细胞免疫组化

细胞免疫组化细胞爬片的免疫组化1. 细胞爬片， 5 天后进行免疫细胞组织化学染色定。2. PBS 清洗标本 3 次 各 1 min 。3 . 冰丙酮固定 15 min（ 或 4%多聚甲醛固定 30min） 。4. 空气干燥 5min 。5. PBS 清洗标本 3 次 各 2 min 。6. 0.5%Triton X-100（ DPBS 配 ） 孵育 1 次 20min 。7. PBS 清洗标本 3 次 各 2 min 。8 .3%H2O2 （试剂 A）孵育 15 min。9. DPBS 清洗标本 3 次 各 2 min 。10. 封闭血清孵育（试剂 B） 20min 。11 . 一抗孵育（滴度1: 200,湿盒）4C 过夜或37C 60 min阴性对照最好用一抗来源血清，否则用 PBS液12. PBS 清洗标本 3 次 各 5 min 。13 .二抗工作液孵育（湿盒试剂C） 37 C 30 min。14 .PBS 清洗标本 3 次 各 5 min 。15、试剂 D （湿盒）37 C 30 min。16、PBS清洗标本3次各5 min。17、 DAB显色（避光，镜下观察至棕色） 约310min。18、蒸馏水洗 2 次 1 min 。19、苏木素复染 0.51min 。20、自来水洗返蓝。21. 梯度酒精脱水 75，85， 95，100%各 3min。22. 二甲苯透明 2 次 3min。23、中性树胶封片。注意事项：1、良好的细胞爬片是进行免疫组织细胞的基础，要获得良 好细胞爬片须注意以下：a 对于粘附分子较少的细胞爬片时间要达5 天以上这样细胞爬片才较牢固冲洗时不易脱片；b 接种的细胞密度适中以 2*104/ml 为宜，若密度太高 5 天后 细胞连接成片冲洗时易脱片；2、冰丙酮固定后玻片可密闭保存于 4C 冰箱，冰丙酮固定时 会使细胞收缩，可用 80%冰丙酮或 2%多聚甲醛固定。3、冲洗时只须轻轻振荡培养皿， （不可用吸管太用力吹，易 脱片）4、加一抗、二抗后冲洗时第一次须将玻片倾斜5、Triton X-100 表面活性剂，脱去细胞膜中最主要的成分 脂质，对于抗原表达在胞浆或胞核者方使用，对于抗原表达 在胞浆者时间要控制好，使其破坏细胞膜而核膜破坏较少。细胞爬片固定后在孔板里做免疫组化还是粘到载玻片上再做？1. 如果不看荧光，两种都可以，感觉粘好了再做要快一些， 但是做的时候要防止脱落。如果看荧光，就不能用中性树胶粘，直接在24 孔，或 6 孔板里做才可以。中性树胶要折光，散射的光干扰，没办法看 细胞本身的荧光。2. 孔板里做免疫组化较方便，细胞比盖玻片易贴壁，但染色 后不能用二甲苯透明、封片（可用甘油） 。细胞爬片固定后粘到载玻片上不太可能，只有开始就让细胞 贴在玻片上爬片。3. 我没有在多孔板里做过，其实把细胞爬在盖玻片上也不是 很麻烦，偶这样做很少掉片。先将消化好的细胞悬液滴几滴在盖玻片上，由于液体的表面 张力，细胞悬液一般不会流淌到盖玻片外面，等细胞大概贴 壁后，不同细胞贴壁时间稍有不同，大概6、7 个小时，差不多贴壁再加生长液，开始滴的细胞的数量你要摸索一下， 到固定时细胞生长到 80左右比较合适。 偶是在盖玻片上做的， 首先细胞要爬的匀一些，象 dongwp 战友的就很好。然后倾去生长液冲洗、固定之后，用小镊子 或手指把玻片从六孔板拿出来。擦干盖玻片的背面，在玻片背面四周涂一点凡士林，粘贴于载玻片上，这一点很重要， 在以后的操作里会省去盖玻片经常脱落麻烦。细胞爬片的保存和抗原修复问题总结1. 细胞爬片可以用含 叠氮钠PBS液保存但不知道具体浓度，请告知多谢!加在液休中作为防腐剂的叠氮钠浓度一般为0.04-0.08%。但是我建议对于细胞爬片，还是尽量快的进 行处理，以防不必要的问题！