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专题专题2微生物的培养与应用微生物的培养与应用第四十四课时课题第四十四课时课题13 微生物的实验培养、微生物的实验培养、 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数、 分解纤维素的微生物的分离分解纤维素的微生物的分离1.微生物的分离和培养微生物的分离和培养2.培养基对微生物的选择作用培养基对微生物的选择作用3.利用微生物进行发酵来生产特定的产物利用微生物进行发酵来生产特定的产物【回扣教材回扣教材】 考点一培养基考点一培养基 1培养基的定义：人们按照微生物对培养基的定义：人们按照微生物对 的的不同需求，配制出供其不同需求，配制出供其 的营养物质。的营养物质。营养物质生长繁殖 2类型：培养基按照类型：培养基按照 可分为液体培养基可分为液体培养基和固体培养基。在液体培养基中加入凝固剂和固体培养基。在液体培养基中加入凝固剂 后，后，制成琼脂固体培养基，是实验室最常用的培养基之一。制成琼脂固体培养基，是实验室最常用的培养基之一。微生物在固体培养基表面生长，可以形成微生物在固体培养基表面生长，可以形成 的的 。物理性质琼脂肉眼可见菌落 3营养物质：各种培养基一般都含有水、营养物质：各种培养基一般都含有水、 _源、源、_源和无机盐四种营养物质。满足微生物生长还需源和无机盐四种营养物质。满足微生物生长还需要适宜的要适宜的_(培养霉菌时需要将培养基的培养霉菌时需要将培养基的pH调至酸性，调至酸性，培养细菌时需将培养细菌时需将pH调至调至 或或 性性)、氧气的要、氧气的要求求(根据微生物的需求提供有氧或无氧环境根据微生物的需求提供有氧或无氧环境)、 物质物质(如培养乳酸杆菌时需要在培养基中如培养乳酸杆菌时需要在培养基中添加添加 等等)。碳氮中性微碱特殊营养维生素pH 这种新型抗生素对细这种新型抗生素对细菌生长无影响；或这种新型抗生素对细菌的生长有抑菌生长无影响；或这种新型抗生素对细菌的生长有抑制作用制作用蛋白胨和酵母提取物蛋白胨和酵母提取物bedca 杀死活杀死活的微生物的微生物杀死杀死24小时中由细菌芽孢萌发而生长的微生物小时中由细菌芽孢萌发而生长的微生物 将培养基在将培养基在37 下放置下放置35天天,如果无微生物生长如果无微生物生长,则证明培养基已达则证明培养基已达到灭菌效果到灭菌效果 将圆片在不添加任何抗生素的无菌水中浸泡一段将圆片在不添加任何抗生素的无菌水中浸泡一段时间时间平板划线或稀释涂布平板平板划线或稀释涂布平板不能转动绒布不能转动绒布见下图见下图考点二无菌技术考点二无菌技术【回扣教材回扣教材】获得纯净培养物的关键是防止外来获得纯净培养物的关键是防止外来_的入侵，要的入侵，要注意以下几个方面：注意以下几个方面：(1)对实验操作的对实验操作的_、操作者的、操作者的_和和_进进行行_和和_。(2)将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等器将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等器具进行具进行_。(3)为避免周围环境中微生物的污染，为避免周围环境中微生物的污染，_应应在酒精灯在酒精灯_进行。进行。(4)实验操作时应避免实验操作时应避免_处理的材料用具与处理的材料用具与_的物品相接触。的物品相接触。杂菌杂菌空间空间衣着衣着手手清洁清洁消毒消毒灭菌灭菌实验操作实验操作火焰附近火焰附近已经灭菌已经灭菌周围周围B考点三纯化大肠杆菌以及菌种的考点三纯化大肠杆菌以及菌种的保藏保藏【回扣教材回扣教材】1制作牛肉膏蛋白胨固体培养基制作牛肉膏蛋白胨固体培养基(1)方法步骤：方法步骤：_、称量、溶化、称量、溶化、_、_。