DNA损伤与修复和染色质维护

1会计学DNA损伤与修复和染色质维护损伤与修复和染色质维护第4章：DNA损伤与修复和染色质组装与维护第一节 DNA损伤的修复及其他响应系统第二节 染色质组装与染色质组装因子第三节 RecQ螺旋酶和CAF-1与基因组稳定性l 细胞中的DNA包含着完整的遗传信息，真核生物DNA与组蛋白相互作用形成高度有序的染色质。DNA与染色质在配子与合子形成、以及之后个体生长发育的细胞活动与基因表达过程中，都处于一种动态变化。l 正常细胞具有一整套修复DNA损伤和染色质维护系统，以维持基因组稳定与DNA的完整，确保遗传信息准确无误地传至下一代，以及细胞功能的正常执行。l DNA损伤及其修复与染色质组装及其维持，都直接损害基因组的稳定性。基因组的稳定性遭到破坏，会导致多种遗传、代谢性疾病或肿瘤的发生。因此对基因组稳定性调控和DNA修复机制的研究，是生物医学科学的重要领域。第一节 DNA损伤的修复及其他响应系统一、DNA损伤（DNA damage)u DNA损伤即DNA分子物质的损伤。 生物体细胞中的DNA 每时每刻都在遭受着损伤，有研究估测人的每细胞每天会有1100万个的分子伤害，虽然即便是100万个的分子伤害近相当于人基因组的百万分分之1.65（按人的双倍体基因组的含60亿对碱基推算）。但如果有伤害发生在关键的基因(如抑癌基因)而未能修复，就会障碍细胞执行其应有的能力， 并明显增加形成肿瘤的可能性和有利于肿瘤异质性。因素体内：DNA复制与染色质组装错误、自发性损伤、代谢副产物 如活性氧物质ROS 、自由基等。环境：物理因素：如X、射线，紫外线，亚原子微粒等化学因素：直接致癌或间接致癌的化学物质等生物因素：病毒、霉菌等u机体内与体外环境中有多种因素可以导致DNA的不同损伤。(1)碱基缺失(base loss) DNA上的脱氧核糖和碱基的糖苷键在生理条件下并不太稳定，哺乳动物细胞中每天会有几千个嘌呤和几百个嘧啶的自然缺失，产生无嘌呤或无嘧啶位点 (AP site, apurininc/apyrimidic site)(thermal disruption depurination)图5-1碱基缺失uDNA损伤的类型包括碱的基缺失、修饰、错误；DNA链间和分子的交联；以至于DNA单、双链的断裂等类型。(2)碱基修饰(base modification)主要3类图5-2脱氨反应A IC U213465(CH3)(5mC) (T)(NH2)(CH3)(5-methyl-)(thymidine)(guanine)(G)脱氨基: 核酸碱基上的氨基也有些不稳定，胞嘧啶C4 脱氨基：CU)，5mCT。发生率：每单倍体基因组每天以这种方式产生大约100个尿嘧啶。 其他的脱氨基反应包括腺嘌呤(A)或鸟嘌呤(G)转变为次黄嘌呤(I)（hydrolysis of bases） 化学修饰: DNA可以被很多化学修饰 。细胞氧化代谢过程中，或细胞受到电离辐射作用后 会产生图5-3氧化修饰 除活性氧外，环境中的许多化学物质是烷化剂，可以使DNA加上甲基或其他烷基基团，哺乳动物二倍体基因组每天可以产生好几千个烷化的碱基。(alkylation)一些活性氧（纯态氧、过氧化氢物自由基、过氧化氢，羟自由基），活性氧能对碱基进行化学修饰，最普通的例子是胸腺嘧啶变成胸腺乙二醇（图5-3）(oxidation) 。 光损伤: 细胞受到 X 光、紫外线照射后，其能量能使DAN发生一些化学反应，最常见的是产生一个新的化学键而形成环丁烷嘧啶二聚体(cyclobutane pyrimidine dimers ，CPDs), 其中 T-T CPDs 最常见，T-C/C-T 其次，C-C较少。（图5-4）图5-4胸腺嘧啶二聚体 Thymine Dimer(3)复制错误( replication errors)尽管DNA聚合酶非常精确，而且大多数复制过程中产生的错误都会被迅速消除，但复制系统并非完美，DNA复制过程仍然会产生碱基的错配、插入或丢失的错误。(4)链间交联( interstrand crosslinks，ICLs) 指不同DNA链上的碱基间发生连接，主要由一些双功能烷化剂如补骨脂素(psoralens) 引起，UV 照射与电离辐射也会导致链间交联(5) DNA-蛋白交联( DNA-protein crosslinks) DNA拓扑异构酶在催化反应时会与DNA之间形成共价键，通常这种共价键是瞬时可逆的，但偶然也会发生这个共价键没及时断开而形成DNA与蛋白之间稳定的交联。(6) DNA 断裂( DNA strand breaks) 正常细胞代谢过程中，拓扑异构酶、核酸酶、复制叉的崩溃(collapse)和一些修复过程中都可能产生DAN单链或双链的断裂，但发生的概率特别低。较强的电离辐射可导致 DNA 断裂。二、DNA损伤的修复（DNA repair)u所用生物大分子中只有DNA损伤后会进行修复，其他的大分子损伤后都只是被新的分子替代。细胞可以检测DNA损伤造成的双螺旋空间构象变化，并根据对 DNA 的双螺旋结构造成损害的类型，采用不同的机制修复损伤：1)在可能的情况下，细胞会使用的未经修改的互补单链 DNA 或姐妹的染色单体为模板，以恢复原始信息。2)在无模板可用的请况下，细胞使用某种 “跨损伤合成” (translesion synthesis) 的机制作为最后的手段。uDNA修复的机制根据修复方式的不同可分为四大类：（一）直接修复(direct reversal)（二）切除修复(excision repair)（三）双链断裂修复(DNA double-strand break repair)（四）损伤旁路（damage bypass）（一）直接修复(direct reversal)直接修复就是将受损伤的DNA通过生化反应直接逆转为正常的DNA分子。