2. louischen wrote:但我的细胞爬片经过 4%多聚甲醛固定，PBS冲洗后直接就放在了 -20度，还能用于免疫组化 吗?!应该没有问题，但是还是现作先染好些，以防抗原的 丢失3. mRNA原位杂交经4%多聚甲醛固定，固定液需加DEPC 水。其它建议用甲醇固定。-20度保存4. 如果是4%多聚甲醛固定，然后放在PBS中保存，在4度冰箱里保存两周没问题。时间再长就没试过了5. 丙酮中固定5-10分钟，然后风干，放置 4度保存过 夜应该是没有问题。不要固定过夜，蛋白质固定过度，会影 响抗原的暴露，影响免疫组化结果。如果是胞浆或胞核抗原出现假阴性结果，可考虑应用0.5%的triton-100 孵育30分 钟，渗透细胞膜。如果玻片没有经过特殊处理，不要用其他 抗原修复的方法，会造成掉片，我曾有过这方面的体会6. 丙酮固定后，PBS洗涤3次，即可保存至4度冰箱备 用。7. 细胞爬片先用TBS洗3次，每次5分钟(2) 4%多聚甲醛固定，室温，20分钟(3) 70%-80%-90%-95%-100%梯度酒精脱水，通风橱内干燥，-80度保存。2周没有问题的，我保存过2个月都有信号，不过还是保存时间短一点的好8. 我的心肌细胞爬片用不同浓度的乙醇依次脱水后，就放在室温中，因为是要拍电镜，但是学校电镜坏了 ，呵呵， 所以放了一个月后去拍，还是很好9. 细胞爬片用4%多聚甲醛或冷丙酮等固定，用PBS冲洗后，晾干，放在-20度保存一个月没有问题的。10. 细胞爬片，有机溶剂如4%多聚甲醛或冷丙酮等固定后，轻轻摇动玻片或培养皿等，静置2min左右，弃去固定液，不用PBS洗而是采用空气干燥，干燥后的标本可于-70 C 长期保存。解冻时要小心抗原破坏，应先将标本转移于干冰预冷的固定液，然后再将混合液转移至室温下，固定液到达室温时取出标本，再用 PBS冲洗，在做以后的步鄹11. 我也做过细胞爬片的组化染色，不过没有遇到类似的问题。细胞培养好后用 PBS洗一遍，然后4%多聚甲醛4度 固定 15 分钟，自然风干。室温保存几周内都可以用的。我 想这可能与抗原的类型有关，有的对氧化等损伤比较敏感， 有的差一些。最好避光保存在 4 度，同时尽量隔绝空气。免 疫荧光与普通DAB显色差别只再二抗的标记，样品的保存应 该是没有多大差别的。12. 细胞爬片丙酮固定后 -20 度保存，现在要再做免疫 荧光，将保存的爬片拿出 37 度复温然后常规操作就可以了13. 爬片做免疫组化的优势在于抗原新鲜，细胞形态保存较好。若爬片需长期保存并出现你这样的问题，原因可能 是： 1）试验步骤有误，建议重复并加阳性对照片。2）加一抗前处理同石蜡切片， 可进行抗原修复， 如胰酶消化或热修复。 3） 因为抗原抗体反应在液相中进行，故对已极度干燥的爬片 充分水化很重要。建议试验前用PBS浸泡过夜。如不能解决你的问题请QQ联系：81825645。本人在湖南省肿瘤医院病 理科（长沙市 ）做免疫组化。14. 4% 多聚甲醛或冷丙酮固定都可以，也有用无水酒精 的，固定好后放 -20 度， 2-3 个月是没有问题的。15. 对于一般的细胞免疫组化，我的做法是：细胞爬片 用冰的纯丙酮固定 20MIN,再在通风柜将丙酮吹干，一-20 度保存，用丙酮固定作用是沉淀蛋白质和糖，穿透性很强， 保存抗原的免疫活性好。所以丙酮常用做细胞细胞爬片的固 定剂。当然还是要根据你的实验目的决定用那种固定剂。如：1.多聚甲醛（常用4%）:可用于免疫电镜；也可用 于免疫荧光染色。主要检测组织内一些性能娇弱的抗原特别是细胞表面抗原，例如各类淋巴细胸分化决定簇（CD）、主要组织相容性抗原等2. 乙醇。优点：穿透性强、抗原性保存较好。缺点： 但醇类对低分子蛋白质、多肽及胞浆内蛋白质保存效果较差，使蛋白变性的作用轻，固定后可再溶解；染色过程中，温育时间长，抗原可流失而减弱反应强度3. 