乳清蛋白质检测方法

乳清蛋白质检测方法乳品屮蛋白质测定常用方法有凯氏定氮扛和分光光度眩、双缩腮袪、福林苯酚法及考马斯亮兰比色法等-凯氏定氮法是先将蛋白食品力II热消化分解使氨与硫酸结合得到硫酸馁用滴定法，绘后通过换算定起蛋白质。凯氏定氮法所测蛋白质为食品总蛋白质含最蛋白氮和非蛋白氟Z和）凯氏定氮法是广泛被认口J的检测蛋白质最可信的方法.用于检测各种徴品中蛋白。分光光度法是近年来逐渐应用在蛋白检测中的方其原理也是先将蛋白消化得到硫酸技，通过与显色剂作用得到毗喘类化合物，在400nm波长下侧吸光度*与标准比较再换算定量蛋白“考马斯亮兰比色法是在1976年，布拉德福德等人提出的一种微量蛋白质检测的方袪，它是在酸性条件K考马斯亮兰屮的疏水慕团与蛋白质屮疏水区域之间发主疏水相互作用力而结合产生一种染色复合物使溶液变为蓝色苴最人吸收波长变为59弘血且在一定蛋白质含定范曲内蛋白质-考马斯亮兰复合物在最人吸收波长处的吸光度与蛋白质含届符合朗贝比尔定律因而可用F蛋白质含屋分析。此法检测快邀、高灵敏度和操作简单及成本低，但近年来人们对考马斯亮兰与牛血清蛋白的反应机理研究发现配逻显色液的乙醇浓度、磷酸盐浓度、H含屋、XaCL含量等会影响吸收光谱，如显色液中磷酸盐偏高、其蛋白染色复合物的吸收波长会降低：NaCl含最增加，染色复合物的吸收波长也会降低等*理论上这种染色复合物的最大吸收波长在590-600nma因此，在配置显色剂的乙醇、磷酸等试別最一定时，需要选择合适的测定波长，他得测定方法有较高的灵敏度，测定值更接近真值W以上儿种蛋白测駅方法都只能检测乳清液屮的总蛋白质，不能膛测乳清屮不同的蛋白质种类.即不能检测单一蛋白*蛋白质种类定性检测最常用的方法是电泳込目前电泳法虽没有将乳清中所有蛋白或多肽都分离检测出来*但已有文献表明电泳法能将乳球蛋白和乳白蛋白很好的进行分离.且结呆良好、方法简单。电泳条带颜色深浅与蛋白含最Z可有线性关系，条带颜色越深表明蛋B含最越高，因此可用丁-探究电泳法测駅乳清液中乳球蛋白和乳白蛋B含駅本文探讨考马斯亮兰比色法、分光光度法测乳清中的蛋白质含量，结果与凯氏定氮注进行比较：用SDS-PAGE凝胶电泳汕结合凝胶成像仪分析乳清蛋白分子龟，检测乳清中含廣堆大的两种蛋口质（。-乳口蛋白和乳球蛋白）含最。考马斯亮兰（G250）,国药集团化学试剂有限公司；乳清，山东省农科院兴牛乳业有限公司，马苏干酪副产物；丹麦阿拉浓缩乳清蛋白粉（WPC80,蛋白质含量78.50%）,上海诺申仅品有限公司；牛血清白蛋白（BSA）标准品,广州浩玛生物科技有限公司。a乳白蛋白、B乳球蛋白标准品,SigmaChemicalCompanyo仪器与设备分光光度计（V-1100D）上海美谱达有限公司：凝胶成像系统仪（LANE1D）北京赛智创业科技有限公司；电泳仪（DYY-2C型）北京市六一仪器厂；电子大平（YP3001N型）上海精密仪器科仪器有限公司；数显恒温水浴锅江苏金坛市金城国盛实验仪器厂；自动凯氏定氮仪（SKD08S2）上海沛欧分析仪器有限公司电热恒温鼓风干燥箱（DHG-9140A型）上海精宏实验设备有限公司；其他试验仪器为实验室常用仪器。2.2试验方法考马斯亮兰比色法2.2.1.1考马斯亮兰G-250溶液的配制：准确称取考马斯亮兰G-250lO.OOmg,加入95%乙醇50mL溶解、85%磷酸lOOmL,溶解充分后用蒸懈水定容至IL棕色瓶屮备用。蛋白质对照品溶液的配制:准确称取10.00克牛血清白蛍白溶上蒸锚水屮并稀释至lOOmL得到蛋白质对照品溶液浓度为O.lmg/mL,存放在4C冰箱中。2.2.1.3分别吸取蛋白质对照品溶液0.0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8mL于具塞试管中,分别补加水至ImL再加4mL考马斯亮兰G-250溶液，摇拌均匀并放置10min后测吸光度，从579nm到621nm吸光度测定频率每隔2nm一次，每组实验分别做三次平行。