已发现有三种方式：MTHF和8-HDF光能的接受基团接受光，能随后将能量转FADH-，CPD光合裂解酶利用FADH-上的能量将二聚体解聚为单体(图5-5)图5-5CPD 光修复模式图（1）CPD光合裂解酶介导的对CPDs的光修复(photoreactivation)：CPD光解酶(photolyase)含有两个生色团负责吸收光能。有一个是在所有的光合裂解酶的生色团是共有的，即FADH2-(1,5-二氢黄素 腺嘌呤二核苷酸)，而另外的一个生色团是MTHF (次甲基-四叶酸)或 8-HDF(8-羟基-5-去氮杂核黄素)。(300500 nm )CPD光合裂解酶在细菌、真菌、植物和其他的脊椎动物中都广泛存在，但是在胎盘哺乳动物中并没有发现。（2）甲基鸟嘌呤甲基转移酶(MGMT) 介导的修复这是一种修复DAN鸟嘌呤甲基化损害的方式。MGMT（methylguanine methyltransferaseO6-methylguanine DNA methyltransferase）将甲基鸟嘌呤的甲基转移到半胱氨酸上，从而将此种烷基化损害修复。Demethylation of 6-O-Methylguanosine to Guanosine（O6mG G）MGMT这种修复牺牲以MGMT为代价，因为，一旦烷基基团转到这种烷基转移酶上，那么它将永久地失去活性。所以MGMT介导反应并非真正意义上的酶促（catalytic)反应，而是计量化学（stoichiometric）反应。（3）某些胞嘧啶和腺嘌呤甲基化伤害的逆转。（前已讨论）（二）切除修复(excision repair)l DNA单链损伤（Single-strand damage）的修复方式。即通过核酸酶切除受损的碱基，再以正常链为模板通过DNA聚合酶在3-0H端处延伸DNA连接酶把缺口接上。包括: 碱基切除修复(BER-base excision repair)，修复因氧化，烃化，水解或脱氨等单个损伤的碱基)；核苷切除修复(NER-nucleotide excision repair), 修复引起螺旋变化的核苷，包括CPDs)；错配修复(MR-mismatch repair) 等。 碱基切除修复(BER)： 一般分三步需四种酶参与: (1)特异的糖苷酶(glycosylase)催化连接损伤碱基与脱氧核糖之间的糖苷键水解，释放游离碱基并在DNA中产生一个去碱基位点(AP site)；(2)由去嘌呤/去嘧啶(AP)核酸内切酶在去碱基位点的上游切出一个缺口，生成一个3-OH; (3) DNA聚合酶在3-OH端处延伸，DNA连接酶把缺口接上。图5-6碱基切除修复启始阶段示意damagedAP site*（糖苷酶）(AP)3-OH 多数糖苷酶只识别一种损伤。 虽然细胞中有多种糖苷酶，但是它们无法对付所有的DNA损伤。 核苷切除修复(NER):是一种更灵活的DNA修复机制，通过识别DNA上不正常的结构和不正常的化学特性来识别DNA损伤并且将这些受损的核苷酸切除。 核苷酸切除修复的过程更加复杂，参与的蛋白更多。表5-2中列出了在核苷酸切除修复中发挥重要功能的蛋白分子及其可能参与的步骤。其中有些蛋白识别损伤位点，有些蛋白参与对核苷酸的切除。这些蛋白大多都有相互作用并且形成一个大的复合体。 核苷酸切除修复的过程：首先由多聚体复合物识别损伤，再在损伤的两侧进行切除。随着DNA链被解开，包含损伤的单链片段释放出来，留下的缺口由DNA聚合酶填补，DNA连接酶封闭。该途径包括20种以上蛋白，可以修复紫外辐射诱导的环丁烷嘧啶二聚体(CPD)和一些化学物质产生的大加合物。 NER可再分为两条子途径(1) 全基因组修复(globalgenomic repair，GGR)途径:修复整个基因组内的损伤，其效率取决于损伤的化学特性、损伤部位的DNA序列和染色质结构。 (2)转录偶联修复(trancsription-coupled repair，TCR)途径:特异地修复基因组中具有转录活性的基因的被转录DNA链上的损伤，该途径的特点是依赖RNA聚合酶催化的转录，其中的一些蛋白是普通转录因子TF IIH的亚基。 错配修复(mismatch repair，MMR)：主要负责修复DNA复制过程中产生的错误配对的碱基。它通过检查新生DNA链有无错配碱基，并将其切除，以正确的序列补上缺口。 错配修复基因的认识首先来源于对Ecoli的研究。Ecoli中承担错配修复主要任务的是MutS (Mutator S)、MutL和MutH, 它们都是同源二聚体的形式结合在DNA上发挥功能的。MutS会识别新生链上的错配碱基并结合上去，随后MutL也会结合在这个DNA-蛋白的复合体上并且对它们的结合起着稳定的作用。MutS-L复合物会移位到GATCm位点，激活结合上来的 MutH (核酸内切酶)，在子链未甲基化的-GATCm序列靠近鸟嘌呤的5-端造成一个切口，使包括错配碱基在内的数百个核苷酸得以切除。其后DNA聚合酶和DNA连接酶的合作，以正确的链为模板合成正确的新生链。但利用DNA序列甲基化来区分母链与新生DNA链可能只是特有地存在于Ecoli中。5-GATCm-GATCm-33-CTAG -X-CTAG-5 图5-7原核细胞的错配修复X（被切除的含错配片段） 真核细胞中存在多种MutS和MutL的同源物，其中在人的细胞中存在5种MutS的同源物hMSH2-6和3种MutL的同源物hMLH 1、hPMS2和hPMS1，蛋白从序列到蛋白功能都具有相似性。