试验一聚合酶链式反应pcr扩增dna片断

分子生物学实验手册 (第二版)A Handbook of Molecular Biology Experiments 武汉工程大学化工与制药学院生物学工部实验总流程实验一 聚合酶链式反应（PCR）扩增DNA片断实验目的：1、获取目的基因。2、学习和掌握PCR基因扩增的原理和操作方法。材料与试剂：阳性克隆菌落、PCR引物、Taq酶、dNTP、10PCR buffer、dd H2O。实验原理：PCR(Polymerase Chain Reaction,聚合酶链反应)是在模板DNA、引物和4种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。PCR分为质粒PCR和菌落PCR，前者指提取阳性克隆菌质粒后进行PCR，后者指直接挑取阳性克隆单菌落，直接用菌落做PCR，本实验中采用后者。它包括三个基本步骤:：(1) 变性(Denature)：目的双链DNA片段在94下解链；(2) 退火(Anneal)：人工合成的两种寡核苷酸引物在适当温度(50左右)下与模板上的目的序列通过氢键配对两个引物在模板上结合的位置决定了扩增片段的长短；(3) 延伸(Extension)：耐热的DNA聚合酶即Taq酶在72将单核苷酸从引物的3端开始掺入，以目的基因为模板从53方向延伸，合成DNA的新互补链。Mg2+浓度对Taq DNA聚合酶影响很大,它可影响酶的活性和真实性,影响引物退火和解链温度, 影响产物的特异性以及引物二聚体的形成等。由上面三个基本步骤组成一轮循环，这样模板上介于两个引物之间的片断不断得到扩增，目的DNA以2n-2n的形式堆积。（动画演示：实验步骤：1、 取100 l dd H2O（双蒸水）至Eppendorf管（以后简称EP管），用微量移液管（俗称“枪”）Tip头（俗称“枪头”）从平板上挑取阳性克隆单菌落，将其混合到dd H2O中，沸水浴约10分钟。煮沸的目的就是使菌体裂解，释放出可以做为模板的DNA。2、 配备100 l PCR反应体系（用PCR小管）：3、 25l DNA；10PCR buffer 10l；2mM dNTP 10l；2种引物（10M）各5l；Taq（5U/l）1l；ddH2O 44l。4、 将PCR小管放入PCR仪，盖好盖子，在PCR仪上设定以下反应条件：5、 93 变性3 min后，进行30个循环的反应：92 变性40 sec，55 退火45 sec，72 延伸1 min；最后72 延伸5 min。PCR结束后温度设为4 。6、 反应结束后，取出PCR小管。产物置冰箱4保存待用。实验二 琼脂糖凝胶的制备及电泳检测实验目的：1、掌握琼脂糖凝胶电泳的原理、方法；2、检测PCR产物是否含目的基因。材料与试剂：1、PCR产物。2、琼脂糖（Agarose），注意不是琼脂粉（Agaragar）。3、50TAE 缓冲液：Tris 242 g、冰乙酸 57.1 ml、 0.5 mol/L EDTA 100 ml ，加入600 ml dd H2O后搅拌溶解，将溶液定容至1 L后湿热灭菌，室温或4保存；使用时可用ddH2O稀释。4、Loading Buffer，即上样缓冲液，含有溴酚蓝，Loading Buffer作用有两个，一是作为缓冲液，以稳定DNA的迁移率，另一作用是可以指示DNA泳动的距离。5、Marker：用来指示DNA分子大小的参照，本实验中使用到的Marker梯度为250bp，即在电泳中跑在最前面的为250 bp，其次是500 bp，750 bp实验原理：核酸分子是两性解离分子，在pH3.5时，碱基上的氨基基团解离，而3个磷酸基团中只有第一个磷酸解离，整个核酸分子带正电荷，在电场中向负极泳动；在pH值为8.0-8.3时，碱基几乎不解离，磷酸全部解离，核酸分子带负电荷，向正极移动；不同大小和构象的核酸分子的电荷密度大致相同，在自由泳动时，各核酸分子的迁移率区别很小，难以分开。采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物，发挥分子筛的功能，使得分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大的差异而得以分离。