供试品溶液制备：取一定最浓缩乳清蛋白粉用蒸懈水溶至lOOmL并以3000r/min离心15min,过滤去除上层乳脂，取1OmL中间滤液J：lOOmL容量瓶中定容，待测；取一定量马苏干酪乳清液，按上述离心过滤，定容到100mL,待测。按2.2.3方法步骤取供试品溶液0.5mL测吸光度，同时作3个重复。（1）显色剂配置：取7.8mL乙酰丙酮和15mL甲醉混介，蒸帑水稀释到lOOmL,震荡摇匀后室温卜放置3夭使用。（2）标准工作曲线的绘制：称取1O5C干燥2h后的0.4720g硫酸钱用蒸锚水溶解稀释到1OOmL,再稀释10倍得到0mg/mL标准储备液，分别吸取0.00、0.05、（）.1（）、0.20、0.40、0.60、O.XOmL及l.OmL标准液J-10mL比色皿中,用蒸镭水水稀释至刻度么前添加4.0亳升乙酸钠乙酸缓冲溶液和显色剂4mL,定容摇匀后水浴加热反bV15min,再冷却到室温，以不同含氮晟浓度为横轴，400nm波长处所测吸光度为纵轴作标准曲线.（3）样品消解处理：楕确称取一定帚样胡试剂到250mL干燥的定氮瓶中，先后添加硫酸铜O.lg和硫酸钾lg及浓硫酸5mL,摇匀，放一小漏斗到瓶II并45。角固定在小孔石棉网I：，小火慢慢加热至全部炭化和没有泡沫产生，火力加强使瓶内微沸至颜色变化为透明清澈的蓝绿色液体，再继续加热半小时。小心取卜S放冷，沿壁加水约20mL,再放冷，转到容战瓶中，多次少駅水洗定氮瓶并入容帚瓶中，补加水到刻度lOOmL,混匀,待测何。SDS-PAGE法检测乳清蛋白测蛋白质电泳方法参见文献【幻,采用不连续凝胶系统,配置12%分离胶和3%浓缩胶，依次注入双垂宜电泳槽胶室中,凝固成胶后,放入缓冲液槽中,将电流控制在1520mA，分别加入10微升标准蛋白样品液和待测蛋白质样胡液，等待样品进入到分离胶把电流升到305（）mA,电泳结束是以滾酚蓝染料距凝胶底部lcm为准,将胶转移到大培养皿中，加入固定液（由50%甲0454mL和冰醋酸46mL混匀制得）周定2h后改用考马斯亮兰染色液染色4h,多次用蒸帑水漂洗再每隔4h换一次脱色液（介冰醋酸75mL,甲醇50mL.蒸帑水875mL）,等到蛋白区带清晰后结束用凝胶成像系统拍照并对比标HI:marker分析蛋白分f就皿】分别加入1011含0.5、1.0、2.0、4.0pg的标准B乳球蛋白或标准a乳白蛋白1.0、2.0、4.0、8.0Mg,按上述操作得到电泳图，根据条带倉最定帚分析这两种蛋白的含HL2.3结果与分析2.3.1考马斯亮兰比色法检测蛋白质考马斯亮兰蛋白染色复合物的最大波长确定图2.1不同蛋白溶液的波长吸光度考马斯亮兰比色法的显色液是由乙醇、磷酸和考马斯亮兰配制而成，其中乙醇是溶剂,对显色影响不大,而考马斯亮兰、磷酸、及其配置对显色冇影响，因此采用考马斯亮兰比色法测蛋白前，为了减少误差，最好先测其吸收波长。在波长571“21nm范|稠内,毎隔2nm波长测定浓度为10、20,40,60、80ug/mL的蛋|质吸光度与试剂空白吸光度差值见图2.1低蛋|浓度（10、20ug/mL）最人吸收渡长在580598Z间变化不明显，但高蛋11浓度（40、60、80ug/mL）最人吸收波长为589nm该试剂推荐的波长为595nm,但本实验波长589nm在考马斯蛋门染色复合物最人波长理论值附近，偏差不人，故选589nm作为考马斯亮兰最人吸收波长。显色液组分及显色液I/L沾蛋白质之间的作用对光谱吸收的形响机理还冇彳孑进一步研究。标准工作曲线的确定用考马斯亮兰显色液测10、20、40、60、80ug/mL标准牛血清白蛋白溶液在589nm波长处的吸光度,以蛋门浓度为横坐标、吸光度为纵坐标绘图2.3.2,回归方程为y=0.0069x+0.0275，标准曲线在1080ug/mL的蛋白范I羽内符合朗贝比尔定律，以试剂空门吸比度的3倍标准偏总il舁检出限为0.024ug/100mL,标准谋总RM.9979,线性关系良好。