圆二色光谱在研究蛋白结构中的应用

圆二色光谱在蛋白质结构研究中的应用摘要：圆二色光谱（CD）是研究手性分子结构的重要工具，近年来圆二色光谱在蛋白结构分析中应用越来越广泛。本文综述了圆二色产生原理及与蛋白质结构关系并简单阐述了圆二色光谱在研究蛋白结构中的应用案例。 关键词：圆二色光谱；蛋白质；构象；由于光学活性分子对左、右圆偏振光的吸收不同, 使得左、右圆偏振光透过后变成椭圆偏振光, 这种现象就是圆二色性(circular Dichroism,简称 CD)。历史上，圆二色性又称为光学活性，巴斯德在19世纪就发现并研究了柠檬酸的光学活性。传统的圆二色谱是指波长在200400 nm 之间的吸收谱, 20世纪70年代, 由于“八区律”、“激子手性法”1等方法的发现和发展, 圆二色谱得到了广泛应用。圆二色光谱是一种差光谱, 是样品在左右旋偏振光照射下的吸收光谱差值。由于生物大分子基本都含有手性的基团和结构，圆二色光谱可以帮助测量和观察生物大分子的结构和构象变化，也可应用于研究 DNA/RNA 反应、酶动力学、光学活性物质纯度测量、药物定量分析；天然有机化学与立体有机化学、物理化学、生物化学与宏观大分子、金属络合物、聚合物化学等相关的科学研究。蛋白质是由氨基酸通过肽键连接而成的具有特定结构的生物大分子, 它并不是以长链分子的状态存在，而是折叠成特定的三维结构。因此可以用圆二色技术测定蛋白质分子结构。目前，测定蛋白质分子构象的方法还有X-射线衍射，核磁共振技术及冷冻电子显微技术2等。在专门存储蛋白质和核酸分子结构的蛋白质数据库中，接近90%的蛋白质结构是用X射线晶体学的方法测定的。大约9%的已知蛋白结构是通过核磁共振技术来测定的。此外冷冻电子显微技术是近年来兴起的一种获得低分辨率（低于5埃）蛋白质结构的方法。但是X-射线衍射技术对于分析结构复杂、柔性的生物大分子蛋白质，适合的单晶培养限制了它的应用。二维、多维核磁共振技术适用于较小分子量蛋白质构相分析且数据处理过程繁琐。冷冻电子显微技术只能用于形成二维晶体的体系，且需要专门的冷冻平台。相比而言，圆二色光谱是研究稀溶液中蛋白质构相的一种快速简便的方法。此外，圆二色对构象变化敏感，它可灵敏地检测一些反应引起的构象变化，特别适用于观测蛋白质的变性。利用圆二色性研究蛋白结构的工作始于1962年，Holzawarth与Doty发表了利用圆二色技术测定多聚氨基酸和肌红蛋白构象。1969年Greenfield应用圆二色光谱数据估计了蛋白质二级结构3，之后有关CD光谱研究蛋白质结构的报道增多。近几年来，圆二色技术得到了科学工作者越来越多的关注。1.蛋白质的圆二色性原理蛋白质一般有一级结构、二级结构、三级结构、四级结构几个主要结构层次, 有的还有结构域或超二级结构。在蛋白质和多肽分子中,肽链骨架中的肽键、芳香氨基酸残基及二硫桥键是主要的光活性生色基团,当平面圆偏振光通过时, 这些生色基团对左右圆偏振光的吸收不同, 造成偏振光矢量的振幅差, 使得圆偏振光变成了椭圆偏振光,就产生了蛋白质的圆二色性4。另外，有的蛋白质辅基对蛋白质的圆二色性也有影响。蛋白质的圆二色性主要由活性生色基团及折叠结构两方面圆二色性的总和。根据电子跃迁能级能量的大小，蛋白质的CD光谱分为三个波长范围5 (1)250nm以下的远紫外光谱区，圆二色性主要由肽键的n-*电子跃迁引起(酰胺键的吸收在190nm-250nm)，这一波长范围的CD谱包含蛋白质主链构象的信息。