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word对从中国某某泡菜中别离的乳酸菌进展识别和鉴定泡菜是传统的发酵蔬菜产品,在中国的某某省很受欢迎。本文研究的目的是通过分析来自某某省6个不同地区的36个样品来调查主要物质乳酸菌在泡菜中的多样性(实验室)。这些样品的实验室计数的记录是从3.90到8.40cfu ml-1。使用MRS琼脂培养基，从这些样本中获得总共有185个假定的革兰氏阳性实验室和过氧化氢酶缺乏的属性,这些菌株被发现在物种水平生理测试上，16 s rRNA基因测序和PCR扩增鉴定。结果显示,所有的所别离的乳酸菌都准确地确定为肠球菌thailandicus(2株)、乳杆菌(16株),l .短(24株),l . paracasei(9株),l .杆菌(81株),l . pentosus(38株),l . sakei(8株),l . spicheri(1株)、乳酸明串珠菌(1株)和片球菌属ethanolidu-rans(5株)。某某泡菜的主要实验室l .杆菌，它是从大多数样本中别离的。结果还明确,来自某某省不同地区的实验室物种复杂成分,和这样一个资源丰富的实验室菌株为进一步的研究提供原始数据涉与益生菌菌株的选择。关键词：识别;乳酸菌;泡菜;16 s rRNA基因序列介绍：泡菜,一种有点咸有点酸的发酵的蔬菜,某某人已经吃了数百年。由于制作简单和独特的风味,泡菜很受欢迎，经常作为某某主菜的配菜或者开胃菜。自制的泡菜都是基于高度依赖于原材料生存的微生物存在而自然发酵,。对于所需酸度和风味水平的不同,泡菜的制备过程是很重要的。通常许多蔬菜,如白菜、芹菜、辣椒和萝卜都是沉浸在6 - 8%的盐溶液而红辣椒,葱和大蒜在一个特殊的罐子里夏天至少5 - 7天(约20-27C)冬天长达12 - 16天(约C)8 - 15日。采收的蔬菜外表上有各种各样的微生物，虽然蔬菜外表乳酸菌的数量(实验室)通常是相比照拟低的，在最后的发酵阶段，由于实验室厌氧和低盐的条件使其快速增长 (Han et al., 2007)。刚采摘的蔬菜外表所附着的微生物主要是革兰氏阴性腐生菌(Seo et al., 2010)。在自然发酵过程的初始阶段，实验室的数量是低的，使得硝酸盐复原细菌快速增长(Yan et al., 2008)。在中间阶段,肠杆菌科(大肠杆菌、肠杆菌属等)和芽孢杆菌是低盐和厌氧条件下，他们逐渐死亡。同时,实验室菌种快速增殖,产生酸,在厌氧条件下成为优势种和抑制 肠杆菌科和芽孢杆菌的生长。发酵完毕时,大量的实验室将会控制微生物，使泡菜发酵保持稳定(Karasu et al., 2010; Panagou and Katsaboxakis, 2006)。因此，它是值得实验室从泡菜中进展别离菌体使泡菜能都进展工业化生产。 这项研究报告是对来自中国某某省不同地区的36个样品品种进展别离和鉴定。185个菌株通过表型特征进展初步鉴定，并且进一步通过16sRNA测序和PCR扩增技术进展测定。材料和方法泡菜样品的收集，36个样本的泡菜收集来自某某省的六个不同的地区，泡菜在抽样时C(表1)，在采样现场泡菜汁的pH值测定应用校准便携式酸碱计(美国Extech pH100，室温下，泡菜汁的样品收集时间为15分钟,在冰上进展2 - 5 h运输和样品到达实验室后立即进展了微生物分析。 计数和隔离的实验室稀释是1毫升的泡菜汁加9毫升生理盐水(0.9%氯化钠)。进一步连续稀释10倍，X围是10-5 到 10-9，在实验室进展处理和测定，使用布朗甲酚紫(BCP琼脂、Nissui制药、To-kyo、日本)厌氧30C孵化 2天，平板在30C用灭菌锅罐进展灭菌，(巴尔的摩生物实验室,GasPak 100厌氧系统,BD生物科学,火花,医学博士,美国)。菌落是从MRS培养基上随机地挑取，每个平板含有30-300个菌落，Man Rogosa Sharpe 液体培养基，丙烯酰胺，并转移到5ml的MRS液体培养基中，选中平板上的菌落在MRS培养基上进展反复纯化，革兰氏阳性和过氧化氢阴性酶是从纯化的平板中提取，在-80C，10%(w / v)脱脂牛奶进展冷冻储存。冻干隔离进展长时间存储。