100508642oooOV燮来超不同蛋门质浓度/(ug/mL)图22蛋白质标准曲线分光光度法检测蛋白质2.3.2.1工作曲线的确定分光光度法是将蛋门质消化后的硫酸钱与显色剂反应得到的毗碇化介物在400nm波K卜测吸光度，号标准系列比较赵笊得到蛋含吊：而凯氏定氮法是先用碱化蒸怖使氨游离，再用硼酸吸收，硫酸滴定。比较而言，分光光度法的操作过程比凯氏定氮法简单很多,取定量硫酸钱标准溶液绘制标准曲线如图2.3,在介氮駅0l00ug/mL范川内符介朗贝比尔定律，丁作曲线冋归方程为y=00060x00132,2=0.9996,线性关系非常好.准确性高。765432100.0.0.0.0.0.0.II550不同魁标准就/(ug/ml.)图2.3分光光度法标准曲线2.3.2.2不同方法检测样品含量的比较本实验将凯氏试剂配好后,采用门动凯氏定氮仪检测标准浓缩乳清蛋白粉和乳清液含最，凯氏定氮法测得标准浓缩乳清蛋白粉介最78.46%(约为实际值7&50%),此凯氏定氮法是检测乳清蛋白质城14依的方法。将分光光度法和考马斯亮兰比色法所测的浓缩乳清蛋白粉和十酪乳清液中蛋门仟駅与凯氏定氮法测IR值比较,如表2.1。分光光度法与凯氏定氮法测量值相近,无显著差异,为样品总蛋白质的含最;考马斯亮兰法所测值比凯氏定氮值略偏低.结合考马斯亮兰法测蛋白原理可知，所测值为乳清屮真蛋白质的含最。因此分光光度法和考马斯亮兰比色法都可作为检测乳清蛋白质的方法，且操作都比凯氏法简单。表2.1不同方法测蛋白质含量的比较法检测乳清蛋白样品凯氏定氮法分光光度法考马斯亮兰比色法WPC8078.46%78.21%7434%乳清液0.66%0.67%0.61%乳清蛋白是一种低分子量蛋白，因此本试验采用低分子量蛋白marker。根据电泳条带在泳道中的位置分析蛋白分子量。干酪乳清液屮蛋白分子量如图2.4,图中最左边泳道为标准蛋白marker条带，其电泳条带的蛋白分子鼠从上至下依次为97.4、67.0、43.0、31.0、20.1及14.4KDa,最右边泳道为乳清蛋白液泳道,通过凝胶分析软件得到乳清中主要的蛋白质分子量为:67.73、51.71、31.73、23.94、18.74、14.14KDao分子量小的蛋白电泳移动的快，其条带在泳道卜方，分子量人的移动慢，在泳道上方。12%的分离胶浓度能较好的分离乳清屮主要的蛋白质，因此采用电泳方法能很好的定性分析乳清蛋白分子量。图2.4蛋白分子量电泳图图2.5屮第2、3、4、5泳道（从左往右数）为不同浓度的标准卩.乳球蛋白样品，最右边泳道为乳清样品，随着乳球蛋白含量增加，条带含最增多，以0.5、1.0、2.0、4.0Mg/10Ml的标样浓度为横坐标，条带含最为纵坐标绘图如图2.6所示，在0.540ug/mL范围内表现出良好的线性关系。工作方程为y=2.41X10x+4.40X102=0.9268，根据乳清中B乳球蛋白条带含量分析得到B乳球蛋白含量占总乳清蛋白含最的38.27%；电泳法直接定最蛋白不需要分离乳清蛋白，减轻试验负担，减少试验过程中蛋白损失，特别适合多种混合蛋白的定最分析，但电泳条带分离不清晰，条带周别有拖尾毛糙现彖，因此电泳定最分析乳球蛋白技术还需要进一步对试齡条件，样品脱色等讲行优化外理。OTN七$兰一汨图2.5乳球蛋Fl电泳图图26b乳球蛋白含晴标准|出线H2.7为乳白蛋白电冰图,第I条冰道为标准蛍Amarker条带,2、3、4、6泳道(从左往右数)为不同浓度的标准a乳球蛋E样品,最右边泳道为乳清样品,从图可知，标准蛋白电泳条带中的位置非常一致.且師着蛋白加入最的增加,电泳条带颜色増加加深.以1.0、2.0、4.0、X.0pg/10pl的标样浓度为横坐标,条带含晴为纵坐标绘图2.X,在1.08.()ug/mL范用内线性关系良好，I.作方丘为y=3.6X1O5x+5.5X1O5,2=0.995().根据乳诸样阳条带倉磺分析紂到a乳门蛋门占总蛋白279%5O22S4H5O22S4H505*川U冷图2.7Q乳白蛋白电泳图y20823x5.0748R=0.9782图2.8Q乳白蛋白含最标准曲线图