(2)250300nm的近紫外光谱区6，主要由侧链芳香基团的-*电子跃迁引起,这一区域可给出“局域”侧链间的相互作用。(3)300-700nm的紫外可见光光谱区，主要由蛋白质辅基等外在生色基团引起。这一波段的CD谱对金属离子的氧化态、配位态及链与链间的相互作用敏感。远紫外区的圆二色光谱反映了蛋白质或多肽的规则二级结构中肽键排列的方向和能级跃迁情况, 通过对谱带位置和吸收强弱的分析对比, 就能研究不同蛋白质或多肽的二级结构; 近紫外区的圆二色光谱反映了芳香族氨基酸残基和二硫键在不对称环境中的圆二色性, 主要揭示蛋白质的三级结构信息，研究不对称微环境的变化和影响, 对肽键在远紫外区的CD信号并不造成干扰, 在研究中可以将这些信息作为光谱探针。紫外-可见光谱主要用于辅基的偶合分析7。2.圆二色光谱研究蛋白质的二级结构与构象变化远紫外区CD光谱主要反映肽键的圆二色性。在蛋白质或多肽的规则二级结构中，肽键是高度有规律排列的，其排列的方向性决定了肽键能级跃迁的分裂情况。具有不同二级结构的蛋白质或多肽所产生CD谱带的位置、吸收的强弱都不相同。一螺旋结构在靠近192nm有一正的谱带，在222nm和208nm处表现出两个负的特征肩峰谱带；-折叠的CD光谱在216nm有一负谱带，在185-200nm有一正谱带；-转角则在206nm附近有一正CD谱带；而左手螺旋P2构象在相应的位置有负的CD谱带。单一波长常用于测定蛋白质或多肽由动力学或热力学引起的二级结构的变化8。随着光学技术发展及同步加速器辐射圆二色(SRCD)光谱技术的发展，远紫外测量光谱可以展宽到190nm以下的真空远紫外区。由于这一CD光谱区域内，包含着更为丰富的蛋白质二级结构信息，这一光谱区域的参考蛋白质的圆二色光谱及拟合运算方法也已成为研究热点。3.蛋白质二级结构的含量的定量估计早期的蛋白质或多肽的二级结构拟合计算方法中；主要采用多聚氨基酸为参考多肽。建立-螺旋、-折叠及无规卷曲等二级结构参考CD光谱曲线，采用单一波长法(208nm)计算出一螺旋含量后，然后假设不同的-折叠含量值，并假设CD值是-螺旋含量-折叠含量和无规卷曲三者贡献值的加和，通过计算机算出不同波长的（），得出计算曲线。找出与实验曲线最接近的曲线计算出各构象的含量。现代的蛋白质CD拟合二级结构的算法主要是，采用最小二乘法、单值分解及神经网络方法等算法，以待测蛋白质代替参考蛋白体系中结构相似的某一蛋白质，反复计算取代后的收敛性，从而计算拟合出未知待测蛋白质的二级结构组成9,10。4.圆二色光谱法在研究膜蛋白中的应用膜蛋白是近年来分子生物学研究的热点。膜蛋白是一类具有晶体类似结构的镶嵌于细胞膜上的蛋白，到目前为止，仅有为数不多的膜蛋白结构得到确认. 研究表明，膜蛋白紫外电子光谱跃迁受到周围环境介电常数的影响，其原因可能是由于溶剂影响了电子由基态跃迁到激发态(n-*，-*)的跃迁能量。不同于溶液环境中的蛋白质，膜蛋白镶嵌于疏水的脂质环境之中，因此，膜蛋白紫外CD光谱可能跟溶液状态下的CD信号有所区别。