基因定点突变全攻略

基因定点突变全攻略一、定点突变得目得把目得基因上面得一个碱基换成另外一个碱基.二、定点突变得原理定点突变就是指通过聚合酶链式反应(PCR)等方法向目得DNA片段（可以就是基因组，也可以就是质粒) 中引入所需变化 （通常就是表征有利方向得变化）, 包括碱基得添加、 删除、点突变等。 定点突变能迅速、高效得提高DNA所表达得目得蛋白得性状及表征，就是基因研究工作中一种非常有用得手段。体外定点突变技术就是研究蛋白质结构与功能之间得复杂关系得有力工具，也就是实验室中改造 / 优化基因常用得手段。蛋白质得结构决定其功能, 二者之间得关系就是蛋白质组研究得重点之一。对某个已知基因得特定碱基进行定点改变、缺失或者插入, 可以改变对应得氨基酸序列与蛋白质结构，对突变基因得表达产物进行研究有助于人类了解蛋白质结构与功能得关系 , 探讨蛋白质得结构/ 结构域。 而利用定点突变技术改造基因：比如野生型得绿色荧光蛋白（ wtGFP)就是在紫外光激发下能够发出微弱得绿色荧光, 经过对其发光结构域得特定氨基酸定点改造, 现在得 GF能在可见光得波长范围被激发（吸收区红移), 而且发光强度比原来强上百倍 , 甚至还出现了黄色荧光蛋白, 蓝色荧光蛋白等等。 定点突变技术得潜在应用领域很广 , 比如研究蛋白质相互作用位点得结构、改造酶得不同活性或者动力学特性, 改造启动子或者 DN作用元件 , 提高蛋白得抗原性或者就是稳定性、活性、研究蛋白得晶体结构，以及药物研发、基因治疗等等方面通过设计引物, 并利用 CR将模板扩增出来, 然后去掉模板， 剩下来得就就是我们得PCR产物 , 在 PC产物上就已经把这个点变过来了, 然后再转化 , 筛选阳性克隆， 再测序确定就行了三、引物设计原则引物设计得一般原则不再重复.突变引物设计得特殊原则:(1 ）通常引物长度为2 5 bp, 我们建议引物长度为3 35 bp 。一般都就是以要突变得碱基为中心, 加上两边得一段序列, 两边长度至少为1 12 b 。若两边引物太短了，很可能会造成突变实验失败，因为引物至少要1-1 个 p 才能与模板搭上, 而这种突变R 要求两边都能与引物搭上，所以两边最好各设至少12 个bp，并且合成多一条反向互补得引物。(2) 如果设定得引物长度为0b , 接下来需要计算引物得T值 , 瞧就是否达到78( C 含量应大于40）。（3) 如果T值低于7 , 则适当改变引物得长度以使其Tm值达到7 (G含量应大于%)。(4）设计上下游引物时确保突变点在引物得中央位置.(5)最好使用经过纯化得引物。T 值计算公式：Tm=0、41( of GC) 675/L+81 、注： L: 引物碱基数 ;% o G : 引物含量 .四、引物设计实例以 GG ACG为例： CCTC CA TATGTAGCGA TTACT A TGCGG3-(1) 首先设计30 bp 长得上下游引物，并将A (T ）设计在引物得中央位置Pimer #1: CC T A TAT T GA G CTTACTT TT C3 rimer 2: 5 GCAAT AGT AGC TCTAC TACTGAA G 3(2) 引物 GC含量为 40%,L 为 30, 将这两个数值带入T值计算公式，得到其Tm= 5、（ Tm=0、4 40 -675/30+8 、）。通过计算可以瞧出其 Tm低于 78 , 这样得引物就是不合适得 , 所以必须调整引物长度（ 3) 重新调整引物长度Prim r 1： - CT CTCA TATGT C A TTACTTATTGCGG P ime #2: 5 CGCAATAA TAAGTCGCT CA ACTGAA G在引物两端加 5m r( 斜体下划线处 ) ，这样引物得 GC含量为 45、 7%,L 值为 35, 将这两个数值带入 Tm值计算公式， 得到其 Tm为 80、952(T =0、414、 5 67/ 5+8、 ) ，这样得引物就可以用于突变实验了 .