(2)倒平板操作的步骤：倒平板操作的步骤：计算计算灭菌灭菌倒平板倒平板将灭过菌的培养皿放在将灭过菌的培养皿放在_的桌面上，右手的桌面上，右手拿装有培养基的锥形瓶，左手拔出棉塞。拿装有培养基的锥形瓶，左手拔出棉塞。右手拿锥形瓶，将右手拿锥形瓶，将_迅速通过火焰。迅速通过火焰。用左手的拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶用左手的拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，右手将锥形瓶中的培养基口的缝隙，右手将锥形瓶中的培养基(约约1020 mL)倒入培养皿，左手立即盖上培养皿的皿盖。倒入培养皿，左手立即盖上培养皿的皿盖。等待平板等待平板_，大约需，大约需510 min。然后，。然后，将平板倒过来放置，使培养皿盖在下、皿底在上。将平板倒过来放置，使培养皿盖在下、皿底在上。火焰旁火焰旁瓶口瓶口冷却凝固冷却凝固2纯化大肠杆菌纯化大肠杆菌(1)微生物接种的方法最常用的是微生物接种的方法最常用的是_法和法和_法。法。(2)平板划线法是通过平板划线法是通过_在琼脂固体培养基表面在琼脂固体培养基表面_的操作。的操作。(3)稀释涂布平板法是将稀释涂布平板法是将_进行一系列的进行一系列的_稀 释 ， 然 后 将 不 同 稀 释 度 的 菌 液 分 别 涂 布 到稀 释 ， 然 后 将 不 同 稀 释 度 的 菌 液 分 别 涂 布 到_ _ _ _ _ _ _ _ _ 培 养 基 的 表 面 ， 进 行 培 养 。 分 为培 养 基 的 表 面 ， 进 行 培 养 。 分 为_和和_两步。两步。(4)用平板划线法和稀释涂布平板法接种的目的是：使用平板划线法和稀释涂布平板法接种的目的是：使聚集在一起的微生物聚集在一起的微生物_成单个成单个_，从而能，从而能在培养基在培养基_形成单个的形成单个的_。平板划线平板划线稀释涂布平板稀释涂布平板接种环接种环连续划线连续划线菌液菌液梯度梯度琼脂固体琼脂固体系列稀释操作系列稀释操作涂布平板操作涂布平板操作分散分散细胞细胞表面表面菌落菌落 (5)平板划线法操作步骤：平板划线法操作步骤：将接种环放在火焰上将接种环放在火焰上_，直到接种环，直到接种环_。在火焰旁在火焰旁_接种环，并打开盛有菌液的试管的接种环，并打开盛有菌液的试管的棉塞。棉塞。将将_通过火焰。通过火焰。将将_的接种环伸入菌液中蘸取一环菌液。的接种环伸入菌液中蘸取一环菌液。将将_通过火焰，并塞上棉塞。通过火焰，并塞上棉塞。灼烧灼烧烧红烧红冷却冷却试管口试管口已冷却已冷却试管口试管口左手将皿盖打开一条缝隙，右手将沾有菌种的接种左手将皿盖打开一条缝隙，右手将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，划三至五条环迅速伸入平板内，划三至五条_，盖上皿，盖上皿盖。注意不要划破盖。注意不要划破_。灼烧接种环，待其冷却后，从第一区域划线的灼烧接种环，待其冷却后，从第一区域划线的_开始往第二区域内划线。重复以上操作，在开始往第二区域内划线。重复以上操作，在三、四、五区域内划线。注意三、四、五区域内划线。注意_将最后一区的将最后一区的划线与第一区相连。划线与第一区相连。将平板将平板_放入培养箱中培养。放入培养箱中培养。平行线平行线培养基培养基 末端末端不要不要倒置倒置 (6)涂布平板操作的步骤：涂布平板操作的步骤：将将_浸在盛有酒精的烧杯中。浸在盛有酒精的烧杯中。取取_菌液菌液(不超过不超过0.1 mL)，滴加到培养基表面。，滴加到培养基表面。将沾有少量酒精的涂布器在火焰上将沾有少量酒精的涂布器在火焰上_，待酒，待酒精精_后，后，_810 s。用涂布器将菌液用涂布器将菌液_地涂布在培养基表面。地涂布在培养基表面。