验设计对培养基做响应面分析实验,回归模型验证实验，确定最优培养基,最陡爬坡法确定因素水平,用统计软件SAS8.0进行回归拟合，建立回归模型与方程,3.实验材料与方法,3.1菌种来源：香菇135，本实验室分离保存（浙江庆元）3.2试剂：马铃薯购自农贸市场，鱼粉为浙江工业大学药学院提供，其余所需的主要试剂均为分析纯，3.3培养基与培养方法斜面培养基：采用PDA培养基。种子培养基组成为（%）：葡萄糖2，蛋白胨0.25，酵母膏0.25，初始pH自然，121灭菌30min。初始发酵培养基成分为（%）：葡萄糖1.5，酵母膏0.5，MgSO47H2O0.1。初始pH5.5，121灭菌30min。斜面菌种转接至装有100mL种子培养基的250mL三角瓶中，置回转式摇床180r/min，25培养5d。然后将菌丝体无菌条件下打散制成种子悬液，以10%的接种量转接入100mL/250mL的发酵培养基中，回转式摇床180r/min，25培养6d后结束。,3.4粗多糖提取将发酵菌悬液离心（4,000r/min，20min），分别收集上清液和菌体。上清液中加入无水乙醇至75%（v/v），冰箱保存过夜，再经离心（8,000r/min，10min），取沉淀用于胞外多糖测定。菌体洗涤后，悬浮于一定体积的去离子水中，超声波破壁（300Hz，10min)，高速离心（10,000r/min，10min）收集上清液，处理过程同上，用于胞内多糖测定。粗多糖为胞内多糖与胞外多糖之和。1.5粗多糖测定粗多糖含量测定采用苯酚-硫酸法（Duboisetal.1956）,4.Plackett-Burman优化培养基实验设计,4.1Plackett-Burman实验筛选主要影响因子本实验选用N=12的Plackett-Burman实验设计，对葡萄糖（A）、鱼粉（B）、VB1（C）、NaCl（D）、FeSO4（E）、MgSO4（F）、KH2PO4（G）和初始pH（H）8个因素进行考察，每个因素取高（+）低（-）两个水平，高水平约为低水平的1.25倍，响应值为总粗多糖产量（Y），实验设计见表1，因素水平取值、效应及显著性分析见表2。,表1Plackett-Burman实验设计与结果,BACK,表2Plackett-Burman实验分析结果,由表可知，在香菇菌株135产多糖过程中葡萄糖、鱼粉和KH2PO4这3个因素对多糖产量显著，可考虑作为主要因素进一步做响应面实验。,4.2最陡爬坡实验设计及结果,要得到响应面拟合方程，必须要先逼近最佳值区域。而本方法以实验值的变化方向为爬坡方向，根据各因素效应值大小确定变化步长。根据表2分析结果，确定不显著因素的水平，表现为负效应的因素取低值水平，正效应的取高值。显著因素的变化步长及方向的实验设计及结果表明（表3），第3组产量最高，因此以第3组的水平作为响应面实验的中心点，即葡萄糖2%，鱼粉1.0%，KH2PO40.1%。,0.5,0.05,1.5,最佳组,5.响应面法优化培养基组成,5.1Box-Benhnken实验设计与分析：依据Plackett-Burman实验和最陡爬坡法实验确定的因素与水平。采用Box-Benhnken实验设计对产多糖发酵培养基进行3因素3水平的响应面分析实验。,响应面实验中心点,表5Box-Behnken实验设计及相应结果,3个中心实验效果佳,5.2二次回归模型拟合和方差分析,利用系统软件SAS8.0对表5实验数据进行二次多项回归拟合，通过RESEG（响应面回归）过程进行数据分析，建立二次响应面回归模型，并寻求最优相应因子水平，得到回归方程：Y=2.136667+0.44625X1+0.045X2-0.01375X3-0.44583X12-0.13833X22-0.09083X32-0.1175X1X2+0.015X1X3-0.0725X2X3,模型的F检验值在=0.05时远大于F（9,5）=4.77，说明方程有很高的显著性。,R2=0.9973，表明方程模型与实验数据有99.73%的符合度，调整后的R2adj=0.9925，表明方程模型有很高的可信度。,葡萄糖影响最为显著,多糖开始由X2X3浓度增加而减少,两者相互作用显著,5.3培养基最适组合,在获得非线性回归模型和响应面之后，为了求得培养基最佳浓度，对所得的回归拟和方程分别对各自的变量求一阶偏导数，并令其为得到三元一次方程组，求解此方程组可以得到最大多糖量时的最佳条件：X1=0.5066(2.2533%)，X2=-0.0488(0.9756%)，X3=0.0144(0.0993%)，Y=2.2487g/L。所以产多糖最高时的培养基组成为：葡萄糖2.2533%，鱼粉0.9756%，VB10.003%，NaCl0.8%，MgSO47H2O0.1%，FeSO47H2O0.04%，KH2PO40.0993%，初始pH值5.5。,回归模型验证实验,根据最优培养基配方对模型进行验证，香菇菌丝体产粗多糖为2.33g/L，实际值与预测值的误差为+3.61%。初始培养基条件下总多糖产量为0.80g/L，优化后提高了1.91倍。该结果表明，响应面法优化产香菇粗多糖最佳培养基是可行有效的。,6.结论,该研究经响应面方法优化，得出菌株产多糖的最佳培养基配方为：葡萄糖2.2533%，鱼粉0.9756%，VB10.003%，NaCl0.8%，MgSO47H2O0.1%，FeSO47H2O0.04%，KH2PO40.0993%，初始pH值5.5。在优化条件下经3批摇瓶培养实验验证，粗多糖产量均值为2.33g/L与预测值2.2487g/L误差为+3.61%，与原始培养条件相比，多糖产量提高了1.91倍。实验证明响应面方法对培养基优化是非常有效的工具，Plackett-Burman实验设计能对影响多糖产量的各因素效应进行评价并能有效地找出主要因素，最陡爬坡法能充分接近最大响应面区域，Box-Behnken实验设计能建立主要因素影响多糖产量的二次多项数学模型，并利用统计学方法对该模型进行了显著性检验，优化了内在因素水平，找出最佳值。,