五、突变所用聚合酶及Bu r引物与质粒都准备好后，当然就就是做PCR喽 , 不过对于P R得酶与 b fer ，不能用平时得 , 我们做 R 把整个质粒扩出来, 延伸长度达到几个K，所以要用那些C bu fr 或扩增长片段得 f er,另外，要用保真性能较好得PF酶来扩增 , 防止引进新得突变。除了使用基因定点突变试剂盒, 如 Stra agene 与塞百盛得试剂盒，但价格昂贵。可以使用高保真得聚合酶，如博大泰克得金牌快速TMS Nta 酶、 akara 得 P imeSTAR p ymeras。六、如何去掉 P R 产物最简单得方法就就是用 DpnI 酶， DpnI 能够识别甲基化位点并将其酶切，我们用得模板一般都就是双链超螺旋质粒 , 从大肠杆菌里提出来得质粒一般都被甲基化保护起来（除非您用得就是甲基化缺陷型得菌株），而 PCR产物都就是没有甲基化得，所以pnI 酶能够特异性地切割模板 （质粒）而不会影响PCR产物 , 从而去掉模板留下PCR产物 , 所以提质粒时那些菌株一定不能就是甲基化缺陷株. pnI 处理得时间最好长一点 , 最少一个小时吧 , 最好能有两三个小时， 因为如果模板处理得不干净 , 哪怕只有那么一点点，模板直接在平板上长出来, 就会导致实验失败 .七、如何拿到质粒直接把通过DpnI 处理得 PCR产物拿去做转化就行了, 然后再筛选出阳性克隆, 并提出质粒, 拿去测序 , 验证突变结果。八、图示九、定点突变操作步骤A 诱导突变基因（CR反应）以待突变得质粒为模板，用设计得引物及Mu a drec ?酶进行 P R 扩增反应 , 诱导目得基因突变 . 1、 设计点突变引物 . 注 参考引物设计指导、准备模板质粒DN A+型菌株中常有克隆数低得现象 , 注用 dam型菌株（例如 DH5 菌株 ) 作为宿主菌。 在 d但就是对突变效率没有影响。提取质粒NA时我们建议您使用本公司得质粒提纯试剂盒。3、 选项 对照反应体系(5 l 反应体系）10R ctio B ff r5lp C 8 on r l asm d( 0 g， to al 0ng)C ntr l pri r mix(0pmol/ l)2ld TP ixtu e（ each .5mM)2l H23lMut -dir t? En e1l、 样品反应体系 ( 0l反应体系 )10Reaction Buff r5Sample plasmid( 0g/ l ， total20n )2Sam le pr me （ F)(0pmo1l/ l ）Sample prime (R ）( pm l ) TP mixt re( ach。 5mM)2dH O38lMu -direc ? Enzyme1l5、 PC反应条件注 按如下参数设置CR扩增条件。Cycle Temperat reR ci n Time1 ycle 53se 15 y le930se551m n721mi per pl smidb6、 CR扩增反应完成后冰育分钟，然后置于室温( 避免反复冻融 ) 。 注 按下列提供得 CR条件进行扩增，控制PCR循环数。注意当突变点位点超过4 个时会发生突变率降低得现象。Muttion12Nucle ti 3Nu le t de ycle 15 ycles1 cycle B突变质粒选择PC反应结束后使用Mu zyme?酶消化甲基化质粒从而选择突变质粒DNA.1、 准备反应产物2、加入 l （ 10/ l)Mutazy ?酶 7温育 1 小时 . 注 当质粒 DNA用量过多时 tazyme?酶可能发生与样品反应不完全得现象。