MutS的同源物也是识别错配碱基并结合上去，之后MutL的同源蛋白再结合在此复合体上。与原核细胞中不同的是，真核细胞MutS和MutL的同源蛋白是以异源二聚体的形式发挥作用的。 人细胞中MutS异源二聚体，主要以2种：MutS(MSH2-MSH6)，MutS 。MutS主要识别单个碱基的错配和小的碱基插入或缺失而形成的环(12个碱基); 而MutS 主要识别的是大一点的环（210个碱基）。 真核细胞中MutL异源二聚体，主要3种(都包括MLH1)：MutL，由PMSl(酵母)或PMS2(人)和细胞中90%的MLH1组成；MutL，由MLH1和MLH2(酵母)或PMS1(人)组成；MutL包括MLH1和MSH3。图5-9 真核细胞的错配修复MutS-MutL二聚体联合体识别并结合在错配碱基上，联合RFC、PCNA等修复蛋白参与真核细胞DNA错配修复。*RFC=Replication factor C，a protein complex.*PCNA=Proliferating cell nuclear antigen, a DNA clamp Diagram of DNA MMR pathways(a) Eukaryotesproofreading (nicks present)(b)Most bacteria Similar to (a)(c) E. colihemimethylation(gram-negative) 错配修复途径（真核与细菌比较）Science 23 December 2011: Vol. 334 no. 6063 pp. 1713-1716 DOI: 10.1126/science.1210770（三）双链断裂修复(DNA double-strand break repair)双链DNA断裂的修复分为两种不同的机制：同源重组修复和非同源末端连接。这两条通路都由多个修复蛋白参与，经过多步反应修复受损的DNA。(1)同源重组修复( homologous recombinational repair，HRR)通过同源重组的方式，从姊妹链或同源的染色体上获得正确的遗传信息，对断裂的DNA进行正确的修复。大致的过程是：（图5-10）u 首先由细胞中的核酸外切酶, 如MRE11/Rad50/NBS1(MRN)复合体中的MRE11对DNA断裂末端进行53方向的切割加工，暴露出3单链DNA末端，后者与复制蛋白RPA(replication protein A)分子结合，DNA单链被稳定并保护，防止形成二级结构。u HR修复的关键步骤是Rad51依赖性链侵入过程。Rad51是大肠杆菌RecA在真核细胞中的同源物，具有DNA依赖的ATPase活性，是HRR修复途径中的核心分子，催化同源序列的寻找、链配对和链交换过程。 Rad51竞争性地置换掉结合在3单链DNA末端上的RPA分子，并覆盖在暴露的DNA单链上，形成“核蛋白丝”( nucleoprotein filament)。 Rad51引导和蛋白丝识别同源DNA模板并催化DNA链的配对，延伸并形成Holliday 联结，完成链间的交换过程。u Holliday联结经核酸酶和连接酶切割连接后接替，得到两个完整的双链DNA分子。u 此外，ATM、ATR、BRCA1、BRCA2、P53和Chk1都对HR起很重要的调控作用。 两种主要同源重组修复模式:DSBR (double-strand break repair双链断裂修复) pathway (sometimes called the double Holliday junction model): the second 3 overhang (which was not involved in strand invasion) also forms a Holliday junction with the homologous chromosome. form double Holliday junctions. commonly crossover (in meiosis).SDSA (synthesis-dependent strand annealing合成依赖性单链退火 ) pathway: occurs in cells that divide through mitosis and meiosis and results in non-crossover products. 图5-10同源重组修复示意图DHJRad51-ssDNA filament(nucleoprotein filament)DSBssDNAMRE11Rad51D-loopinvasionbindingHolliday junction DNA pol synthesis Repared DNA Dnase+ligase resectionCutiing+ligation SDSA pathway (in humans)SSA (single-strand annealing单链退火） pathway Two additional pathways for HRR:SSA 修复两重复序列DNA间的双链断裂。与DSBR 和SDSA 不同，SSA 不需要另一相似或相同的DNA分子，它只在同一分子发生，利用的是同一双链DNA的与损伤部分重复作为他等同序列进行同源重组修复。SSA的过程相对简单，DNA双链断裂后，断口由53回向修切,形成突出的3端单链（single-stranded 3 overhangs ），RPA 结合突出的3端单链防止其自身的粘缠，Rad52结合到两个3端的复序列 并使其退火配对，突出3端单链剩余未配对的部分则由被Saw1 和Slx4蛋白带入的一组核酸酶Rad1/Rad10切除，剩有的空缺再由新DNA合成填补，最后由连接酶作用连接成为连续不断的双链DNA。