实验室常规鉴别，进一步鉴定革兰氏阳性和过氧化氢阴性酶，是由使用以下物理方法进展别离:从精氨酸氨生产;二氧化碳是从倒杜伦管中的含有葡萄糖的MRS液体培养基中提取，Table 1.General features of pickle samples from six different region of Sichuan.SampleSamplingTemperaturepH valueLABMain materialnumberlocation(C)(log cfu ml-1)1 to 3Chengdusummer radish16.4)4.0)7.11)4 to 7Chongzhoucelery, cowpea, cabbage, bamboo shoots13.5)3.5)7.69)8 to 19Dayisummer radish, celery, cowpea, cabbage, Chinese15.1)4.5)8.17)cabbage20 to 25Pujiangsummer radish, celery, cowpea, cabbage, bamboo15.3)4.5)8.26)shoots26 to 34Qionglaisummer radish, celery, cowpea, Chinese cabbage,15.3)4.2)7.54)carrot35 to 36Xinjinsummer radish, cowpea, celery, cabbage, capsicum12.2)4.3)8.40)frutescensAverage分别在10C,15C,45C和50C的情况下在MRS液体培养基中生长5天，在pH值为3.0,3.5,4.0,4.5,5.0,9.0和9.6的情况下在MRS液体培养基中生长3天，MRS培养基中的耐盐度为含有2.0% 3.0%,4.0%,6.0%,6.5%,8.0%和10.0%氯化钠(w / v)，在别离菌种的温度下培养3天(Ko-zaki et al .,1992;Yu et al .,2011)。用一套商业工具通过D和L乳酸产生葡萄糖同分异构体的类型和数量来改变MRS培养基。(霍夫曼罗氏诊断,Mann-heim,德国)。 碳水化合物发酵试验由根据Jayne-Williams描述的方法(1975)。26种碳水化合物通过使用糖基与氯酚红汤作为指标进展了测试。不同糖被添加到根底培养基用来改变培养基,以最终浓度为0.5%(w / v)。碳水化合物发酵的结果检查是根据Bergey系统细菌学手册(Kandler Weiss,1986)中所提供的信息。16 s rRNA基因测序和亲缘关系分析，总基因组的DNA是从5ML整夜培养的培养基中提取，温度设定为37C，通过先前的方法(Yu et al .,2009)。纯化DNA浓度稀释到最后的100 ng /l用来测定。16 s rRNA基因放大使用引物 (GCAGAGTTCTCGGAGTCACGAAGAGTTTGATCCTGGCT CAG) and 16S-RA (AGCGGATCACTTCA CACAGGAC TACGGCTACCTTGTTACGA) 由sun进展描述等等2010核苷酸1至21是16S-FA and 16S-RA 特定的测序引物，分别地，16 s rRNA的基因实验室在自动热循环被放大(ptc - 200;MJ研究,沃尔瑟姆,美国每个样本包含1M每个核苷酸,10 pmol每个引物,10 ng细菌的DNA模板和1.0 U前任TaqTM聚合酶(豆类Bio-Co)。反响条件如下:5分钟94C,94C 1分钟,1分钟58C,72C 2分钟,30个周期,然后10分钟。然后72度下反响10分钟，解决了反响产物在1.0%琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭染色可视化，PCR产品的重要性是别离于琼脂糖凝胶使用Huashun凝胶萃取设备(Huashun,中国)。纯化PCR碎片被相应的se-quencing用于测序引物。DNA测序是由某某Sangni生物科学公司。序列进展了分析和确定使用爆炸算法(.ncbi.nlm.nih.gov/blast;Altschul et al .,1997),并提交NCBI(.blast.ncbi.nlm.nih.gov)。共识se-quences都导入到大型软件4.0版本(;田村et al .,2007),一个序列比对和phyloge-netic树创建基于neighbor-joining(NJ)方法。 l .杆菌组的区分，为进一步班别菌株l .杆菌组,进展多重PCR测定recA基于基因的引物:paraF(5-GTCACAGGCATTACGAAAAC-3),pentF(5-CAGTGGCGCGGTTGATATC-3),planF(5-CCGTTTATGCGGAACACCTA-3),和上一页(5-TCGGGATTACCAAACATCAC-3)。