甲醛（福尔马林）应用最广 优点：形态结构保存好，且穿透性强，缺点：甲醛放置过久可氧化为甲酸，使溶液pH降低，影响染色；分子间交联形成的网格结构可能部分或 完全掩盖某些抗原决定簇，使之不能充分暴露。可造成假阴性的染色结果。16. 4度是不能保存这么长时间（1个月）的，如果抗原 已被分解，再修复也没用！17. 弃去固定液，不用 PBS洗而是采用空气干燥，干燥 后的标本可于-70 C长期保存。18. 爬片置于37度PBS中洗三次，每次 3到5秒钟， 然后在4%多聚甲醛中固定15分钟，然后再用37度去离子水 将甲醛冲干净，注意手法轻柔，要不然掉片很厉害。同时操 作过程中注意玻片的正反面，要不然真的是前功尽弃。将做好的爬片置于滤纸上晾干，然后用中性树胶粘在载玻片上。注意一定要等中性树胶彻底干了之后才能做后续 实验，要不然玻片会掉下来的，就又是前功尽弃了做好的细胞爬片可以放在-20保存备用，具体能保存多长时间不太 清楚，当然尽量早用。19. 固定后放点PBS然后放在4度冰箱中保存，我最 长保存两个月的，然后再做免疫组化，应该没有太大的问题 的。20. 固定后4度可以存放一周，-20度存放半年，我现 在也要做这个，实验室老师教的。21. 四度放1周应该没问题的，你最好放在 -20度，我 在-20度放一个月都还出结果的.很多人作的片子很多，不可 能一次作完，一个月没问题.22. 最佳的固定及保存方法：（1）中性缓冲福尔马林（不必调pH）:福尔马林（40%甲醛，用时加入过量碱式 MgCO沖和）10.0mlNa2HPO4.12H2o 1.9653gNaH2PO4.2H2O 0.5460g 加0.85 %NaCI溶液溶解，定容至 100ml。(2) 细胞固定：待细胞接近长成单层时，用镊子取出 盖玻片，迅速于37C PBS中漂洗2次，每次3-5秒，以清除 血清。(3) 将盖玻片投入中性缓冲福尔马林溶液中室温固定30min。(4) 用镊子取出盖玻片，PBS漂洗2次，每次3-5秒， 晾干保存于-20 C备用。可长期保存，做实验时，取出片子，入PBS湿润后即可进行你的实验。可以用于做免疫细胞化学(H.E.)或免疫荧光。(本帖 没有加分)23. 细胞爬片固定以后要放在-20度的冰箱.1个月内可 以用.24. skywalkerzz wrote:过氧化氢处理这一步，用三蒸水稀释商品浓度为 30%勺过氧化氢，然后室温下玻片放在其 中浸泡10min，是不是过氧化氢导致细胞严重脱片？爬片应该用甲醇/双氧水，你的细胞极可能是过氧 化氢导致严重脱片25. 本人比较喜欢用4%得多聚甲醛，20分钟很好用的。保存的时候注意片子最好晾干，不要挤压，防止粘片和碎裂。26. 细胞爬片固定好以后，如果要保存，我们的做法是 倒掉固定液，PBS漂洗后干片保存在 4度，最长半年没问题。27. 1、用新鲜配制的预冷的 4%多聚甲醛缓冲液室温固定15 min，PBS (0.01 mol/l, pH7.4) 洗涤3遍后是否就可 以进行免疫细胞化学染色了2、爬片PBS (0.01 mol/l, pH7.4) 洗涤3遍后是否 能保存，怎样保存？1、洗过就可以做免疫组化了。2、 固定过后自然干燥，不要洗，-20度保存。做之 前再洗。28. 细胞固定最好用丙酮或酒精，不要用4%多聚甲醛，以免抗原交联，这样组化时不用再抗原修复。细胞固定后可 室温保存在丙酮中，不使之干燥。29. 如果是检测膜上的物质，好象不能用酒精，30. 适当密度后取出固定(丙酮-20固定1020min), 再进行免疫染色。31. 一批细胞爬片，如果细胞爬片是在玻璃上，冷丙酮 固定15-20分钟，然后放-20度，没有问题。如果细胞爬片是在24孔板或6孔板里进行，冷丙酮 会腐蚀板子，最好 4%多聚甲醛。32. 