由于SSA会导致遗传物质（两重复间序列）丢失，因此被认为是致突变性的（mutagenic）SBIR（break-induced replication ）DNA复制过程中，有时可能发生在复制叉模板DNA解链时，这种断裂可由同源重组的BIR途径修复。 BIR途径也可帮助端粒长度的维持。BIR途途径的具体分子机制还不是很清楚，启示的步骤都有DNA链的侵入（strand invasion）但D环的移行及其后的重组过程不同。For more ditails, see the revew paper titled “Break-Induced Replication and Recombinational Telomere Elongation in Yeast” at : http:/www.annualreviews.org/doi/abs/10.1146/annurev.biochem.74.082803.133234S(2)非同源末端连接(non-homologous end joining，NHEJ)非同源重组末端连接是指在双链断裂处两端DNA在一些修复蛋白的参与下直接连接的修复过程，这个修复过程从细菌到哺乳动物都是高度保守的。NHEJ的过程大致为：(图5-11） 首先，一些特异的末端结合因子（如Ku蛋白）结合在双链断裂处，在断裂处形成一个环状结构，保护DNA不被核酸酶降解，以确保遗传信息不被丢失，同时招募其他一些修复蛋白，如DNA-PK； 其次，双链断裂两个末端结合的蛋白通过相互作用( Ku-Ku相互作用，DNA-PK间相互作用)使断裂处的蛋白相互靠近，这一步是NHEJ中的关键步骤； 最后，靠近的DNA两末端通过DNA连接酶直接连接或经加工处理，如除去双链断裂末端的磷酸基因后被连接(图5-11)。产生的DNA断裂形式多样，有些断裂可能不适合直接连接，这时就需要在两个末端去除几个核苷酸然后再连接起来。 参与非同源末端连接的蛋白除了上面几种外，还包括XRCC4，XLF和DNA连接酶IV蛋白(表5-3)，这些蛋白都被Ku蛋白招募到双链断裂处完成NHEJ。 此外，ATM、53BP1、MRN复合体和H2AX等蛋白都参与了NHEJ的修复通路。图5-11非同源重组末端连接示意图u 双键断裂处的染色体修饰：双键断裂处的染色体修饰：哺乳动物细胞中，有一小部分的组蛋白哺乳动物细胞中，有一小部分的组蛋白H2AX（酵母叫（酵母叫-H2AX），这种形），这种形式是细胞在受到式是细胞在受到DNA损伤时，损伤时，H2A的的139位的丝氨酸位的丝氨酸被被ATM或或ATR激酶激酶磷磷酸化酸化的结果。的结果。 -H2AX能够帮助招募能稳定姐妹染色单体的蛋白在双链断裂处，这样能够帮助招募能稳定姐妹染色单体的蛋白在双链断裂处，这样有助于进行以另一条姐妹单体为模板的同源重组修复，否则只能以出有助于进行以另一条姐妹单体为模板的同源重组修复，否则只能以出错率高的末端连接来修复双链断裂。错率高的末端连接来修复双链断裂。 还有实验证明还有实验证明-H2AX能够将一种染色体重塑能够将一种染色体重塑( chromatin remodeling)的蛋白复合体的蛋白复合体(IN080)招募到双链断裂处，之后进行的染色体重塑会帮招募到双链断裂处，之后进行的染色体重塑会帮助助DNA断裂末端进行切割加工，断裂末端进行切割加工，（四）损伤旁路（damage bypass）有些情况下，损伤可能修复不了，或者切除修复还没有来得及修复受有些情况下，损伤可能修复不了，或者切除修复还没有来得及修复受损的损的DNA，这时候，这时候DNA可能会允许这些可能会允许这些DNA损伤的存在而继续进行复损伤的存在而继续进行复制，这就是所说的制，这就是所说的损伤旁路损伤旁路，即跨损伤合成即跨损伤合成 (translesion synthesis)。 细胞能够这样做的原因目前认为有两个，第一，长时间或者经常地细胞能够这样做的原因目前认为有两个，第一，长时间或者经常地中止复制叉前景会导致细胞死亡；第二，及时复制过程中一条单链中止复制叉前景会导致细胞死亡；第二，及时复制过程中一条单链受损，只要另一条姐妹单链没有问题，还可以在以后通过同源重组受损，只要另一条姐妹单链没有问题，还可以在以后通过同源重组的方式来修复受损的的方式来修复受损的DNA链。链。 其实严格来讲，损伤旁路并不算是一种其实严格来讲，损伤旁路并不算是一种DNA损伤修复，因为损伤依损伤修复，因为损伤依然存在，至少是暂时存在。但是，损伤旁路依然是细胞应对然存在，至少是暂时存在。但是，损伤旁路依然是细胞应对DNA损损伤的非常重要的一种方式。伤的非常重要的一种方式。 Rad6和和Rad18对对DNA损伤旁路必需的基因损伤旁路必需的基因三、DNA受损后细胞的其他响应系统DNA受到损伤后，细胞除了启动DNA修复系统修复受损DNA外，还会有其他的一些措施来应对DNA损伤带来的危害，这些措施包括某些基因表达的变化，细胞周期监控点激活以及细胞凋亡。（一）DNA受损后细胞内基因的表达变化细胞的DNA受损后，有一系列的基因表达会发生变化，这些基因包括参与DNA修复的基因，有可能参与DNA修复的基因以及一些未知功能的基因。（1）巳知DNA修复基因，包括：参与核苷酸切除修复的基因(Rad2、Rad7、Rad16、Rad23和SMN)，参与损伤旁路的基因（Rad6、Rad18）和参与同源重组修复的基因（Rad51）等。