《毛细管电泳法》PPT课件.ppt

毛细管电泳法,目录,毛细管电泳法基本原理,毛细管电泳法类型,毛细管电泳法仪器构造,毛细管电泳法特点,CE-MS构造,毛细管电泳法基本原理,CE统指以高压电场为驱动力，以毛细管为分离通道，依据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离的一类液相分离技术。通常采用2574m内径、长3880cm的弹性石英毛细管，使用1030kV直流电压，形成高强度电场。由于细管径的毛细管电阻率大、电流小，有效地抑制了焦耳热效应，而且具有较大的散热比表面积，也限制了电泳过程中溶液温度升高，使得分离柱效高，分离速度快。,毛细管电泳法基本原理,电泳：在电解质溶液中，带电粒子在电场作用下，以不同的速度向其所带电荷相反方向迁移的现象。,q,6r,E,Vep=epE=,Vep为离子电泳迁移速度ep为电泳淌度E为电场强度q为离子电荷量为介质粘度r为离子半径。,半径小、电荷高的组分具有大的迁移率，而半径大、电荷低的组分具有小的迁移率。,毛细管电泳法基本原理,CE所用的石英毛细管柱，在pH3情况下，其内表面带负电，和溶液接触时形成了一双电层。电渗：在高电压作用下，双电层中的水合阳离子引起流体整体地朝负极方向移动的现象。,毛细管电泳法基本原理,影响因素：pH值（pH越高，电渗流越大）离子强度（离子强度越高，电渗流越小）缓冲溶液添加剂（离子型表面活性剂、有机溶剂）,毛细管电泳法基本原理,粒子在毛细管内电解质中的迁移速度等于电泳和电渗流（EOF）两种速度的矢量和。正离子的运动方向和电渗流一致，故最先流出；中性粒子的电泳流速度为“零”，故其迁移速度相当于电渗流速度；负离子的运动方向和电渗流方向相反，但因电渗流速度一般都大于电泳流速度，故它将在中性粒子之后流出，从而因各种粒子迁移速度不同而实现分离。,毛细管电泳法基本原理,V=Vep+Veo=(ep+eo)E,毛细管电泳法仪器构造,毛细管电泳法仪器构造,毛细管柱是CE的核心部件，目前多为2575m之间，材料为聚四氟乙烯、玻璃和弹性石英，以石英居多。选择细内径毛细管柱有利于最大散热，但比表面积大，会增加溶质的吸附作用。,高压电源：包括电源、电极和电极槽进样系统：电动进样、压力进样,毛细管电泳法仪器构造,检测系统,毛细管电泳法类型,毛细管区带电泳（CZE)毛细管凝胶电泳（CGE）毛细管等电聚焦（CIEF）毛细管等速电泳（CITP）毛细管胶束电动色谱（MECC/MCKC）微乳液毛细管电动色谱（MEEKC）毛细管电色谱（CEC）亲和毛细管电泳（ACE）非胶毛细管电泳（NGCE）,毛细管电泳法类型毛细管区带电泳,定义：溶质在毛细管内的背景电解质溶液中以不同速度迁移而形成一个个独立的溶质带的电泳模式特点：简单，是CE中应用最广泛的一种操作模式。缺点：不能分离中性物质，因中性物质的淌度差为零。性质：基于样品中各个组分间质荷比的差异定性依据：不同组分的迁移时间不同定量依据：电泳峰的峰面积或峰高,荷/质比越大跑得越快！,毛细管电泳法类型毛细管凝胶电泳,毛细管中装入凝胶作支持物进行的电泳。因凝胶具有多孔性，起类似分子筛的作用，使溶质按分子量大小逐一分离。且凝胶黏度大，可减少溶质的扩散，使被分离组分峰形尖锐，以达到最高柱效。关键是毛细管凝胶柱的制备，常用聚丙烯酰胺。主要用于核酸片断及蛋白分子量分析缺点：制作麻烦，寿命短,毛细管电泳法类型毛细管等电聚焦,基本原理：基于两性电介质在分离介质中的迁移造成的pH梯度，使物质根据它们不同的等电点达到分离的目的。具有一定等电点的物质顺着这一梯度迁移到相当于其等电点的那个位置，并在此停下，产生非常窄的聚焦带，并使不同等电点的蛋白聚焦在不同位置上。,优点：极高的分辨率，可以分离等电点差异0.01pH单位的两种蛋白质。,毛细管电泳法类型毛细管等速电泳,较早采用的模式，目前应用不多。选用淌度比样品中任何待测组分的淌度都高的电解质作为先导电解质，用淌度比样品中任何待测组分的淌度都低的电解质作为尾随电解质，夹在先导电角质和尾随电解质之间的样品组分根据各自的有效淌度不同而分离，达到平衡时，各组分区带上电场强度的自调节作用使各组分区带具有相同的迁移速率。常用于分离离子型物质。,毛细管电泳法类型毛细管胶束电动色谱,电解质中加入表面活性剂，使之形成胶束，样品根据其疏水性强弱的差异，在胶束与电解质的分配系数有所不同來进行分离，样品疏水性愈強，则进入胶束的机会愈大。通常物质进入胶束后，泳动的速度会变慢，因此疏水性愈強的物质则愈慢出來。,毛细管电泳法类型毛细管胶束电动色谱,优点：增加对弱极性物质分离的分离度在中药分析、天然产物分析、农药分析中经常使用毛细管电泳中唯一能同时分离中性物质和离子型物质的分离模式。,缺点：稳定性不佳，达到好的重复性比较困难,毛细管电泳法类型微乳液毛细管电动色谱,实质：在毛细管区带电泳缓冲液加入水包油乳液高分子离子。微乳液是由正构烷烃、表面活性剂、辅助表面活性剂、缓冲液通过超声处理而组成的稳定透明液体，纳米级，分散在缓冲液中作为假固定相。