电泳后用EB（溴化乙锭）染色，在紫外照射下DNA发出橙色光，将其泳动的距离与Marker作比较就可以判断其分子大小，用这种方法至少可以检测出1-10 ng的DNA。本实验中目的基因大小为600bp，因此电泳时其条带位于Marker的第二条带与第三条带之间。注意：EB是强诱变剂并有中等毒性，配制和使用时都应戴双层手套，凡是沾污了EB的容器或物品必须经专门处理后才能清洗或丢弃。实验步骤：1、 称取1 g琼脂糖，倒入锥形瓶，加入2 ml 50TAE缓冲液，加水至100 ml。2、 用微波炉（或电炉）加热至琼脂糖完全溶解。3、 待上述胶液稍冷后，将其倒入插好梳子的模具中。4、 待琼脂糖溶胶完全凝固后，小心取出梳子，将凝胶放到电泳槽中,注意使加样孔靠近负极。5、 向电泳槽中倒入1TAE缓冲液，至液面略高于凝胶。6、 取 10 l DNA与 2 l Loading Buffer在点滴板（或用一次性手套）上混匀，加入到凝胶加样孔中。留一加样孔（一般在正中间）加Marker，Marker（5l）也要与2l Loading Buffer混合后再加。7、 接通电源，设定电压，电压降选择为1-5V/cm。电压不宜过高，一般不超过120 V，否则会使琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小（这是因为随着电场强度的增加，不同分子量的DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长,片段越大,因场强升高引起的迁移率升高幅度也越大）。8、电流完毕后切断电源，取出凝胶，放入EB溶液（0.5 g/ml）中进行染色10-15 min。清水漂洗后置于紫外照射仪上观察，然后利用成相系统拍照保存。实验三 回收纯化DNA片断实验目的：1、掌握DNA回收与纯化的原理及方法；2、回收目的DNA。材料与试剂：PCR产物、电泳检测相关试剂、AXYGEN试剂盒。实验原理：通过PCR扩增得到的DNA中含有很多杂质，如缓冲液中的盐类、Taq酶、dNTP，还有引物二聚体以及原来阳性克隆中的完整质粒等，这些杂质会影响连接效率，因此需要除去。将PCR扩增得到的DNA进行电泳后可以使目的基因与引物二聚体以及原来阳性克隆中的质粒DNA分离开，然后利用回收试剂盒中的试剂将DNA从电泳凝胶中分离以及进一步纯化。实验步骤：1、 将上一实验剩余的PCR产物（约90 l）进行电泳分离，其操作同实验二。2、 （以下内容由试剂盒内说明书翻译过来）在紫外照射下，将含有PCR 产物DNA片段的凝胶用刀切下，吸去残余的缓冲液，并切碎，放入EP管中称重，将称得的凝胶质量当作其体积。如100 mg凝胶就相当于100 l体积。然后将凝胶转至1.5 ml Microfuge tube。 注：可将 Microfuge tube 于12000 r/min离心30 sec 使凝胶位于管底。3、 加入3凝胶体积的DE-A缓冲液。例如：100 l凝胶则加入300 l DE-A。4、 涡旋使凝胶悬浮并溶解于DE-A缓冲液中，加热至75至凝胶全部溶解（一般需要68 min） 注：凝胶须全部溶解，否则会影响NDA回收率。凝胶加热时间不宜超过10 min。5、 加入0.5DE-A缓冲液体积的DE-B缓冲液,混匀。例如：100 l凝胶则加入150 l DE-B。6、 将一个Miniprep column 放到一个 2 ml Microfuge bube 中，将上一步溶解的凝胶放到column 中，12000 r/min 离心 60 sec。7、 弃去2 ml Microfuge tube 中的滤液，将 Miniprep column 放回 Microfuge tube 中，加入500 l W1缓冲液，然后 12000 r/min 离心 30 sec。8、 弃去2 ml Microfuge tube 中的滤液，将 Miniprep column 放回 Microfuge tube 中，加入700 l W2缓冲液，然后 12000 r/min 离心 30 sec。