（2）可能参与DNA修复基因 (也会被DNA损伤诱导）包括：RNR1、RNR2和RNR3基因，这三个基因编码核苷酸还原酶的不同亚基；另还有CDC17(POL1)基因，编码酵母中的DNA聚合酶。有一些基因的突变会使 RNR3基因的组成型高表达，这些基因称为CRT(constitutive RNR3 transcription) 基因，目前已鉴定有5种：TUP1、POL1、RNR2、NR1和SSN6 。还有一类基因的突变则会抑制DNA损伤后RNR3基因的表达，这些基因被命名为DUN1至DUN5。DUN1基因突变的细胞会对UV以及烷基化试剂MMS更加敏感，并且在诱导RNR1和RNR2基因表达方面有缺陷。（3）一些未知功能的基因：诱导一些未知功能的基因的表达。如DIN (damage inducible)的基因、DDR(damage-responsive)基因， 等。（二）DN A受损后细胞周期的停滞l 细胞周期监控与DNA损伤修复密不可分，DNA受损后，细胞周期监控点效应启动，将细胞周期进程阻滞，给予DNA修复系统以足够的时间来修复受损的DNA。l DNA发生损伤时探讨最多的监控点是G1/S，intra-S和 G2/M监控点，其中intra-S监控点主要针对的是复制的过程，它识别DNA复制的中间物并且停下复制叉，抑制有丝分裂的进行。l 识别DNA损伤信号的感受蛋白分包括：感受因子、中介因子、信号转导因子和效应因子4类。DNA损伤反应首先通过感受因子检测到DNA损伤，然后又通过中介因子和信号转导因子将损伤信号传递给下游的效应因子。效应因子会引发一系列的时间，包括细胞周期停滞，DNA修复等。（三）细胞凋亡l DNA损伤诱发细胞凋亡的主要信号通路是p53蛋白依赖性的。 DNA损伤通过对一些激酶如ATM和DNA-PK激活p53并增加其稳定性。接着p53诱导促凋亡蛋白Bcl-2家族中的 Bax和 IGF-BP（胰岛素生长因子结合蛋白）最终引发半胱天冬蛋白酶(caspases)的激活，继而引发细胞凋亡。第二节 染色质组装与染色质组装因子一、染色质组装-图4-1u在每个真核细胞中，DNA序列包含的遗传信息有选择地对外界信号快速地做出反应从而确定基因的表达模式。调节这些过程的一个重要方式是把它组装并维持为染色质。u染色质装配包含一系列事件，从核小体的形成开始，到在细胞核里形成一个复杂的具有特殊结构域的染色质结构。u随着细胞分裂和机体发育过程中环境的变化，染色质组装及由此形成的特定细胞核区域的结构状态也相应做出改变。在分裂活跃的真核细胞中，染色质组装主要发生在DNA复制期间，这时新合成的组蛋白会结合到复制好的DNA分子上。u图4-1是DNA装配成染色质的整个过程：H3-H4四聚体的结合两个H2A-H2B二聚体的加入形成一个核心粒子, 新合成的组蛋白H4的Lys5和Lys12两个位点被去乙酰化ATP创建一个规则的间距以及组蛋白的去乙酰化H1的结合伴随着核小体的折叠。图4-1DNA 装配成染色质的过程及各阶段的调节蛋白因子 真核细胞中基因组DNA首先在特异的组蛋白伴侣分子协助下与有两个乙酰化的H3-H4异二聚体组成的四聚体结合， 随后两侧分别结合一个H2A-H2B异二聚体，形成核小体。这时形成的核小体是没有最终定位的，只有在一些染色质重塑因子以及组蛋白修饰酶（如去乙酰化酶）的共同作用下，核小体被正确排列在DNA上。 最后，在染色质重塑因子及其他因子（如HP1）的作用下，染色质进一步浓缩，同时区域性的组蛋白变构体在特异组蛋白伴侣分子的作用掺入染色之中以维持染色质的高级结构。二、染色质组装因子1（CAF-1)u染色质组装因子1 (chromotin assembly factor 1，CAF-1)是一种参与染色质组装过程的蛋白复合体，对于染色质的正确装配及维持基因组的完整性非常重要。CAF-1在人的细胞中有三个亚基，p150、p60和p48，且在不同的物种中都高度保守（表4-1）。 三个亚基(p150、p60、p48(p50)含有不同的结构域：p150含有PEST、KER和ED结构域，p60含有WD重复结构域及PEST结构域，而p48主要只含有WD重复结构域。它们的结构组成见图4-2。*p150CHAF1A; p60CHAF1B;图4-2人CAF-1 三亚基的结构示意图复制活性区的组装：与DNA复制相偶联的核小体组装的活性区域 p150中含有多个不同的结构域，包括PEST、KER和ED。它通过酸性的KER和ED结构域与新合成的并且乙酰化的组蛋白相互作用，p150上还存在多个位点与PCNA蛋白作用。p60亚基也有几个截然不同的结构特征。p60有一个PEST结构域和一个WD重复区域（其中包含7个WD重复单位）。p60和p150都有几个磷酸化位点（每个位点的生理意义还不确定）。p48亚基在人体细胞的细胞核和细胞质提取物中含量丰富。它单独与其他蛋白质协同作用，作为复合体的一个组分参与到许多生物的组蛋白代谢过程中，它比p150有更多的功能，作为一个“联络”因子在细胞复合物之间发挥作用，p48与还人去乙酰转移酶HDAC1的催化亚基协同，有去乙酰化作用。uCAF-1是一个协助H3-H4四聚体装载的伴侣分子，这个过程是独特的，因为它偏向于新合成（复制或者修复）的DNA。CAF-1是介导新复制的DNA装配成染包质过程的主要蛋白因子之一。CAF-1不但参与S期特异的染色质的组装，而且对于增殖细胞的生存都是必要的。u最近的研究表明：CAF-1通过表观遗传调控而参与调节异染色质的形成；基因的沉默与表达；DNA的修复。