因此我们建议为了保证突变率请严格遵照实验步骤进行操作如果突变率低， 可以适当延长反应时间或增加 Muta me?酶用量。 C 转化+反应完毕后在质粒DNA上会产生缺口, 当把这个质粒D A 转入 E、 ol 中时请选择dam型菌株 , 例如 DH5。、将 10l样品加到 0l 感受态细胞里，然后放置在冰上分钟。2、 接下来可以参照一般得转化步骤进行序列分析通常当 L平板上出白色菌落则表明发生了突变。为了证实这一结果，我们建议对白色单菌落进行测序分析。先讲最简单得一个点得定点突变技术, 其它较长片段得突变, 删除 , 插入技术以后会慢慢奉上：在做实验之前 , 我们首先要搞清楚实验得目得与实验得原理。 ? 实验得目得应该比较明确吧 : 就就是要把自己得基因上面得一个碱基换成另外一个碱基。一般情况下我们会有几种可能使我们需要这样去做：第一 : 我们吊出来得基因有点突变，相信这可能就是大家经常会遇到得问题。基因好不容易吊出来 , 并装进了自己得载体 , 却发现有一两个碱基跟自己得预期序列或所有得公共数据库不匹配，然后暴昏。大家实验室里面还就是用Ta酶为主吧，Pfu 这样得高保真酶大家应该用得不多吧,Taq 酶得优点与缺点都很明显：优点就就是扩增效能强，缺点就就是保真性差, 其错配机率就是比较高得，相关数字忘了, 大家可以去网上查那个数字, 不过感觉如果就是200bp得基因, 如果扩四五十个循环得话，很大机率会出现点突变，当然这也跟具体PCR体系里得B fer有很大关系，详细情况这里就不讨论了。第二 : 要研究基因得功能, 在基因上自己选定位置更换碱基得保守序列, 或者改造成不同得亚型, 总之就就是要人工改造碱基序列符合自己得实验需要，相信这也就是那些研究基因得人经常得一种思路吧。对于第一种情况 : 我们首先要分析出现碱基不匹配得位置就是不就是重要得位置 , 如果不就是很重要 , 大可不必管它 , 比如说就是三联密码子得最后一位 , 碱基得改变并没有引起相应氨基酸得改变，那么一般情况下也可以不去理它。另外 , 在 NC上人类得基因得版本一直在变化 , 也就就是说同一个基因有不同得版本 , 或者称不同得亚型， 其碱基序列有些许得差异, 只要自己克隆出来得碱基序列与其中一个相匹配，一般也就可以不做定点突变了。如果有时间没钱 , 那干脆重新 P R然后再克隆进自己得载体了， 不过最好换个保真性好一点得酶如 P U, 或者 PCR循环数低一点 , 不过这些东西有时候也得靠运气啦. 实在不行得话再来做定点突变 . ?对于第二种情况: 这种情况下一般也就只能做定点突变了.接下来开始聊一聊定点突变得原理吧，那个 Str agene 试剂盒！上面有一个说明书,说得好像很正规, 不过上面好多都就是什么专利啊什么注意之类得话，瞧都不瞧 , 我们简明扼要地只讲实验方面，通过设计引物，并利用P R将模板扩增出来, 然后去掉模板 , 剩下来得就就是我们得CR产物 , 在 CR产物上就已经把这个点变过来了, 然后再转化 , 筛选阳性克隆, 再测序确定就行了。大家马上就会想到几个问题了: ?第一 : 引物怎么设计呢?第二 : 模板怎么去掉呢？?第三：怎么拿到质粒呢 ?对于第一个问题：怎么设计引物?我只能讲一些原则, 并举一些例子。引物设计得原则其它贴子上都有讲，这里就不重复了：不过这种突变引物要加上一个原则：?一般都就是以要突变得碱基为中心，加上两边得一段序列, 两边长度至少为1 12bsp ir。?若两边引物太短了, 很可能会造成突变实验失败，大家应该都知道，引物至少要11 12 个 base种突变 CR要求两边都能与引物搭上, 所以两边最好各设至少 ai 才能与模板搭上，而这12个 ba e r, 并且合成多一条反向互补得引物。