细胞爬片用纯丙酮固定10分钟，取出干燥后用锡纸包裹，-70度保存。33. 4%多聚甲醛固定后 PBS水洗，自然干燥后用锡纸包裹，-20度冻存不超过1月34. 如果细胞贴壁困难，可将片子先用纯血清挂一层， 凉干后再养细胞。35. 可以买NUNC公司的专用细胞培养用盖玻片，商品名Thermanox™ Coverslips 。高分子材料，耐高温灭 菌，经过特殊表面处理，细胞容易贴附。可以用剪刀任意裁 剪，使用效果好。上海生工有现货，不用国外定货。我使用石，觉得效 果比玻璃盖玻片效果好很多。36. 我们通常是把细胞玻片固定好后，用PBS冲中洗干净，然后用酒精脱水（80%, 90% 100% 100%酉精各一次，每次 10分钟左右），然后放在烘箱里烘干，这是就相当于石蜡切 片了，可以保存一定的时间。这个方法我们试过的，保持一段时间后做，效果还是 可以的。免疫细胞化学染色操作规程一、材料和1、 玻片：须用免疫组化专用玻片，或用2%多聚赖氨酸包被处理玻片。2、5-10%正常山羊血清封闭液，用 PBS配。3、3%牛血清白蛋白（BSA）,用PBS配。4、0.01M PH7.4 PBS5、1% BSA-PBS（含 0.05% Tween20）6、AEC底物（1）底物缓冲液（ 20X） PH 4.6 醋酸（分子量 60.6 ）30.6mlTriton -100醋酸钠3H2O （分子量136.1 ） 66.68克加蒸馏水到960ml，调PH到4.6，最后加蒸馏水到总体积1000ml（ 2） AEC（ 20X）AEC 15mg/ml，溶在DM（二甲基甲酰胺，分子式 HCOH（CH3）2 分子量 73.10 中）（3） 0.6% H2O2（20X）临用时，（1）（2）（3）各 50ul ，在 1ml 双蒸馏水中混匀 30 分钟内有效。7、DAB （即卩 DAB-4HCL（1）1.5 克 DAB在 100ml 水溶液中（20X）（2） 1M Tris （ 20X），用 HCL调 PH到 7.4（ 1）（ 2）（ 3）各滴加入 1ml 二蒸水中，新鲜配，避光， 30 分钟内有效。溶解后（可加热到 500C），加水合氯醛50克（水合氯醛Chloral Hyclrate ，分子量 165.4 ），枸橼酸 1 克，充分溶解， 于棕色瓶中，室温或 40C 保存。8、苏木素复染液苏木素 1 克碘酸钠 0.2 克钾矾 50 克水 1000ml9、含10%及 2%小牛血清的DMEM培养液。10、3%H2O：2 30% H2O2 1 份，加 9 份双蒸水，临用时配。11、细胞抗原玻片及 96孔细胞抗原板 （见 ICC protocol 04）12、封片液： 1 克明胶，溶于 30ml 350C 水中，加入 35ml 甘油（或用甘油圭寸片）和650mg石碳酸（先溶于0.6ml水中）。二、细胞内源过氧化物酶阻断（使用HRP标记二抗或SP法时必须阻断）1、从冰箱取出细胞片或细胞板， 置室温或 370C 10-15 分钟， 使恢复温度。2、力口 3%H2O2细胞片20ul/孔，培养板100ul/孔，使充分 覆盖住细胞。3、室温10分钟后，甩掉H2O2用PBS轻轻淋洗2分钟。用滤纸吸干细胞周围水份， 96 孔在滤水纸上扣干， 但注意保持 细胞湿润。三、圭闭细胞片用5-10%正常山羊血清（20ml/孔），细胞板用2-5%BSA(PBS配制)100ul/孑L,置370C孵育30分钟后甩掉封闭液， 不洗。四、免疫化学染色1 、分别加一抗和所有对照一抗，细胞法 10-20ul/ 孑，细胞 板50ul/孔，使充分覆盖细胞。37C 1小时或4C冰箱过夜；2、 弃去一抗，如为细胞涂片用PBST轻轻简单淋洗1次后，浸于100mL含PBST洗杯，漂洗(最好在慢速摇床上) 3-5分 钟，转入第二杯 PBS( 1000ml)，如上法漂洗3-5分钟。