这些调节过程需要CAF-1与诸多其他因子相互作用（见图43）图4-3与CAF-1 相关的组蛋白修饰图解 新合成的H4上K5和K12位的乙酰化、H3K27位的甲基化都受p48亚基的调节p150与H3K70的甲基化、H3K56的乙酰化、H3K9的甲基化及H3Sl0的磷酸化有关；p60则调控H2AK119位的泛素化。第三节 RecQ螺旋酶和CAF-1与基因组稳定性一、基本介绍二、R ecQ螺旋酶的生化特征与细胞定位三、RecQ嫘旋酶的功能（一）DNA复制（二）DNA重组（三）DNA修复四、 RecQ螺旋酶与遗传疾病（一）BLM及其相互作用蛋白（二）WRN及其相互作用蛋白（三）RecQ4及其相互作用蛋白（四）RecQ5及其相互作用蛋白一、基本介绍u螺旋酶( helicase)在细胞中的主要作用是催化核酸分子的解旋和解链，其能量通常来源于ATP的水解。大多数螺旋酶或能解开DNA双链，或能解开RNA双链。然而还有一些螺旋酶在能解开DNA双链和RNA双链的同时还能解开DNA与RNA形成的杂合体。u 螺旋酶在自然界中普遍存在，在几乎所有的核酸代谢过程中发挥不可缺少的作用。这些过程主要包括：染色体和质粒的复制、DNA转录与RNA翻译、RNA加工和DNA重组与修复。真核生物中大约1%的基因编码RNA或DNA螺旋酶。In humans, 95 non-redundant helicases are coded for in the genome, 64 RNA helicases and 31 DNA helicases.uDNA螺旋酶主要可以根据以下两种方式进行分类：根据它们的作用模式。大部分螺旋酶都以确定的方向结合到DNA链上，这种方向是相对于它们所结合的DNA链而言，35 (type A)或者53(typeB).这种分类方式只适用于其中某些螺旋酶，它们的作用模式是：首先结合到单链DNA的末端，然后沿着末端开始解开DNA双链。根据它们序列的保守程度。按照这种方法划分，目前螺旋酶至少包括6个超家族(superfamily, SF16)。其中SF2成员最多。SF1主要包含以下4种螺旋酶： Rad25，Rad3，SWI2/SNF2和RecQ .二、R ecQ螺旋酶的生化特征与细胞定位RecQ螺旋酶广泛分布在各种生物体中，范围从大肠杆菌、酵母、果蝇、两栖类到人，并且在各种生物体中它们的序列相似性很高（图4-4）。一般来说，单细胞有机体中只表达一种RecQ螺旋酶；而稍复杂的生物有机体则表达两种以上的RecQ螺旋酶。例如在人体中，目前已发现有5个RecQ螺旋酶家族成员。 在所有序列中，一个共同的特征是其中都含有一个高度保守的螺旋酶区域(helicase domain)。这段区域由大约400个氨基酸组成，通常位于螺旋酶的中间部分，其中包含7个为大多数DNA和RNA螺旋酶所特有的氨基酸序列基序(I，Ia，)。它们与蛋白质间的相互作用有关。 在螺旋酶区域的C端是RQC(RecQ family C-terminal)区域，该结构也是RecQ螺旋酶家族所特有的，与蛋白质间的相互作用有关。然而，RQC结构区在有些RecQ螺旋酶序列中并不存在，这可能是由于它的序列跟其他序列相比没有足够显著的差异所以无法直接鉴定出。 另外，在RecQ螺旋酶的C端还含有HRDC(helicase RNaseD C -terminal)结构域，可能在ssDNA的结合中发挥作用。 在有些RecQ基因，如WRN（Werner综合征螺旋酶）、FFA-1的N端还含有外切核酸酶结构区(exonuclease domain) 此外，在某些RecQ基因中存在核定位信号(nuclear localization signal，NLS) 除了以上主要结构域，RecQ螺旋酶之间的序列相似性基本上不存在。图4-4RecQ 螺旋酶家族各成员在不同生物体中的结构示意图u RecQ螺旋酶主要有两大生化特性： (1) ATP酶活性：RecQ螺旋酶的ATP酶活性依赖于DNA和Mg2+。除了Sgsl外，对于其他螺旋酶而言，单链DNA比双链DNA更能增强螺旋酶的ATP酶活性，而且单链DNA越长，这种活性越强。在作用过程中，RecQ螺旋酶沿着单链DNA向前移动。Mg2+辅助因子也可以被Ca2+或Mn2+替换，但是不能由Zn2+替换，因为Zn2+是ATPase的抑制因子。RecQ螺旋酶除了具有ATP酶活性外还可能具有GTP酶活性。据报道DmRecQ5仪和hBLM也能利用GTP和dGTP水解释放能量。(2)螺旋酶活性：RecQ螺旋酶具有解旋和解链的功能，在核酸代谢和基因表达过程中发挥重要的作用。这种螺旋酶活性依赖于ATP的水解，而ATP的水解本身又依赖于Mg2+。 RecQ螺旋酶是以相对于它所结合的DNA链的方向，由35开始解开DNA的互补双链。 RecQ螺旋酶的这两大生化特性，使它们能够解开多种DNA结构。如BLM和WRN能解开3末端的双链、泡状结构、叉状结构、G一四联体、DNA置换环、四路holliday中间体。RecQl也具有类似功能，但是不能解开G一四联体。RecQ5主要倾向于揭开叉状DNA结构，而解开holliday中间体和泡状结构的能力较弱。 除了通常的解链活性，RecQl，BLM，WRN还能依赖ATP促进holliday链接的迁移，这种迁移能横跨几个kb。此外， 目前发现BLIVI和RecQ5具有ssDNA退火的活性，这种看似奇怪的特性与螺旋酶解开DNA取链特性恰恰相反，尚需进一步研究。uRecQ螺旋酶在细胞中的定位 RecQ螺旋酶在细胞中的定位一般是随着细胞生长的不同条件而动态变化。在有些体外培养的细胞中，尤其是在细胞S期中的某些阶段，发现BLM（RecQ2）定位在核仁中。当细胞接触能引起DNA损伤的试剂或复制抑制剂时，BLM又重新定位到正在进行DNA修复的位点（RAD51核区）。