这么说大家可能不就是很清楚, 那我就举个例子吧: 71 6、 1 T TCA GGGAATTTGA ACTTT A CAA AATTGGAT AA AAA AGAATTCCA 60?现有序列 ATCAGGAGGAATTTGCA TTT A CA GA T GA AAAAA AAGAGGATTCCAG 924?* * * * * * * * * * * * * *?| - deletionX716 1、 AAG GC ACCCCGACCTCCAAGGGC TGCG GGAATATTTGAGAGTGT A T020现有序列AA G CA C GACCTCCAGGG GC T C GAGGAA T TTGAGTGTAGGA T8 ( 上面为目得序列， 下面为现有序列 : 我们发现有一个A 碱基得缺失 ,其直接结果就是在表达蛋白时后面得氨基酸全部错配）我们以它为中心设计引物：两边各至少12 个碱基 , 左边由于含有较多得A 造成引物GC含量过低，故拉长引物使C含量不至过低 , 也使引物退火温度升高。故合成引物 CA AGA TTGGATA A AAAGAGGAAT CAGAA并合成反向互补引物CT CTG ATTC CTTT TT TATC AT CTTGTTG其实也不一定要反向互补序列，只要反向引物也就是两边都有大于12 个碱基 , 同时符合引物设计得原则就行了 .引物合成公司有很多家, 大家可以去寻找 , 不同厂家得引物在价钱质量上有一些差别,不过价钱一般都就是一块多一个碱基, 合成时间约为一周 .这样得结果就是PCR时把整个质粒都给扩出来了, 得到得 PC产物就是一条链完整, 另一链有缺刻得 PCR产物对于第二个问题 : ?怎么去掉模板呢 ?再简单得方法就就是用D nI酶， D nI 能够识别甲基化位点并将其酶切，我们用得模板一般都就是双链超螺旋质粒, 从大肠杆菌里提出来得质粒一般都被甲基化保护起来( 除非您用得就是甲基化缺陷型得菌株) ，而 PC产物都就是没有甲基化得 , 所以 D n酶能够特异性地切割模板( 质粒 ) 而不会影响 R 产物 , 从而去掉模板留下 PCR产物，所以提质粒时那些菌株一定不能就是甲基化缺陷株, 不会那么凑巧吧 ,哈哈。关于第三个问题：?直接把通过 Dpn处理得 PCR产物拿去做转化就行了, 呵呵, 然后再筛选出阳性克隆, 并提出质粒 , 拿去测序 （这个就不用我多说了吧）, 验证突变结果 , 一般都没问题得啦 , 我做了几十个突变了, 到目前为止还没有做不出来得，呵呵，不要砸我啊。下面讲一下具体得实验步骤以及一些实验中要注意得事情: 1?、 根据现有基因设计引物;2、合成引物并准备好模板；3、PC ,4、DpI处理酶切产物;5、 转化酶切产物; 6?、 筛选阳性克隆； ?、 送测序并测全长. ?最后就就是庆祝啦, 呵呵 ,没什么复杂得。引物与质粒都准备好后，当然就就是做PCR喽 , 不过对于PCR得酶与 bu f r, 不能用平时得 , 我们做 P R把整个质粒扩出来, 延伸长度达到几个K，所以要用那些Gb ffer或扩增长片段得buffer，另外，要用保真性能较好得PFU酶来扩增, 防止引进新得突变。那种i k c an e 试剂盒分为几种不同得类型什么 i Change? Si irected Mutag n si it 标准点突变试剂盒 、Q Ch ge? XL -Direc ed M tagenesis Kit 长模板单点突变试剂盒 ( 8 b）从原理上就是一样得， 只就是 PCR得酶与 BUFF R 不一样， 后面用了比较适合长片段扩增得酶与 U ER罢了 , 没什么特别得东西。另外 , pnI 处理得时间最好长一点，最少一个小时吧 , 最好能有两三个小时 , 因为如果模板处理得不干净 , 哪怕只有那么一点点 , 模板直接在平板上长出来 , 就会导致实验失败 .