在MEEKC分离过程中，被分析物的疏水性不同，同微乳液滴的亲和作用也不同。其脂溶性越强，和微乳液滴的亲和作用就越强，迁移时间也越长。可用于分离多环芳烃、固醇类化合物、脂溶性维生素、糖类，蛋白类以及药物、手性分离和中性化合物,毛细管电泳法类型微乳液毛细管电动色谱,十二烷基硫酸钠（EWE）是MEEKC中最常用的阴离子表面活性剂，它分布于微乳液滴表面使其带负电荷，在电场力作用下，微乳液滴被阳极吸引，与电渗流的方向刚好相反，但是电渗流的速度要大于液滴的速度，所以带负电荷的微乳液滴向阴极移动。由于中性物质和微乳液滴表面的活性剂没有电荷相互作用，其色谱过程的分离机制就是电渗流驱动；带正电的物质和微乳表面的负电荷有离子对的相互作用，带负电的物质和微乳液表面的负电荷有互斥作用，因此它们的分离过程是电泳和色谱综合作用的结果。,毛细管电泳法类型毛细管电色谱,是将HPLC中众多的固定相微粒填充到毛细管中，以样品与固定相之间的相互作用为分离机制，以电渗流为流动相驱动力的色谱过程，虽柱效有所下降，但增加了选择性。有发展前景的方法。,毛细管电泳法类型亲和毛细管电泳,亲和毛细管电泳是指在电泳过程中具有生物专一性亲和力的两种分子（受体和其配体）间，发生了特异性相互作用，形成了受体配体复合物，从而与其它物质分离，该方法特别适用于生物活性分子如蛋白质、抗生素、核酸等的分析以及药物中的手性选择。,毛细管电泳法类型非胶毛细管电泳,指介质中以有机溶剂占主要部分，即表现为非水体系的性质。能承受更高的操作电压产生的高电场，有更高的分享效率，也可在不增大焦耳热的条件下提高溶液中的离子浓度或增大毛细管的内径，从而增大进样量。优点：使用超大内径毛细管柱、快速分析、降低吸附、提高分离选择性、有利于难溶于水及在水中不稳定的化合物的分离、对中性物质的分离、对手性物质的分离,毛细管电泳法特点,与传统电泳技术相比：分离效率高：解决了因提高电压带来的焦耳热问题分离模式多：由电渗流和电泳流共同作用结果，故有多种分类应用范围广：有机、无机小分子，多肽、蛋白质大分子带电离子，中性分子最小检出限低分析成本低：毛细管本身成本低，溶剂和试剂消耗量少样品用量少：仅为纳升级（10-9L）仪器简单：只需一个高压电源、一个检测器、一截毛细管环境友好：分离介质多为水相，且产生废液量少，环境影响小。,毛细管电泳法特点,与高效液相色谱相比的特点：,CE的优点可概括为三高二少：高灵敏度，常用紫外检测器的检测限可达10-110-15mol，激光诱导荧光检测器则达10-1910-21mol；高分辨率，其每米理论塔板数为几十万，高者可达几百万乃至千万，而HPLC一般为几千到几万；高速度，最快可在60s内完成，有250s内分离10种蛋白质、1.7min分离19种阳离子及3min内分离30种阴离子的报道；样品少，只需nL10-9L）级的进样量；成本低，只需少量（几毫升）流动相和价格低廉的毛细管。由于以上优点以及分离生物大分子的能力，使CE成为近年来发展最迅速的分离分析方法之一。,毛细管电泳法特点,CE-MS构造,实现CE-MS联用面临的主要问题是CE背景缓冲液中的盐、毛细管壁涂层材料或者MEKC中的表面活性剂等会降低被分析物的离子化效率甚至严重污染MS离子源。,CE-MS在线联用的离子源包括快原子轰击(FAB)、电喷雾电离(ESI)、大气压化学电离(APCI)、电感耦合等离子体(ICP)、大气压光电离(APPI)等,在MS方面,几乎各种不同类型质量分析器的质谱仪都可与CE联用,其中三重四极杆质谱(TQ-MS)和离子阱质谱(IT-MS)以其仪器简单、分析速度快的特点应用最为广泛;与之相比,飞行时间质谱(TOF-MS)和傅里叶变换离子回旋共振质谱FT-ICR-MS)适用于分析更大的分子,并且具有更高的质量分辨率和准确度,进一步提高了CE-MS的分析能力。,CE-MS构造,电喷雾电离（ESI）接口技术于1984年在MS中提出，溶液在高场中毛细管端以1-10ul/min的流速喷射进入MS检测器。接着，whitehouse等人8的LC-ESI-MS接口问世。但是，对于LC-MS的接口都不能直接由CE-MS加以利用，主要原因有两个：一是CE流量小、流速慢（大多为10100nl/min）,不能满足各种接口对流速的要求（210ul/min）；二是由于毛细管端不存在缓冲液中，所以必须解决CE操作中的电接触问题，保证提供分离电流回路。不过基于whitehouse等人的LC-MS接口理论，smith等9将CE分离毛细管的出口端作喷射源，首先实现了CE-ESI-MS的在线偶合。电喷雾（ESI）接口作为最早出现的在线联用接口技术，使得被分析物带上多电荷后采用质谱仪可以检测相对分子质量达几万甚至十几万的生物大分子。由于ESI自身的优势以及CE-ESI-MS接口技术的日益趋于成熟,使CE-ESI-MS已成为CE-MS联用技术中占主导地位的方法。CE-ESI-MS接口主要分为鞘液接口和无鞘液接口两种。,谢谢！请批评指正,