PCR mix-ture和amplifi阳离子进展所述Torriani et al。(2001)。结果 计数和别离的实验室7.73日志cfu ml-1,分别。革兰氏阳性和过氧化氢阴性细菌生长的MRS琼培养基被认为是假定的实验室,和185个假定实验室别离出36泡菜样品。YU et al.Vol. 58Table 2.Phenotypic characteristic of LAB isolated from natural fermented pickle in Sichuan Province, China.CharacteristicsGroups a123456789Number of isolates1624911981125ShapeRRRRRRCCCGas from glucose-+-+-Lactic acid isomer bLDLLDLDLDLDLDLNH3 from arginine-+-+-+-Growth at pH value0 c3000000000068900003415249119411051624911951105162491195112500911051120000001020Growth in NaCl (w/v)2.0%16249119511253.0%16249119511254.0%16249119511216.0%16109119511206.5%1007119510208.0%300895000010.0%000020000Growth at temperature (C)10142491190100115162491195112545003925012550000000000Acid fromD-Arabinose16240050000L-Arabinose162404350000D-Cellobiose160911950125Esculin1612911950125Galactose1624911950125Gluconate1624911950020D-Lactose022811950024D-Mannitol00811900020D-Mannose160911950125D-Melezitose00811300000D-Melibiose024011950100D-Raffi nose021011900100L-Rhamnose0001300004Ribose1624911951120Salicin160911950125D-Sorbitol00911950000L-Sorbose009000000D-Sucrose1614911950125D-Trehalose160911950005D-Xylose02403801100All strains fermented D-glucose, D-fructose and D-maltose. No strains fermented inulin, starch, xylitol or glycogen.aGroups 1 to 9 were identifi ed as Lactobacillus alimentarius, L. brevis, L. paracasei, L. plantarum, L. sakei, L. spicheri, Leuconos-toc lactis, Enterococcus thailandicus, and Pediococcus ethanolidurans, respectively.bL:L-lactic acid, DL:DL-lactic acid, D:D-lacticacid. umber of positive strains.11 / 11传统鉴定实验室根据形态、生理和生化特性,185株被分成9组(表2)。所有别离的菌种在pH值5.0,15C,2.0%,3.0%氯化钠进展生长，是15C而不是50C或pH值3.0,使他们能发酵葡萄糖、果糖和D-麦芽糖但不是菊粉,淀粉、木糖醇或糖原。十六个隔离组1被确定为l .硝化菌基于生理生化特性(路透社,1983)。他们生产L-乳酸,但不能从葡萄糖或氨精氨酸产生二氧化碳。大多数别离菌种生长良好,10C,pH值4.0和4.5,6.0%和6.5%生理盐水,但只有3株可以生长在8.0%氯化钠。这些菌株可以利用D型和L型阿拉伯糖、核糖、半乳糖,甘露糖、七叶灵,水杨苷,纤维二糖,D蔗糖,D-海藻糖和葡萄糖酸。组2包括24杆状隔离,D乳酸产生,并可能产生二氧化碳从葡萄糖和NH3精氨酸。菌株可以增长10C,pH值4.0和4.5,4.0%的氯化钠。