实验板长出来得菌有两种可能?一种就是质粒DPN没处理干净长出来得( 模板 ), 一种就是CR产物转化出来得( 突变体）不过这两种菌长得一模一样 , 即使提出质粒来也就是一样( 酶切与 PCR都无法区分） , 除了测序，就是分不出来得,做 PCR时也最好做一个负对照( 不加引物 ),实验管由于 PCR时有引物 , 所以在 DNPI 处理前里面既含有模板又含有P产物， 而对照管由于 PCR时没放引物 , 所以在 D NI 处理前里面只有模板。?如果两者都拿去 DNPI处理 ?就能够证明模板已经被去除干净 .若实验顺利得话应该就是: 正对照长菌负对照不长菌。如果出现正负对照都长菌, 那么就就是 DpnI没处理好 ,如果正负对照都不长菌, 那么有两种可能 , 一种就是 C阴性 , 也就就是说 PCR出问题了，另外一个可能就就是转化出问题了。要搞清楚就是哪个问题, 跑胶说明不了问题，那就做个转化得对照，拿试剂盒得对照实验去试感受态，马上就能知道转化有没问题。如果正对照很多菌 , 负对照有几个菌，那么就就是P I处理得不干净 , 这个时候就得靠运气了 _大家有什么问题我们可以继续讨论另外，如果大家既没有Dpn酶也没有好得PCR酶与 UFFE得话，那也有其它办法进行定点突变 , 只就是麻烦一点，如果大家有需要得话, 我会把方法贴上来。?对于多点突变技术及较长片段得缺失插入技术, 同样得 , 如果大家有需要得话, 我会把方法贴上来。不过 , 如果您有钱得话 , 那就去买那个试剂盒吧, 其中 Q ik age? Si eirect d Mutag n s s t 标准点突变试剂盒、 uikC ane? X Site-Direced M t gnesis Ki 长模板单点突变试剂盒( kb ）得原理我上面已经说了，只就是补充了一些我认为得注意事项。如果您更有钱得话, 那么您可以叫其它公司帮您做定点突变服务 , 大约就是改一个点100元左右。如果有需要我可以提供公司得联系方式。下面我以一个例子为例来讲100 个 bp 以下得碱基插入缺失或者改变实验方案. 其实这种方案并不就是那么好得，只不过考虑到大家一般都没有T II限制性内切酶或者 UD and N H II(另外两种方法）, 所以才打算先介绍这种方法. ?首先先说明一点, 这种 方法在原理上存在一定成功机率，也就就是说有运气成分。而定点突变则一般都就是百分之百成功得， 而这种 100bp 以下得插入缺失或者碱基改变可能要测几个克隆才能挑到一个好得克隆 , 大家如果要用请慎重考虑.同样得，我只变那几十个碱基 , 并没有改变载体及其它地方 , 所以我还就是依赖于 DPNI 酶 .举例 :H mo a i ns FzE3就是一个人类基因，其含有个氨基酸得信号肽MRDPG ALS LGLCALV ALL L AAGA，后面就是成熟肽QPYHGE S DHG C P DIAYNQTI P LGHT QE VHQF VKVQCSPELRFFLCSMA VC LDQ IP C RSL ER RQG AL NKFGF PERLR E PVHGAGEI V QNTSDGPGGGPTAYP?TAPYPD PFT LPPGSDG GRAFPFSC RQ PPYL YR LGRDCGAPCEPGANGLMYF EE RR ARLWVGVWSVLCCASLFTVL YVDMRRFSYERPIIFLSGC FM AV H AGFL EDRAV E FSD RVA GTKKEGCT LFMV Y G ASSI WVIST?W AA MKWG E I ANSQ H WAVPA KTITILA QV G LLSGVCYVGLSSDAL GFVLA F YFIGTSF AGFVSLFRIRTIMK D T EK EK MVR GVFSV TPATI LACYF EQA HW WLLQTCKS V CPPHFPPMS DFTVFMIYLMTMGIT FWIW K QSWRRFYRLSHSSK AV, 想在信号肽与成熟肽之间插入一个FLAG标签并在标签前面加上一个eucin 。