9、 弃去2 ml Microfuge tube 中的滤液，将 Miniprep column 放回 Microfuge tube 中，加入700 l W2缓冲液，然后 12000 r/min 离心 60 sec。 这两步操作的作用是除去凝胶中的盐类、Taq酶等蛋白质。10、 弃去2 ml Microfuge tube 中的滤液，将 Miniprep column 放回 Microfuge- tube 中，12000 r/min 离心 1 min。11、 将Miniprep column 转至 1.5 ml Microfuge tube ，加入2530 l洗脱液 (Eluent) 到column 中心的滤膜上。在室温下放置 1 min，然后12000 r/min 离心 1 min。注意：此时目的DNA被洗脱到Microfuge tube中，切勿误倒！12、 将洗脱得到的DNA取5 l进行电泳检测，确保回收成功（即回收液中确实含目的DNA），将回收成功的洗脱液放入冰箱，4保存待用。实验四 外源DNA在质粒载体中的克隆(连接)实验目的：1、学习将质粒与目的基因连接的原理及方法；2、将目的基因连接到T载体上，为转化作准备。材料与试剂：回收得到的DNA、T载体、T4连接酶、缓冲液实验原理：在PCR的延伸阶段，Taq酶能自动催化产物3末端加上多个腺嘌脱氧核苷酸（即ploy（A），pGEM-T和pGEM-T Easy载体利用了这一结果（这两种统称“T载体”，二者的区别是pGEM-T Easy载体的多克隆位点在插入序列的两端带有NoT I和 EcoR I切割位点），载体经EcoR V线化后，在3末端加上一系列T，在T4连接酶的作用下可直接克隆PCR产物。连接实验时，PCR产物不需酶切，和T-载体的连接类似于高效粘性末端的连接。实验步骤：1、 配备连接反应10 l体系（用EP管）：2、 3 l外源DNA；1 l载体；2buffer 5 l；1 l T4 ligase 加入各试剂后，可3000 r/min 瞬时离心，使试剂聚集到EP管底。3、 室温下放置 1 h后放入冰箱内4 过夜。实验五 感受态细胞的制备实验目的：1、学习感受态细胞的制备；2、制备感受态细胞，为导入目的基因作准备。材料与试剂：1、 大肠杆菌菌株 DH5。2、 LB液体培养基：NaCl 10gYeast extract 5gPeptone 10gAdd ddH2O to 1000ml调节pH至7.0，加热搅拌使固体全部溶解均匀，扎口后湿热灭菌处理。常温下放置或冷却后置冰箱4 保存。3、 0.1 mol/L CaCl2溶液：配制好后放入冰箱4保存。实验原理：受体细胞经过一些特殊方法的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许有外源DNA的载体分子通过，这种被处理的细胞叫感受态细胞（Competent cell）。目前，感受态细胞的制备常用冰预冷的CaCl2或RbCl(KCl)法处理细菌的方法制备，RbCl(KCl)制备的感受态转化效率较高，但CaCl2法操作简便。CaCl2法原理是利用低渗CaCl2溶液在低温（0 ）时处理幼嫩的细菌，从而获得感受态细菌。此时细菌膨胀成球形，外源DNA分子在此条件下易形成抗DNA酶的羟基钙磷酸复合物粘附在细菌表面，通过热激作用促进细胞对DNA的吸收。此外，还可以采用电穿孔的办法制备感受态细胞，其原理是利用瞬间高压在细胞上打孔，使外源基因易于进入，这里不作详述。实验步骤：1、 挑取-20保存的DH5单菌落于3 mL LB培养基中37摇床160r/min培养过夜（此为一级培养）。2、 取100 l一级培养菌液转接于5 ml 新鲜LB培养基中，在37摇床上剧烈振荡（200 r/min）培养至2.5-3小时，使细菌进入对数生长期（OD6000.6）。3、 将菌液迅速置于冰上。以下步骤在超净工作台和冰上操作。4、 吸取1.5ml二级培养菌液至1.5ml离心管中，在冰上冷却10分钟。5、 4000 r/min 离心5 min。6、 弃去上清（在无菌台上操作），加入 750l 0.1 mol/L CaCl2溶液，用微量移液器（枪）吹打均匀使细胞重悬，然后放回冰盒。