在损伤条件下，除RAD51外，BLM和参与DNA修复的其他几个蛋白因子发生共定位现象，这些蛋白包括：MLH1错配修复蛋白、BRCA1和RPA(replication protein A)。 WRN蛋白的亚细胞核定位同样是动态的。在未损伤的人体细胞中，WRN主要位于核仁；在有些细胞中，WRN也发现能定位在核浆里。当正在进行的DNA合成被抑制剂（例如hydroxyurea）所阻断时，WRN与RAD51则共同转移到DNA损伤区参与DNA的修复。 RecQ4蛋白在不同细胞中的分布也是变化的。有研究表明在HeLa细胞中RecQ4蛋白大部分位于细胞质中，然而在未转化酌WI-38纤维原细胞中，RecQ4蛋白大多数分布在细胞核里，并且与HeLa细胞相比RecQ4蛋白的含量在WI-38纤维原细胞中更低。说明RecQ4蛋白在不同细胞中可能的功能变化。 不同RecQ4蛋白在细胞中的定位也有不同。人的最大的RECQ5异构体RECQ5 (991aa)，是定位于细胞核质中，而蛋白编码较少的异构体RECQ5 (410aa) 和RECQ5(435aa) 没有C端，因而不存在核定位信号（854aa-872aa），只位于细胞质中。RECQ5 p(991aa)潜在的核定位信号为KRPRSQQENPESQPQKRPR，果蝇的两个短RECQ5异构体与人不一样，始于432或433残基，具有可能的C端核定位信号KRPK和RPKK，有可能定位于细胞核核三、RecQ螺旋酶的功能u RecQ螺旋酶在维持基因组的完整性上发挥至关重要的作用。在人体中RecQ螺旋酶发生突变将会导致基因组的不稳定，其生物学效应是对各种肿瘤的敏感性而最终引发各种疾病，BLIVL、WRN和RecQ4的突变将分别导致产生Bloom综合征(Bloomsyndrome)、Werner综合征(Werner syndrome)和Rothmund-thomson综合征(Rothmund-thomsonsyndrome)。到目前为止，人们还未发现RecQL和RecQ5与任何人类遗传疾病具有相关性。正是由于RecQ螺旋酶在维持基因组稳定性中的关键作用，RecQ螺旋酶才被人们形象地称为“基因组卫士”。归纳起来讲，RecQ螺旋酶主要在以下4个方面发挥作用：（一）DNA复制（二）DNA重组（三）DNA修复（四）端粒的维护（一）RecQ螺旋酶在DNA复制方面的作用 细胞中DNA复制整个过程受到严密的监视和控制，需要大量蛋白因子的共同参与，相互协作和共同调节。这些因子主要有DNA聚合酶、拓扑异构酶、RPA、WHIP和FEN1等。RecQ螺旋酶与它们之间有相互作用，参与DNA复制过程并且发挥重要的作用。图4-5图4-5RecQ 螺旋酶在DNA 复制中的作用(A)RecQ螺旋酶在DNA复制过程中可能是“障碍清除器”-清除这些异常的二级结构结构, 从而促进DNA复制叉继续前进。(B)复制叉的移动以及前导链的合成受阻时，以新合成的后滞链为模板合成前导链，从而有效地绕过障碍物，最终在RecQ螺旋酶的帮助下重新形成一个复制叉使得DNA复制继续进行，保证DNA复制的稳定性。（二）RecQ螺旋酶在DNA重组方面的作用 DNA重组，主要是同源重组，对于维持机体中基因组的稳定性发挥重要作用。但是不可控或不合时宜的重组事件能导致基因组重排，比如杂合性缺失，这被认为能够导致肿瘤发生。 正常细胞中RecQ螺旋酶被认为能在不同场合行使促重组酶和抗重组酶双重角色。如图4-6所示，在重组中，当一条单链尾巴侵入到互补双链中形成D环结构时，图4-6 RecQ 螺旋酶在同源重组早期过程中具有抗重组酶作用RecQ螺旋酶会通过破坏这个D环结构而抑制非正常的同源重组现象，这对于维持基因组的完整性非常重要。（三）RecQ螺旋酶在DNA修复方面的作用图4-7 RecQ 螺旋酶(Bloom 综合征螺旋酶)在DNA修复中的作用 前面提到DNA修复的SDSA途径，在果蝇生物体中BLM通过SDSA 途径，而非途径来修复DNA双链缺口或断裂。 无论是DSBR还是SDSA途径的DNA修复无论是同源属于同源 重组性修复，都有D-环的形成与移动，RecQ螺旋酶参与其中，因此，RecQ DNA双链断裂的修复中也发挥重要作用。 在人中，Bloom 综合征螺旋酶（RecQ的突变基因）即被发现 有这方面的作用。 实际上，同源重组修复要达到最佳效果时，同时需要外切核酸酶活性和螺旋酶活性。（四）RecQ螺旋酶在端粒的维持方面的作用真核生物的染色体末端的端粒(telomere，富含XXXTG重复序列的特殊结构）对于基因组的稳定性非常重要。若末端复制出现问题，端粒在细胞增殖期间会逐渐变短直至丢失。在干细胞和大部分肿瘤细胞中，端粒的长度是靠端粒酶的作用而得以维持的。端粒酶是一种特殊的反转录酶，它以内在的RNA链为模板，通过合成富含G的重复序列而延伸端粒末端。但是据认为大约10%15%的人类癌症通过一种称为ALT(alternative lengthening of telomeres)的端粒酶非依赖机制来延伸端粒。ALT途径主要通过一种基于重组的机制来阻止端粒的丢失，这种机制包括周期性的增加长而不稳定的端粒重复序列。人体RecQ螺旋酶在ALT细胞中定位到染色体末端，当缺乏有功能的RecQ螺旋酶时，可能引起端粒的维持无效，这样就导致染色体的融合和断裂。充分说明它在真核生物中具有保守的端粒维持功能。其机制尚需进一步明确。四、 RecQ螺旋酶与遗传疾病u人体中3个RecQ基因的突变将会导致3种不同但具有相似特征的疾病，这三个RecQ基因分别是：BLM、WRN和RecQ4，与它们相对应的疾病则是Bloom综合征、Werner综合征以及Rothmund-Thomson综合征。