即在信号肽与成熟肽之间插入一段序列: TATG A TAC A GACG TGACGA A ( 一共三十个bp）、实验设计 :信号肽 :A GCGGGACC GG C GCCGTT G TTCGTCCC CTTCTGT CCT GGCTG?GCGC GCTGGGCGCACGTCCGCGGGC成熟肽 :CAGCC TACC GG GAGAAGGCA CT CGTGC GA C C TC GCCAGCCCATCCC TC CGCT TCAACATC?GCC CA C GACCA CCT C CAACC T CCACA GAACCAAGAGG G GGGCCT GAGGTGCC AGT CT CCGCGGT AAG TG AG GTTC C CGA CTCCG TT?TTCTT TG TC AT TA GC CCCGT TGC GTGC GTCA ATCCCGCCG T TTC TG GCGA CGGC CGCC GGG T CGAG CGCTC GAA AAGTTCG CTC?AGTG CCCGAGCGCCTGCGCGAGA TT CGGT ACGGTGCG GAGA CT C GT GGCCAG CACG C GAC G C GGGCCCAGGCGGCGGCCCAC CCTACCTCCG GCC A CTG CGG CTGCCCTTCACCGCGCTCCCCGGGG C CAGGC?AAGGGGCGTCCCGCCCCCC TCTCATGCCC GTCAGC AA G CC CGTA CTGG CTACCGC CCT G TGAGCGCGATGTGGCGCCCG G GAACCGGGCCGTGCCAAC?CCTGATG ACT AAGGAGGAG AGGCGCTCGC CGCCTCTGGTGG C TGTGTCCGTG TG G TCGC TGACGCT AC TTCTCACGTACCTGGTGGATGCGGGCTT GCT CCAGAGCGGCCCAT CTT TGT GG CT TACTTA G TGGCCGT GCGCA G GGCCGGCTTCTTTCTA CGC C GTG CGTGG GCGC TCTG GACGAT GCTACCGCC GTGG G AGGG A CAAG AGAGGGCTGCC CCTCTTCTG T CTCTACTTC TCGCA GGC TCCATC GGTGG TCA C GTCT TCATGG TC TGG GCCGG ATGAA TGG CA GA GCCATCGAGCCA TCGC GTA C TGGCC CG GGCCGTGCCCCCGTCAAGAC TCACTATCCTGG AT GC C GGTAGCGG CTGCTGA CGGGGTGT T CGT GC TCTC AGT GAGC?CTGCGGGCTTCGTGC C CCTCTGT TC C TCTTCA G CACG CCTTCTG?CTGGCCGGCTTCGT TTCTTCC TAT C ACCT AT AAACA GACGGCAC AGACC GAAGCTG GAAGCCATGGTGCGCATCGCG C GCGT CTCT CA GTGCC CACCAT G CC GCC GCAC CTACGAGCAGGCCTC CGAGACTG GAC CACCTG C C TGCAGACTGCAAGA AGC GTG CTGCCCGCCCGGCACT C?CGCCCATGAGCCCCGACTTCACCGTCTTCATCAAGTGCCTGAT CCATGAT G CGGCATCACCACTGGTTCTGGATCTGGCGGCAAGACCT C GTC TGCGCC C CTAC C TTAGCCAAGCAGCAAGGGAGAG CGGT TGA插入序列 ?T AT G CT CA AGACGATGACACA ?