7、 4000 r/min 离心5 min。8、 弃去上清（在无菌台上操作），加入 800l 0.1 mol/L CaCl2溶液，再次重悬菌体细胞。放入冰箱过夜，4 保存待用。如果暂时不用，可放置-70 长期保存。实验六 连接产物的转化实验目的：1、掌握热激法转化大肠杆菌感受态细胞的原理及方法；2、用连接产物转化大肠杆菌感受态细胞。材料与试剂：1、目的基因与T载体的连接产物。2、大肠杆菌感受态细胞。3、X-gal储液(20mg/ml)：事先用二甲基甲酰胺溶解X-gal（5-溴-4氯-3-吲哚-D-半乳糖苷）配制成20mg/ml的储液, 包以铝箔以防止受光照破坏, 储存于-20。4、IPTG储液(200mg/ml)：在800l蒸馏水中溶解200mg IPTG后，用蒸馏水定容至1ml，用0.22m滤膜过滤除菌，分装于EP管并储于-20。5、LB固体培养基：在LB液体中含有1.5琼脂粉（Agaragar）。实验原理：在CaCl2存在的情况下，加以热激，外源基因很容易进入感受态细胞。在选择培养基上就可以筛选出阳性克隆。实验步骤：1、 制备选择性培养基平板：在添加Amp的固体培养基平板上加入20 l X-gal (20mg/ml) 和 100 l IPTG (200mg/ml)，用涂布器涂均，然后静置使X-gal和IPTG被充分吸收。2、 取出制备好的感受态细胞，放在冰上融化。3、 取100 l感受态细胞，加入1l 连接产物，用移液器轻轻吸打均匀，置冰上10 min。4、 42水浴中热击90秒（这个时间要求很精确，请自带秒表），然后迅速置于冰上冷却3-5分钟。5、 向管中加入1ml LB液体培养基(不含Amp),混匀后37振荡培养1小时。6、 上述菌液摇匀后取100l 涂布于第一步制备的筛选平板上，正面向上放置半小时,待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37倒置培养过夜。实验七 聚合酶链式反应（PCR）筛选鉴定重组子实验目的：利用PCR筛选鉴定重组子材料与试剂： 转化产物、PCR引物、Taq酶、dNTP、10PCR buffer、dd H2O。实验原理：-互补现象筛选转化子是最常用的一种鉴定方法。由于载体上带有大肠杆菌-半乳糖苷酶基因(lacZ)的调控序列和-半乳糖苷酶N端146个氨基酸的编码序列，这个编码区中插入了一个多克隆位点, 但并没有破坏lacZ的阅读框架, 不影响其正常功能。这种lacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的-半乳糖苷酸阴性突变体之间实现互补的现象叫-互补。由-互补产生的Lac+ 细菌较易识别，它在生色底物X-gal下存在下被IPTG诱导形成蓝色菌落。当外源片段插入到pBS质粒的多克隆位点上后会导致读码框架改变, 表达蛋白失活, 产生的氨基酸片段失去-互补能力, 因此在同样条件下含重组质粒的转化子在生色诱导培养基上只能形成白色菌落。另外，由于转化成功的重组子含有600 bp的外源基因，因此如果对其进行菌落PCR，电泳、染色后在紫外照射下应该可以看到特异条带。实验步聚：1、 从筛选平板上挑取白色单菌落进行菌落PCR，其操作与实验一完全相同。2、 取10 l上述PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，然后染色，在紫外照射下进行观察（操作与实验二相同），注意是否有特异条带。照相保存结果。实验八 质粒DNA的提取与琼脂糖凝胶电泳检测实验目的：掌握碱裂解法抽提质粒的原理、步骤材料与试剂：1、 阳性克隆菌菌液。2、 溶液：50mmol / L葡萄糖、25mmol / L TrisCl、10mmol / L EDTA，调pH至8.0。溶液I可成批配制，每瓶约100ml，在湿热灭菌15min，贮存于4。3、 溶液：0.2mol / L NaOH （临用前用10mol / L贮存液现用现稀释）、1SDS；4、 溶液：5mol / L 乙酸钾 60ml冰乙酸 11.5ml水 28.5ml所配成的溶液对钾是3mol / L, 对乙酸根是5mol / L。