擦干 细胞片周围水分，96孔板则倒掉一抗后，每孔加满PBST在摇床上摇洗 3-5 分钟后倒掉，在滤纸上扣干，但保持细胞湿 润，反复 3-4 次；3、加 S.P( S.P 法，即放大法)( 1)加已优选好的浓度的 Biotin 标记二抗，细胞片 10ul/ 孔，细胞板50ul/孔，使充分复盖细胞。37C温和孵育30分 钟；( 2)按免疫化学染色 “2” 所述方法洗涤和擦干；(3) 加已优选好浓度的 S.P,用量同“ (1) ”, 37C孵育30分钟后按免疫化学染色 “2”法洗涤 及擦干；4、间接法加二抗(不放大法)方法同S.P法，但不用Biotin 标记二抗，而改用 HRP直接 标记二抗。并省略( 3)步骤；5、加底物显色（1）、加足量的AEC显色液，充分覆盖细胞层，细胞玻片20ul/ 孔，板50ul/孔，置于37C恒温箱孵育5-10分钟，一般在 显微镜下根据结果颜色的呈现情况掌握染色时间，以得到满 意的结果（阳性对照显色程度为 “+” ），用 自来水即可终止反应；（ 2）、复染：苏木素染液（使用时间最好不超过两个月）加 苏木素复染液 1-2 滴， 1 分钟左右，在自来水龙头下轻轻冲 洗掉苏木素，再浸于 PBS中约30秒钟返蓝色，最后在蒸馏 水中漂洗。6 、封片洗后细胞片擦去周围水分，滴加 1 滴甘油明胶封片液，加 盖玻片，除去气泡，用指甲油或树胶封固玻片。五、结果判 断KSHV 阳性诱导后 BCBL-1 细胞有 10%-30%显红色， 强度不一，未诱导 BCBL-1阳性细胞（1-30%）阴性诱导和未诱导 BCBL-1 细胞完全不显色（排除边缘效应）MCMV/HVMV 阳性感染病毒的细胞有病灶反应，显红色， 强度不一， 未感染细胞不显红色 （排除非特异性染色） 阴性感染细胞和未感染细胞不显红色 1、一抗、二抗的稀释采用 1%BSA/PB，S Sterptavidin-HRP 的稀释采用 PBS2、整个反应过程在湿盒中进行（细胞片）3、洗涤时应使用染色缸（细胞片）六、说明 1、测血时一抗血清稀释度要求 项目 KSHV MVMV HCMV 其 它稀释度 1:501:100,1:2001:501:100,1:2001:100，1:500,1:10001:1001:500,1:1000可融合标准1:100阳性时1：100 阳性1： 500 阳性1：500 阳性 2、S.P 法使用二抗的不同情况项目 MCMV HCMV 其它样品 母、亚上清 血清、母、亚上清 血清、母克隆、亚克隆细胞培养上清一抗为 IgG 型，Biotin 标记二抗 Biotin-Anti mouse IgGF（ab）2,SIGMA,CAT:B6774一抗为 IgM 型，Biotin 标记二抗 Biotin-Anti mouseIgGAM,ZYMED,CAT:62-6440稀释度 1 ： 2003、间接法（不放大法）使用二抗的 不同情况项目 MCMV KSHV样品 血清 血清、母克隆、亚克隆细胞培养 上清一抗为 IgG 型，HRP标记二抗HRP-Anti mouse IgGFc,1:100,SIGMA,CAT:A-0168一抗为 IgM 型，HRP标记二抗HRP-Anti mousePOLYVALENT,1:100,SIGMA,CAT:A-0412稀释度 1： 1004、对照系统，必须要做的对照系统如下：阳性对照：标准一抗，阳性血清，阳性上清阴性对照： （1）阴性一抗对照：小鼠免疫前血清、测上清时用原克隆 上清液（2）阴性抗原细胞对照：未感染病毒的细胞，每个 待测及对照均须做阴性细胞对照空白对照：不加一抗，用1%BSA替代无关对照：与本项目无的第一欢迎您的下载，资料仅供参考!致力为企业和个人提供合同协议， 策划案计划书，学习资料等等打造全网一站式需求