通过引物 3 端大于或等于 18 个碱基得匹配使引物与模板质粒搭配，再通过引物5 端得序列来补上那三十个碱基，先用酶把引物磷酸化, 再用下面这两条引物把整个质粒给扩增出来 , 上游与下游引物就刚好把那三十个碱基给补上了, 再参照引物得设计原则做一些润色， 细心得朋友可以具体分析一下这两条引物. 扩出来后再用 NI 酶把模板质粒去掉 ,再用连接酶把 C产物得两端连接起来 ( 虽然就是平端连接, 可就是由于就是同一条PCR产物得两端连接 , 效率会很高） , 转化后 , 测序验证 , K.设计引物for a d pr mer: GACTACAAAGAGATGA GA AAG GCCGTACCAC AGAGAAG88、 5?r s rve pri er ： TTAA GCC GGGCC G GGACAGT?86 、 ?但就是由于引物得合成就是由3 端向 5 端合成，而且每合成多一个碱基得效率最多也就是百分之九十九点几而不就是百分之一百, 所以我们拿到手得引物其实就是一个混合物, 比如说我们合成一条长二十个碱基得引物, 实际上拿到手得就是一个混合物, 里面即含有二十个碱基得引物, 也含 有一定比率得十九个、十八个、十七个 碱基得引物。?所以我们用这种方法做P R 时 , 如果连上得就是足额长度得引物，那么实验也就成功了，如果连上得就是少一两个碱基得引物 , 那么实验就失败了 , 不过引物当中主要得仍就是足额长度得引物，所以成功机率还就是蛮高得。不过送测序时就要做好准备，可能要测三五个才能拿到一个好得。如果觉得这样不好得话, 我稍后会附上用TYPE酶或者U G,NTH I 做得方法, 它们就是通过互补粘端来连接, 就不存在这个问题. ?下面附上详细实验过程:第一步：设计引物; 其实只要符合一般引物设计原理就行了，顺便说一下, 引物一般得话, 越长其质量就 ?第二步 : 引物PNK处理，一般合成得引物其三端就是没有磷酸化得，所以我们要自己进行磷酸化，一般可以让其磷酸化过夜，不磷酸化得话最后一步连接就连不上哦. ?第三步 :P R,跟基因定点突变一样 , 要用好得扩增酶与 B F ER,因为要把整个环高保真得圹增出来嘛 ; ?第四步 : I 处理 , 跟基因定点突变一样，要把模板去除干净。第五步：连接 , 加上连接 UFFER与连接酶连接 ,第六步: 转化。定点诱变（DpnI法）1、引物设计: 每条引物都要携带有所需得突变位点, 引物一般长2545b，设计得突变位点需位于引物中部。2、反应: 使用高保真得yrobe t DNA聚合酶; 循环次数少, 一般为2 个循环。反应体系：10xp obe t Buffer5u?dNTPMixt re(1mM)1ul模板NA(0ng）1 ?pimer 1(1 5）1upri r(125n）1ul ?pyr bestp mer e(T KR )(5Uul)、 25 l加无菌蒸馏水至50u3、产物沉淀纯化：加1/10体积得醋酸钠，倍体积得异丙醇, 混匀置冰上（或0 C冰箱 )5min, 离心弃上清 ,70 %乙醇洗盐两次 , 烘干后溶于无菌水中。 （此步可省略 , 直接用D nI酶切 )4、 DpnI酶切:Buffer2ul ? SA(10)、 2ul ?NAx ulDpnI0 、5ul?加无菌去离子水至20ul30 C 酶切1 h；6C水浴1 i 终止反应。5、将酶切产物转化大肠杆菌5a 菌株，利用抗生素筛选突变子。6、测序验证