涂布器涂布器少量少量引燃引燃燃尽燃尽冷却冷却均匀均匀3菌种的保存菌种的保存(1)对于频繁使用的菌种，可以采用对于频繁使用的菌种，可以采用_保藏的方法。保藏的方法。临时保藏方法临时保藏方法将菌种接种到试管的固体将菌种接种到试管的固体_上，在上，在_的温度下培养。当菌落长成后，将试管放入的温度下培养。当菌落长成后，将试管放入_的的冰箱中保藏。以后每冰箱中保藏。以后每_个月，都要重新将菌种个月，都要重新将菌种从旧的培养基上从旧的培养基上_到新鲜的培养基上。到新鲜的培养基上。缺点：这种方法保存的时间不长，菌种容易缺点：这种方法保存的时间不长，菌种容易_或产生或产生_。 临时临时斜面培养基斜面培养基合适合适436转移转移被污染被污染变异变异(2)对于需要对于需要_保存的菌种，可以采用保存的菌种，可以采用_管管藏的方法。藏的方法。在在3 mL的甘油瓶中，装入的甘油瓶中，装入1 mL甘油后甘油后_。将。将1 mL培养的菌液转移到甘油瓶中，与甘油充分混匀后，培养的菌液转移到甘油瓶中，与甘油充分混匀后，放在放在_的冷冻箱中保存。的冷冻箱中保存。长期长期甘油甘油灭菌灭菌20D1.17108多多不能不能 因为不能排除杂菌来自因为不能排除杂菌来自培养基或来自培养过程培养基或来自培养过程 每次划线每次划线前要灼烧前要灼烧冷却后从上一区划线末端开始划冷却后从上一区划线末端开始划首尾区不重叠首尾区不重叠B考点四筛选菌株、统计菌落数目、考点四筛选菌株、统计菌落数目、设置对照设置对照【回扣教材回扣教材】1筛选菌株筛选菌株(1)自然界筛选：自然界筛选：实 例 ：实 例 ： D N A 多 聚 酶 链 式 反 应多 聚 酶 链 式 反 应 ( P C R ) 要 求 使 用要 求 使 用_酶。科学家从水生耐热细菌酶。科学家从水生耐热细菌Taq中分离到耐高温的中分离到耐高温的TaqDNA聚合酶。聚合酶。耐高温的耐高温的DNA聚合聚合方法：根据目的菌对生存环境的要求，到相应的环境中方法：根据目的菌对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。去寻找。(2)实验室中筛选：实验室中筛选：人为提供有利于目的菌株生长的条件人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括包括_、_、_等等)，同时，同时_或或_其他微生其他微生物生长。物生长。(3)选择培养基选择培养基在微生物学中，将允许在微生物学中，将允许_种类的微生物生长，同种类的微生物生长，同时抑制或阻止时抑制或阻止_微生物生长的培养基，称作微生物生长的培养基，称作_培养基。培养基。营养营养温度温度pH抑制抑制阻止阻止特定特定其他种类其他种类选择选择2统计菌落数目统计菌落数目测定微生物数量的常用方法有测定微生物数量的常用方法有_法和法和_法。法。3设置对照设置对照(1)设置对照的主要目的是排除设置对照的主要目的是排除_中中_对实验结果的影响，提高实验结果的对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。可信度。(2)判断培养基中是否有杂菌污染：判断培养基中是否有杂菌污染：_。(3)判断选择培养基是否具有筛选作用：判断选择培养基是否具有筛选作用：_。稀释涂布平板稀释涂布平板显微镜直接计数显微镜直接计数实验组实验组非测试因素非测试因素将未接种的培养基在相同的条件下进行培养将未接种的培养基在相同的条件下进行培养对照培养基对照培养基(营养物质齐全营养物质齐全)接种后培养观察菌落数目接种后培养观察菌落数目D考点五土壤中分解尿素的细菌的考点五土壤中分解尿素的细菌的分离与计数分离与计数【回扣教材回扣教材】1实验设计实验设计实验设计包括实验设计包括_，所需，所需_、_、_，具体的实施步骤以及时间安排等的综，具体的实施步骤以及时间安排等的综合考虑和安排。