除了10隔离未能增长6.0 - -10%氯化钠。大多数别离菌株可以发酵D型和L型、核糖D-木糖 ,半乳糖,七叶灵,D乳糖,D蜜二糖，D蔗糖 D-raffi糖,葡萄糖酸。这些菌株l . 由于其短小的特征。菌株3组达到产酸但不能产生二氧化碳和氨,生长良好,pH值3.5,4.0,4.5,9.0,4.0%,6.0%和6.5%氯化钠,在10C。这些别离株能产生酸的糖除了D蜜糖 D-乳酸,L-乳酸L-鼠李糖,D-raffi糖和D-木糖。考虑到所有的因素,这组被确定为l .干酪乳杆菌组。一百一十九组隔离4被发现与l .植物乳杆菌密切相关。他们生产DL乳酸但不能从葡萄糖或氨精氨酸产生二氧化碳。C和45C，ph为4.5、4、和6%、10、6.5%和8%的氯化钠中，。所有菌株可利用阿拉伯糖，阿拉伯糖、核糖、半乳糖、D-甘露糖、D-山梨醇、纤维二糖、D-乳糖、D-密二糖，、海藻糖、葡萄糖酸产酸产气。一株属于6组归类为L. spicheri基于自身的特性meroth et al.，2004，其中包括生产乳酸，气由精氨酸而不是葡萄糖，这种菌株可以在10C，pH值4，4.5，9和9.6，和4%，6%和6.5%的NaCl增长，但仅能发酵核糖、木糖。7组的菌株属于属leuconos TOC，产生乳酸和发酵葡萄糖产生气体，但不水解精氨酸。该菌株能生长在温度45度，pH 4，4.5和9，4%和6%的NaCl，利用核糖、木糖、半乳糖、D甘露糖、秦皮甲素、水杨酸、纤维二糖、D-密二糖、蔗糖和d-raffi鼻子。双球菌组8，iDEN蒂菲为肠球菌属，产生乳酸而不能从葡萄糖产气。他们可以生长在45C，PH值为4.5，9和9.6，在4%，6%和6.5%氯化钠。这些菌株能够利用半乳甘露糖、核糖、东星、秦皮甲素、水杨素、甘露醇、d-cello-biose，D-乳糖，蔗糖和葡萄糖。五球菌9组确定为戊糖片球菌属基于糖发酵试验。他们生产的乳酸，但不能产生气体从葡萄糖或精氨酸。大多数菌株生长良好，在45C和pH值为3.5、4和4.5，只有一株可以在4%的NaCl在10的增长他们可以利用半乳糖、D-甘露糖、鼠李糖、秦皮甲素、水杨酸、纤维二糖、D-乳糖、蔗糖和海藻糖。16S rRNA基因测序和系统发育分析确认的物种，对所有菌株的16S rRNA基因的核苷酸序列进展了分析，在NCBI的BLAST程序确定.ncbi。NLM。NIH。gov /。得到的序列约1400 bp沉积在GenBank登录号分别为：分以下gu125423，gu125424，和gu125427谷125609。系统进化树分析显示的16S rRNA基因序列之间的关系代表菌株与相关型菌株利用MEGA软件图1。1组应变imau80014是L.阿里mentarius DSM 20249t密切相关m58804具有99.7%的同源性20249t L.法典DSMm58804。应变imau80001组2和型菌株ATCC 14869t L. brevisgu125423聚为一个相似的99.8%组。3组应变imau80040放在副干酪乳杆菌JCM 8130t集群d79212具有100%的相似性。代表菌株imau80002和4组出现一样都与植物乳杆菌ATCC 14917t L. imau80005aj965482和L.戊糖乳杆菌JCM 1558td79211，和16S rRNA基因序列分析明确有99.9%的相似性属植物乳杆菌ATCC 14917taj965482和99.8% L.戊糖乳杆菌JCM 1558td79211。5组应变imau80073是L. sakei DSM 20017t密切相关am371184和他们共享99.8%的同源性。6组应变imau80039是L. spicheri LTH 5753t密切相关aj534844100%引导分析。7组和8组分imau80024 Leu应变imau80137。链球菌和肠球菌JCM 6123t ab023968thailandicus KCTC 13134tef197994，和16S rRNA基因序列显示100%的相似性型菌株。9组应变imau80011接近片球菌ethanolidurans LMG 23354tay956789和他们共享100%的同源性。基于16S rRNA基因序列分析，177杆别离泡菜准确地分配给5种1组，即L. brevis24株、副干酪乳杆菌9株，L.法典16株，L. sakei8株，L. spicheri1株和植物乳杆菌组119株，这些结果是一致的表型特征的结果。此外，8球菌均为大肠thailandicus2株，P.ethanolidurans5株，和亮氨酸。