5、 95%乙醇和70%乙醇。6、 含Amp的LB培养基平板。实验原理：质粒是独立于染色体外的，能自主复制且稳定遗传的环状的双链DNA分子，是可携带外源DNA进入细菌中扩增或表达的一种载体（这是实验室提取质粒的主要用途之一）。本实验中用到的阳性克隆就含有前述600 bp的外基因。质粒DNA的抽提包括细菌的培养、细菌的收集和裂解、质粒DNA的分离和纯化等步骤。本实验以碱裂解法介绍质粒DNA的小量制备。其原理是在pH12.0-12.6碱性环境中，细菌的线性大分子量染色体DNA变性，而共价闭环（CC）质粒DNA仍为自然状态。在高盐浓度下，将pH调至中性，染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构。大部分DNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而CC质粒DNA仍然为可溶状态。大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA和蛋白质可经离心去除，而质粒DNA尚在上清中，再用酚、氯仿抽提，进一步纯化质粒DNA。最终利用琼脂糖凝胶电泳检测提取效果（因为本实验中的质粒含有前述600 bp外源基因）。实验步骤：1、 用阳性克隆E.coli涂在LB平板上（含Amp），37培养过夜；2、 挑取第1步中的单菌落至5 ml LB 液体培养基中（含Amp），摇床250 r/min，37 培养过夜。3、 取上一步中菌液1.5 ml至EP管中，12000r/min 离心2 min，弃上清，收集菌体。用纸吸去培养液，使菌体尽可能干燥。4、 将细菌沉淀重悬于100l用冰预冷的溶液中，剧烈振荡，使沉淀完全分散。5、 加200l新配制的溶液，盖紧管口，快速颠倒EP管5次，以混合内容物；不要振荡，将EP管放置于冰上。6、 加150l用冰预冷的溶液，盖紧管口，将管倒置后温和地振荡10秒钟使溶液在粘稠地细菌裂解物中分散均匀，然后将管置于冰上3-5分钟。7、 微量离心机于4以12000g离心5分钟，将上清转移至另一EP管中，用微量移液器操作，并记下上清液体积。8、 向上清液中加入等量酚，12000 r/min 离心2 min，将上清转移至另一EP管中，用微量移液器操作，并记下上清液体积。9、 向上清液中加入等量氯仿，12000 r/min 离心2 min，将上清转移至另一EP管，用微量移液器操作，并记下上清液体积。10、 用2倍体积乙醇（95%或无水乙醇）沉淀ds DNA（双链DNA），振荡混合，于室温放置2 min。11、 12000 r/min，离心 5 min。12、 小心吸去上清液，将EP管倒置于一张纸巾上，以使所有液体流出，再将附于管壁的液滴除尽。13、 用1ml 70%乙醇于4洗涤dsDNA沉淀，按步骤12所述方法去掉上清，在空气中风干核酸沉淀。14、 加20 l ddH2O。15、 电泳染色，紫外检测，照相保存。方法同实验二。附：1、 手提式高压蒸气灭菌锅湿热原理与使用方法：原理：将待灭菌的物体放置在盛有适量水的高压蒸汽灭菌锅内。把锅内的水加热煮沸，并把其中原有的冷空气彻底驱尽后将锅密闭。再继续加热就会使锅内的蒸汽压逐渐上升，从而温度也随之上升到100以上。为达到良好的灭菌效果，一般要求温度应达到121(压力为0.1MPa)，时间维持15-30min。在这一温度下，蒸气可以穿透菌体甚至牙孢，因此效果明显。使用：向外锅内加入适量水（一定要高过电热丝），然后向内锅放入需要灭菌的器皿或试剂（事先用报纸包好），盖好锅盖，拧紧各旋钮，接通电源，加热一段时间排出空气（等到有大量大蒸气产生即可）。然后关上排气阀，使温度上升到121 左右，最高不超过128 ，一旦接近，马上关掉电源。保持在121 左右15-30min。完毕后让其自然冷却，压力表显示为0时打开安全阀，取出已灭菌的器皿。2、 干热灭菌烘箱的使用：将包好的器皿用报纸包好直接放入烘箱，然后关好烘箱，设定温度为160 -180，时间为1-2 h。灭菌完后，切勿立即打开烘箱，否则容易造成安全事故。而且干热灭菌法不适用于塑料制品！15