合考虑和安排。实验方案实验方案仪器仪器材料材料用具和药品用具和药品2操作提示操作提示(1)无菌操作无菌操作取土样用的小铁铲和盛土样的信封在取土样用的小铁铲和盛土样的信封在_都需要都需要灭菌。灭菌。应在应在_称取土壤。在称取土壤。在_附近将称好的土样附近将称好的土样_锥形瓶中，塞好棉塞。锥形瓶中，塞好棉塞。在在_土壤溶液的过程中，每一步都要在土壤溶液的过程中，每一步都要在_操作。操作。(2)做好标记做好标记本实验使用的平板和试管比较多。为避免混淆，最好在本实验使用的平板和试管比较多。为避免混淆，最好在_就做好就做好_。例如，在标记培养皿时应注。例如，在标记培养皿时应注明明_、_以及平板上培养样品的以及平板上培养样品的_等。等。使用前使用前火焰旁火焰旁火焰火焰倒入倒入稀释稀释火焰旁火焰旁使用前使用前标记标记培养基种类培养基种类培养日期培养日期稀释度稀释度3课题延伸课题延伸本课题对能分解尿素的细菌进行了初步的筛选。对分离本课题对能分解尿素的细菌进行了初步的筛选。对分离纯化的菌种作进一步的鉴定，还需要借助纯化的菌种作进一步的鉴定，还需要借助_的的方法。在细菌分解尿素的化学反应中，细菌合成的方法。在细菌分解尿素的化学反应中，细菌合成的_将尿素分解成了将尿素分解成了_，pH_，以尿素为，以尿素为唯一氮源的培养基加入唯一氮源的培养基加入_，如果，如果pH升高，升高，_，可以初步鉴定该种细菌能够分解尿素。，可以初步鉴定该种细菌能够分解尿素。生物化学生物化学脲酶脲酶氨氨升高升高酚红指示剂酚红指示剂指示剂变红指示剂变红 尿素是唯一尿素是唯一的氮源的氮源,只有能利用尿素的微生物才能生长只有能利用尿素的微生物才能生长平板划线法或稀释涂布平板法平板划线法或稀释涂布平板法酚红酚红红红和和灭菌灭菌考点六分解纤维素的微生物的考点六分解纤维素的微生物的分离分离【回扣教材回扣教材】1纤维素：是一种由纤维素：是一种由_首尾相连而成的高首尾相连而成的高分子化合物，是地球上含量最丰富的分子化合物，是地球上含量最丰富的_物质。物质。_是自然界中纤维素含量最高的天然产物。是自然界中纤维素含量最高的天然产物。有些微生物能分解利用纤维素，因为它们能够产生有些微生物能分解利用纤维素，因为它们能够产生_。葡萄糖葡萄糖多糖类多糖类棉花棉花纤维素酶纤维素酶2纤维素酶：是一种复合酶，一般包括纤维素酶：是一种复合酶，一般包括_酶、酶、_酶和酶和_酶。前两种酶能使纤维素分解成酶。前两种酶能使纤维素分解成纤维二糖，第三种酶能将纤维二糖分解成纤维二糖，第三种酶能将纤维二糖分解成_。3筛选纤维素分解菌的方法是筛选纤维素分解菌的方法是_。该。该方法可以通过方法可以通过_反应直接筛选。反应直接筛选。其原理是：刚果红可以与纤维素形成其原理是：刚果红可以与纤维素形成_，当纤维素被当纤维素被_分解后，红色复合物无法形成，分解后，红色复合物无法形成，出现以出现以_为中心的为中心的_，我们可以根，我们可以根据据_来筛选纤维素分解菌。来筛选纤维素分解菌。C1CX葡萄糖苷葡萄糖苷葡萄糖葡萄糖刚果红染色法刚果红染色法颜色颜色红色复合物红色复合物纤维素酶纤维素酶纤维素分解菌纤维素分解菌透明圈透明圈是否产生透明圈是否产生透明圈4纤维素分解菌大多分布在富含纤维素分解菌大多分布在富含_的环境中，的环境中，也可以将富含纤维素的物质埋在土壤中，经过也可以将富含纤维素的物质埋在土壤中，经过30天左天左右，再从已腐烂的物质埋藏处筛选右，再从已腐烂的物质埋藏处筛选_。5在将样品稀释涂布到在将样品稀释涂布到_的培养基的培养基上之前，可以用上之前，可以用_增加纤维素分解菌的增加纤维素分解菌的浓度。培养时要在浓度。培养时要在_培养。培养。6 常 用 的 刚 果 红 染 色 法 有 两 种 ： 一 种 是 常 用 的 刚 果 红 染 色 法 有 两 种 ： 一 种 是_，再加入，再加入_；另一种；另一种是是_。