链球菌1株；然而，这些菌株均难以确定的物种水平的表型特征。多重聚合酶链反响结果多重聚合酶链反响是用来区分密切的植物乳杆菌组相关的物种。对扩增产物的大小分别为318 bp的预期为植物乳杆菌，218 bp和107 bp的L. L.戊糖乳杆菌paraplantarum。81株集团3型菌株植物乳杆菌ATCC 14917t产生318 bp的产品，而38株和型菌株L.戊糖乳杆菌JCM 1558t产生218 bp的产品图2讨论泡菜是使用传统的和古老的自然发酵法。这种独特的方法可以有效地保存有益微生物，传统1.25 CFU mL-1的日志。因为原料和泡菜温度在六个地区不同表1，所以我们认为实验室的这种差异计数可能与蔬菜的种类有关，泡菜的来源和温度。一百八十个网络实验室被隔离泡菜样品，所有菌株分为9根据生理特性，营养需求和生长的常规方法组条件。然而，基因型分析明确所有这些菌株被确定为10种。根据生理特性，在7组，8株9是确定属于肠球菌属2株，属明串珠菌1株和属片球菌5株，和16S rRNA基因序列分析明确，代表菌株形成一个良好定义的集群类型株在系统进化树。此外，4组菌株确定为属于植物乳杆菌组119菌株的表型特征的根底上，他们16S rRNA基因序列显示99.8%的相似性植物乳杆菌、戊糖乳杆菌L.。ennahar等人。2003报道称，植物乳杆菌和L.戊糖乳杆菌有很类似的16S rRNA基因序列相差只有2英国石油。在本研究中，应用多重聚合酶链反响技术对这2种植物进展了鉴别显示81株从4组确定为L.植物乳杆菌、戊糖乳杆菌，38株L.。传统的表型特征往往会产生变量为密切相关的实验室鉴定结果柳田稔et al.，2007；因此表型特征和分子生物学技术相结合，准确地在物种水平鉴定实验室。不同样本间的别离分布在表3。的主要菌株。植物乳杆菌43.8%是从所有采样别离和大多数样品，和L.戊糖乳杆菌20.5%，L.群13%和L8.6%是从法典的采样点别离。其他物种隔离与相对较低的频率，包括副干酪乳杆菌，L. sakei，L. spicheri，P. ethanolidurans thailandicus，E.，亮氨酸。链球菌。短乳杆菌和植物乳杆菌，有据报道，参与许多乳酸发酵蔬菜食品，包括泡菜、黄瓜Randazzo et al.，2004。肠膜明串珠菌、植物乳杆菌是最常见的韩国泡菜中别离细菌李、李，2010。塔芒等人。2005报告说，该专业乳酸发酵实验室的代表印度蔬菜产品被确定为L.短、植物乳杆菌、戊糖片球菌球菌和P，P亮氨酸。黄花倒水莲。公园等。2009使用的是培养独立的技术证明，几个实验室物种，如亮氨酸。菌，属短，P.球菌和植物乳杆菌，有助于复杂的泡菜发酵过程。燕等。2008指出植物乳杆菌43.6%、19.1%、亮氨酸戊糖乳杆菌L.。肠膜明串珠菌11%，L. brevis7.3%是中国泡菜的主要种类。与我们的结果相似，植物乳杆菌、戊糖乳杆菌和L. L.短通常处于不同的发酵蔬菜。清酒乳杆菌通常是从发酵的蔬菜和肉别离andrighetto等人。2001；基姆和春2005；多功能性可以局部解释它在不利的条件下生存和开展的能力条件，如低温、高盐浓度、pH值、乙醇和低水活性sorvig等人2005。乳酸菌spicheri通常是别离的酸面团meroth et al.，2004，和发酵蔬菜中是很罕见的。只有一个菌株被别离某某市某某泡菜的研究。链球菌从未在自然发酵泡菜的报道，可能是由于其复杂的营养需求，以与较弱的适应泡菜环境。然而，我们别离了一个小这些菌株的量在这项研究中。泡菜制品中微生物成分的复杂程度呈现不同的区域。我们与世隔绝新津市三种蒲江市室内植物种类，四个品种在某某市，171泡菜中乳酸菌的2012个特性崇州市七种，邛崃市，和大邑市八种。实验室的存在这种变异的菌株是不令人惊讶的，因为其他因素可能会导致变异的菌株，如样品数量，不同的生产方法，和原材料。九和十二个样本分别从崇州和大邑地区，因此，从这些地区别离到更多的物种。此外，环境温度和区域差异也会导致一些变异株。总之，本文报告参与泡菜样品识别微生物的研究。L.法典，L.短植物乳杆菌在某某主导实验室物种泡菜。其他物种，包括大肠thailandicus，副干酪乳杆菌，L. sakei，L. spicheri，植物乳杆菌，亮氨酸。链球菌体育ethanolidurans，被确定在较低的频率。物种分布取决于制造过程，以与在具体生态地区泡菜产品在哪里制造。这项研究提供的原始数据和实验室为进一步研究提供了应变资源。
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