表4-2 三种疾病的临床特征及对其肿瘤易感性的比较图4-8Bloom 综合征螺旋酶蛋白的一级结构及其作用蛋白因子图4-9WRN 蛋白的一级结构及其作用蛋白图4-10RecQ4 的相互作用因子及功能See you next time!二、DNA损伤的修复（DNA repair)u所用生物大分子中只有DNA损伤后会进行修复，其他的大分子损伤后都只是被新的分子替代。细胞可以检测DNA损伤造成的双螺旋空间构象变化，并根据对 DNA 的双螺旋结构造成损害的类型，采用不同的机制修复损伤：1)在可能的情况下，细胞会使用的未经修改的互补单链 DNA 或姐妹的染色单体为模板，以恢复原始信息。2)在无模板可用的请况下，细胞使用某种 “跨损伤合成” (translesion synthesis) 的机制作为最后的手段。uDNA修复的机制根据修复方式的不同可分为四大类：（一）直接修复(direct reversal)（二）切除修复(excision repair)（三）双链断裂修复(DNA double-strand break repair)（四）损伤旁路（damage bypass）（二）切除修复(excision repair)l DNA单链损伤（Single-strand damage）的修复方式。即通过核酸酶切除受损的碱基，再以正常链为模板通过DNA聚合酶在3-0H端处延伸DNA连接酶把缺口接上。包括: 碱基切除修复(BER-base excision repair)，修复因氧化，烃化，水解或脱氨等单个损伤的碱基)；核苷切除修复(NER-nucleotide excision repair), 修复引起螺旋变化的核苷，包括CPDs)；错配修复(MR-mismatch repair) 等。 碱基切除修复(BER)： 一般分三步需四种酶参与: (1)特异的糖苷酶(glycosylase)催化连接损伤碱基与脱氧核糖之间的糖苷键水解，释放游离碱基并在DNA中产生一个去碱基位点(AP site)；(2)由去嘌呤/去嘧啶(AP)核酸内切酶在去碱基位点的上游切出一个缺口，生成一个3-OH; (3) DNA聚合酶在3-OH端处延伸，DNA连接酶把缺口接上。图5-6碱基切除修复启始阶段示意damagedAP site*（糖苷酶）(AP)3-OH 多数糖苷酶只识别一种损伤。 虽然细胞中有多种糖苷酶，但是它们无法对付所有的DNA损伤。SSA (single-strand annealing单链退火） pathway Two additional pathways for HRR:SSA 修复两重复序列DNA间的双链断裂。与DSBR 和SDSA 不同，SSA 不需要另一相似或相同的DNA分子，它只在同一分子发生，利用的是同一双链DNA的与损伤部分重复作为他等同序列进行同源重组修复。SSA的过程相对简单，DNA双链断裂后，断口由53回向修切,形成突出的3端单链（single-stranded 3 overhangs ），RPA 结合突出的3端单链防止其自身的粘缠，Rad52结合到两个3端的复序列 并使其退火配对，突出3端单链剩余未配对的部分则由被Saw1 和Slx4蛋白带入的一组核酸酶Rad1/Rad10切除，剩有的空缺再由新DNA合成填补，最后由连接酶作用连接成为连续不断的双链DNA。由于SSA会导致遗传物质（两重复间序列）丢失，因此被认为是致突变性的（mutagenic）S二、染色质组装因子1（CAF-1)u染色质组装因子1 (chromotin assembly factor 1，CAF-1)是一种参与染色质组装过程的蛋白复合体，对于染色质的正确装配及维持基因组的完整性非常重要。CAF-1在人的细胞中有三个亚基，p150、p60和p48，且在不同的物种中都高度保守（表4-1）。 三个亚基(p150、p60、p48(p50)含有不同的结构域：p150含有PEST、KER和ED结构域，p60含有WD重复结构域及PEST结构域，而p48主要只含有WD重复结构域。它们的结构组成见图4-2。*p150CHAF1A; p60CHAF1B; p150中含有多个不同的结构域，包括PEST、KER和ED。它通过酸性的KER和ED结构域与新合成的并且乙酰化的组蛋白相互作用，p150上还存在多个位点与PCNA蛋白作用。p60亚基也有几个截然不同的结构特征。p60有一个PEST结构域和一个WD重复区域（其中包含7个WD重复单位）。p60和p150都有几个磷酸化位点（每个位点的生理意义还不确定）。p48亚基在人体细胞的细胞核和细胞质提取物中含量丰富。它单独与其他蛋白质协同作用，作为复合体的一个组分参与到许多生物的组蛋白代谢过程中，它比p150有更多的功能，作为一个“联络”因子在细胞复合物之间发挥作用，p48与还人去乙酰转移酶HDAC1的催化亚基协同，有去乙酰化作用。uCAF-1是一个协助H3-H4四聚体装载的伴侣分子，这个过程是独特的，因为它偏向于新合成（复制或者修复）的DNA。CAF-1是介导新复制的DNA装配成染包质过程的主要蛋白因子之一。CAF-1不但参与S期特异的染色质的组装，而且对于增殖细胞的生存都是必要的。u最近的研究表明：CAF-1通过表观遗传调控而参与调节异染色质的形成；基因的沉默与表达；DNA的修复。这些调节过程需要CAF-1与诸多其他因子相互作用（见图43）图4-3与CAF-1 相关的组蛋白修饰图解 新合成的H4上K5和K12位的乙酰化、H3K27位的甲基化都受p48亚基的调节p150与H3K70的甲基化、H3K56的乙酰化、H3K9的甲基化及H3Sl0的磷酸化有关；p60则调控H2AK119位的泛素化。