Wallace等11研究表明以现有的未包括膜蛋白的参考蛋白体系，采用SELCON3、CONTIN及CDSTR等拟合运算程序预测具有富含-螺旋及-折叠的膜蛋白，其结果与溶液状态的蛋白CD光谱有差别，特别在190nm后尤为明显；并且溶液状态的CD光谱拟合蛋白结构结果与由DSSP方法计算的膜蛋白晶体二级结构有差别。所以，现有的溶液参考蛋白体系不适合于CD拟合预测膜蛋白二级结构，应该建立新的含有膜蛋白的参考蛋白体系。5.圆二色光谱法用于低密度脂蛋白氧化的研究氧化修饰低密度脂蛋白（nLDL）被认为是动脉硬化的致病关键因素，它的性能与其唯一的组成蛋白apoB-100的二级结构及构象密切相关12。近年来圆二色光谱因其操作简单，灵敏度高在研究低密度脂蛋白氧化方面引起科研工作者的广泛关注。Alexander等13用远紫外CD检测溶解的apoB-100和nLDL，结果apoB-100中的-螺旋和-折叠均比nLDL高，而无规则卷曲和-转角则下降，整体的二级结构无显著变化。Brunelli等14在研究E2的抗氧化作用时发现，oxLDL中蛋白质的二级结构缺失。LDL中apoB-100的构象发生了变化，E2使apoB-100的二级结构增加，并且构象改变后的LDL对脂的过氧化修饰产生了抵抗作用。6.圆二色光谱研究三环唑与牛血清白蛋白的相互作用BSA溶液显示出了BSA中-螺旋结构的3个特征峰，192 nm有1个正峰，208、222 nm处有2个负峰，吸收峰的强度可以反映蛋白- 螺旋的含量15。当逐渐增加三环唑的浓度时，圆二色谱图中BSA在222 nm的峰强度均增加，说明疏水作用导致BSA的结构收缩，- 螺旋结构含量增加，证明三环唑与BSA相互作用导致蛋白质多肽链的重排，蛋白质构象发生变化。三环唑浓度越大，对BSA的构象影响越大，色氨酸和酪氨酸芳杂环残基的裸露越多，同时由于疏水基团之间疏水作用，-* 和n-*跃迁能量增大，使BSA的多肽链发生重排，形成新的构象。7.圆二色光谱法研究氰根配位的辣根过氧化物酶（HRP）的热伸展过程研究发现氰基取代后，酶中血红素铁的自旋状态和配位状态都与天然态完全不同，氰基取代水分子成为血红素Fe()的第六配体，这时血红素周围的氢键也会遭受一定程度的破坏，从而使HRP的热稳定性急剧下降16。 CD光谱分析表明HRP-CN的热变性过程与天然HRP变性过程不同，它存在二级和三级结构同时部分破坏的伸展中间态（，）和完全伸展后蛋白质的聚集态（A）。展望圆二色是研究溶液中蛋白质构象的一种快速、简单、较准确的方法，远紫外CD数据能快速地计算出溶液中蛋白质的二级结构；近紫外CD光谱可灵敏地反映出芳香氨基酸残基、二硫键的微环境变化，蕴含着丰富的蛋白质三级结构信息2。随着现代分析仪器的飞速发展，高压液相色谱、停流技术、电化学及荧光等附加装置与CD光谱仪器联用技术的应用，CD已经广泛地用于了解蛋白质-配体的相互作用，监测蛋白质分子在外界条件诱导下发生的结构变化，探索蛋白质折叠、失活过程中的热力学与动力学等多方面的信息。虽然紫外圆二色光谱预测蛋白质结构还存在着参考蛋白体系及计算算法有待进一步完善之处，但随着人们对蛋白质CD理解的深入及CD光谱技术的进一步发展，其必将在蛋白质研究领域中发挥更加重要的作用。参考文献1 Ying, B.P., Qin, G.W., Xu, R.S., Chin. 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