纤维素纤维素纤维素分解菌纤维素分解菌鉴别纤维素分解菌鉴别纤维素分解菌选择培养基选择培养基摇床上振荡摇床上振荡先培养微生物先培养微生物刚果红染色刚果红染色在倒平板时就加入刚果红在倒平板时就加入刚果红7为确定得到的是纤维素分解菌，尚需进行为确定得到的是纤维素分解菌，尚需进行_的实验，纤维素酶的发酵方法有的实验，纤维素酶的发酵方法有_发酵和发酵和_发酵两种。纤维素酶的测定方发酵两种。纤维素酶的测定方法一般采用对纤维素酶分解滤纸等纤维素后所产生的法一般采用对纤维素酶分解滤纸等纤维素后所产生的_进行定量测定。进行定量测定。发酵产纤维素酶发酵产纤维素酶液体液体固体固体葡萄糖葡萄糖 培养基表面的菌悬液会出现积液培养基表面的菌悬液会出现积液,导导致菌体堆积致菌体堆积,影响分离效果影响分离效果 避免培养基避免培养基污染棉塞污染棉塞量与活性量与活性J4 发酵过程会发酵过程会产热和产酸产热和产酸,J4菌株在较高温度和酸性环境下酶的活性更高菌株在较高温度和酸性环境下酶的活性更高CCCACACD碳源碳源酒精灯火焰酒精灯火焰稀释涂布平板稀释涂布平板敏感敏感绿脓杆菌对头孢菌素的敏感性比美罗培南弱绿脓杆菌对头孢菌素的敏感性比美罗培南弱杂菌污染杂菌污染抗比阿培南的绿脓杆菌形成的菌落抗比阿培南的绿脓杆菌形成的菌落美罗培南美罗培南平板划线平板划线NaNO3尿素和葡萄糖尿素和葡萄糖1.165109原油原油选择选择固体固体强强氮源和无机盐氮源和无机盐 只有能利用苯磺隆的微只有能利用苯磺隆的微生物能正常生长繁殖生物能正常生长繁殖细胞分裂素细胞分裂素母液母液接种环接种环接种环灼烧后未冷却；接种环灼烧后未冷却；划线未从第一区域末端划线未从第一区域末端开始开始 自养自养厌氧型厌氧型AE 在酒精在酒精灯火焰旁操作灯火焰旁操作接种环放在火焰上灼烧并冷却接种环放在火焰上灼烧并冷却锥形瓶的瓶口火焰灼烧灭菌锥形瓶的瓶口火焰灼烧灭菌CA培养液缺少氮源培养液缺少氮源,细菌不能很好生长细菌不能很好生长B培养液所含营养物质比较齐全培养液所含营养物质比较齐全,不能筛选出细菌不能筛选出细菌A增加稀释倍数增加稀释倍数40 000异氧需氧型异氧需氧型 尿素为唯尿素为唯一氮源一氮源酚红酚红45摇匀摇匀(振荡、混匀振荡、混匀)涂布器涂布器(玻璃刮刀玻璃刮刀)稀释涂布稀释涂布(平板平板)法法红色环带红色环带105或或106无氧呼吸无氧呼吸D石油石油琼脂琼脂灭菌灭菌苏丹苏丹(或苏丹或苏丹)萃取法萃取法油脂油脂血细胞计数板血细胞计数板稀释涂布平板稀释涂布平板4540高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌液体液体系列稀释系列稀释(或或“梯度稀释梯度稀释”)淀粉淀粉出现透明圈出现透明圈分泌淀粉酶分泌淀粉酶 巴氏消毒法巴氏消毒法(煮沸消毒法煮沸消毒法,紫外线消毒法等紫外线消毒法等)较强的理化因素较强的理化因素阿拉伯胶阿拉伯胶 巴氏消毒法巴氏消毒法(煮沸消毒法煮沸消毒法,紫外线消毒法紫外线消毒法等等) 目的目的菌株菌株(菌株菌株SM01)能分泌降解阿拉伯胶的蛋白质能分泌降解阿拉伯胶的蛋白质ABG 不合理不合理,缺少空白缺少空白对照对照 另设置另设置两组一样装置的对照组两组一样装置的对照组,其中第一组只用上清液其中第一组只用上清液,不添不添加蛋白酶加蛋白酶,取出取出10 mL加入阿拉伯胶溶液。测定阿拉加入阿拉伯胶溶液。测定阿拉伯胶的降解率。第二组不用上清液伯胶的降解率。第二组不用上清液,只用含蛋白酶的只用含蛋白酶的溶液。取出溶液。取出10 mL加入阿拉伯胶溶液加入阿拉伯胶溶液,测定阿拉伯胶测定阿拉伯胶的降解率的降解率A
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