5个酵母电转化方案

5个电转化方案方法一：咼效1收集菌体取1mlGS115过夜培养物（0D约6-10）分装到1.5mlEP管中，4C、10000g离心1min,弃上清，沉淀用无菌水（4C）洗涤，同样条件下离心，弃上清。2. 菌体处理加入1ml处理液，室温下放置20min。处理液：10mMLiAc10mMDTT0.6Msorbitol10mMTrisHCI（pH7.5）3. 离心，弃上清，加入1ml1Msorbitol，离心，弃上清，4. 用1Msorbitol洗涤二次，到最终体积约为801.（菌体太多可适当弃去部分）5. 加入10经过Bglll酶切处理的工程质粒，混匀后转入电击杯中，冰浴5min.6. 电转.1.5kv，25f200条件下进行电转。7. 电击后立刻加入1mL1Msorbitol，吸出后于30C培养2h。8. 取一定量涂平板（YPDS+Zeocin,涂布的量分别为100、200微升，剩余的经离心处理后全部涂在一个平板上）有一点要注意的是处理液中的DTT是在使用前加入，其它配好后于4度保存，DTT单独于-20度保存，可配成100倍的贮备液。方法二：按下面步骤转化,开始每个板子只长了一二十菌落;小细节修改后，每个板长了约100个.步骤如下：1、目的DNA（PPIC9K），经电泳检测已经线性化（Sall酶切）；2、DNA纯化方法是经酚仿一氯仿两步抽提后，无水乙醇沉淀的，目测定量应足够；3、GS115甘油菌经新鲜平板复苏后，5ML培养过夜，16h左右后，取菌1：100稀释，接种于70ml菌液扩大培养，14h后测得OD600约1.3左右。4、将sorbital、水和菌液均冰浴；5、菌液离心5min100ml冰水洗涤一50ml冰水洗涤一4mlsorbital洗涤，然后溶解于300ul冰sorbital；6、加入约510ug的DNA，枪吹匀，置0.2CM电转杯静置5min；7、电击，1,5KV.8、立即加入1ml冰浴的sorbital，静止10min。9、取100ul转化液，涂布10cm的MD平板。做了一点修改每块板子大概能长100来个菌落（一般需要2天左右）：1、菌液收集时间：以前可能是0D值测得不太准确，我然后把菌液分别做了1、2、4、8、16倍稀释，看其0D值是否呈线性关系。1、菌液测0D值时，建议将菌液稀释不同浓度测定，这样才准确些。菌液看上去浑浊，但0D值不高，很可能就是你的0D稀释倍数不够!你分别稀释2倍、4倍、8倍、10倍等，每个倍数做35个重复，应该可以大致推断0D值是否准确！2、我开始是先挑单克隆于5mlYPD中，过夜16h后，转接于50mlYPD中，培养大概18个小时吧。0D值是否测准可以这样估算：0D600为40左右时，菌体湿重（6000rpm离心5min）约0.95g/10ml。高密度发酵时菌体湿重将相应下降。3、电击条件等上面帖子上都有，1.5kv，放电4.85.5ms。2、其它做法相同，就是感受态做好后，最后一次吸出sorbital时，不是直接倒调的，而是用毛细管轻吸出来的，这样可能使剩下的感受态纯净些。3、最后用毛细管取出100ul出来，加入质粒，混匀！（我以前怕量不够，吸得很多，电转时效果反而不好。）4、MD板子提前几天做好，放在冰箱里，涂板的时候吸收效果会好些。如果是新板子，可能吸收不是太好，板子上有些积层，反而不利于生长。5、你说的YNB,我用的是成品，只需要直接配制。42度水浴一会，然后过滤除菌。我没有加硫酸铵。YNB是加到培养基里面的，去离子水pH偏低哦，我建议直接用蒸馏水就可以了（关系不是太大）。方法三：简便独特在筛选高表达菌种中，与大多数人和说明书有区别（成功做出几个基因）：每次转化前，均用多种酶Blgll/sall/sacl同时切，转化时，用GS115/KM71/KM71H同时转化，转化的条件也和大家一样，即1.5/25/200,但是我用的是0.1的杯子，不是0.2的，转化后涂MM及YPD+0.25G，长出菌落后，即进行大规模的表达试验，直接用YPD表达的,一般48h后即进行大量的SDS-PAGE鉴定，鉴定时，样品不用浓缩，直接上样，看到目的带后再做PCR，测序。方法四：没有转化子（无aa的YNB和硫酸铵称好后，去离子水溶解，然后高压灭菌）1. 挑取酵母单菌落，接种至含有50mlYPD培养基的三角瓶中，30C、250-300rpm培养过夜约14h，OD600约1.32. 菌液离心5min50ml冰水洗涤一25ml冰水洗涤一2mlsorbital洗涤，然后溶解于200ul冰sorbital；两管分装，每管100ul3. 加入约510ug的线性化的DNA20ul，枪吹匀，置0.2CM电转杯冰浴5min；4. 电击，1,5KV.使用的是Eppendorf2510，用于转化细菌及酵母。5. 立即加入1ml冰浴的sorbital，静止1h。将菌体悬液涂布于MD平板上，每300pl涂布一块平板；方法五：和Invitrogen公司说明书差不多的方法X33菌株于100mlYPD摇到OD600约1.1-1.3，太高影响感受态效率15001700g离心5min,将离心管倒置在吸水纸上轻轻控几下，充分弃上清（2）加入100ml冰浴的超纯水ddH2O,可在振荡器上振荡混匀，可静置35分钟离心，弃上清，再加100mlddH2O洗一遍（4）离心，弃上清，加20ml冰浴1MSorbitol洗一遍（5）离心，弃上清，菌体置于冰浴中，加入约100200ulSorbitol混匀加入Sorbitol量需自己调整，这时菌液很浓，只要能够用200ul黄枪头吸出来就可以了，一般共有约400500ul，够做几管感受态了。吸取100150ul感受态到线性化的DNA中，用枪头打匀或手指弹匀静置5min,于2mm电转化杯中，电击参数：1.5KV,25uF，200欧姆（不是400），一般放电时间在4.5-4.9ms之间，小于4说明你的DNA盐浓度太高立即加入1mlSorbitol，转入10ml离心管，30度静置1小时，然后加入1mlYPD,30度，200rpm摇1小时，取50200ul菌液涂100ul/mlYPDS板（10）一般转化效率可以达到：200个以上转化子每200ul菌液，足够筛选表达菌株了。方法六:酵母感受态细胞的制备接种PichiapastorisGS115于5mlYPD液体培养基，30C,250300250rpm,过夜。取200训的培养物接种至含有500ml新鲜培养基的三角摇瓶中，2830C、250300r/min培养过夜，一般12小时左右。将细胞培养物于4C,5000g离心5min,用500ml的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬；按步骤3离心，用250ml的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬；按步骤3离心，用20ml的冰预冷的1M的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬；按步骤3离心，用1ml的冰预冷的1M的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬,其终体积约为2ml；NOTE：可将其分装为200pl一份的包装冷冻起来，但如果保存时间过长会影响其转化效率。