生物化学检验实验指导

时间就是金钱，效率就是生命！生物化学检验实验指导张 申 编写怀化医专医学检验系生化教研室目 录第一章 生物化学检验实验室基本知识实验一 刻度吸量管的容积检定实验二 酸碱标准溶液的配制与浓度校正实验三 721型分光光度计波长检测与校正实验四 回收试验第二章 血清（浆）蛋白质测定实验五 血清总蛋白测定（双缩脲法）实验六 血清清蛋白测定（溴甲酚绿法）实验七 血浆纤维蛋白原测定（双缩脲法）实验八 血清粘蛋白测定（酚试剂法）实验九 血清蛋白质测定（醋酸纤维素薄膜电泳法）第三章 体液葡萄糖及其代谢物测定实验十 血糖测定（GOD-POD法）实验十一 糖化血红蛋白测定(亲和层析法)第四章 血清（浆）脂类及脂蛋白测定实验十二 血清总胆固醇测定（胆固醇氧化酶法）实验十三 血清高密度脂蛋白胆固醇测定（化学修饰酶法）实验十四 血清低密度脂蛋白胆固醇测定（化学修饰酶法）实验十五 血清甘油三酯测定（GPO-PAP法）实验十六 血清脂蛋白测定（琼脂糖电泳法）实验十七 载脂蛋白测定（免疫比浊法）第五章 常用酶类测定实验十八 血清丙氨酸氨基转移酶测定（赖氏法）实验十九 血清丙氨酸氨基转移酶测定（速率法）实验二十 血清乳酸脱氢酶测定（比色法）实验二十一 血清乳酸脱氢酶测定（速率法）实验二十二 血清淀粉酶测定（碘淀粉比色法）实验二十三 血清碱性磷酸酶测定（氨基安替比林比色法）实验二十四 血清碱性磷酸酶测定（速率法）实验二十五 血清-L-谷氨酰基转移酶测定（重氮比色法）实验二十六 血清-L-谷氨酰基转移酶测定（速率法）实验二十七 血清肌酸激酶测定（肌酸显色法）实验二十八 血清肌酸激酶测定（速率法）实验二十九 血清脂肪酶测定（速率法）实验三十 血清乳酸脱氢酶同工酶测定（琼脂糖电泳法）实验三十一 血清肌酸激酶同工酶测定（琼脂糖电泳法）第六章 血清无机离子及微量元素测定实验三十二 血清钾、钠离子测定（火焰光度法）实验三十三 血清钾、钠、氯、钙离子测定（离子选择电极法）实验三十四 血清总钙测定（EDTA滴定法）实验三十五 血清氯离子测定（硝酸汞滴定法）实验三十六 血清无机磷测定（磷钼酸法）实验三十七 血清铁与总铁结合力测定（亚铁嗪法）第七章 血气分析实验三十八 血浆碳酸氢盐测定（酸碱滴定法）实验三十九 血液pH、PO2、PCO2测定（血气酸碱分析仪）第八章 肝功能试验实验四十 血清胆红素测定（改良J-G法）实验四十一 血氨测定（碱性酚次氯酸盐法）实验四十二 血氨测定（速率法）实验四十三 血清总胆汁酸测定（3-羟类固醇脱氢酶法）第九章 肾功能试验实验四十四 血清尿素测定（二乙酰一肟法）实验四十五 血清尿素测定（酶偶联速率法）实验四十六 血清肌酐测定（碱性苦味酸法）实验四十七 血清尿酸测定（磷钨酸还原法）实验四十八 血清尿酸测定（尿酸酶-过氧化物酶偶联法）第十章 激素及代谢产物测定实验四十九 血清（尿）人绒毛膜促性腺激素测定（ELISA法）第一章 生物化学检验实验室基本知识实验一 刻度吸量管的容积检定【实验要求】 学习称重法检定刻度吸量管容积的实验方法。每位学生检定一支刻度吸量管的容积，并评价该刻度吸量管的等级。【实验原理】以砝码重量为基准，精确称量某规格吸量管标示量物质（蒸馏水）的重量，再根据温度系数校正实际容量，由实际容量和标示容量之差评价检定刻度吸量管的等级。【器材】1.刻度吸量管 规格为1ml至10ml数支。2.1/10 000分析天平3.称量瓶4.温度计【操作】1.调整分析天平零点。2.粗称称量瓶，再用分析天平准确称其重量。3.用刻度吸量管吸蒸馏水至刻度，随即放入称量瓶内，用分析天平准确称重。4.测量蒸馏水水温。5.根据称重结果与水温，利用所学公式计算刻度吸量管的实际容量。【结果】根据刻度吸量管的标示容量与实际容量，评定该刻度吸量管的等级。实验二 酸碱标准溶液的配制与浓度校正【实验要求】 要求学会正确使用微量加样器、刻度吸量管和容量瓶，配制10mmol/L HCl标准溶液和10mmol/L NaOH标准溶液，并校正浓度。掌握手持刻度吸量管的滴定过程与终点颜色的变化。【试剂】1.1mol/L HCl溶液 实验前经准确标定。2.1mol/L NaOH溶液 实验前经准确标定。3.酚红指示剂 称取酚红20mg，加10mmol/L NaOH溶液5.64ml，研磨溶解后加生理盐水至100ml。4.154mmol/L NaCl溶液（生理盐水） pH=7.0 。【操作】 （一）标准溶液的配制1.10mmol/L HCl溶液 用微量加样器准确吸取已精确标定的1 mol/L HCl溶液1ml，移至100ml容量瓶中，用生理盐水稀释至刻度。用试剂瓶密闭保存。2.10mmol/L NaOH溶液 用微量加样器准确吸取已精确标定的1 mol/L NaOH溶液1ml，移至100ml容量瓶中，用生理盐水稀释至刻度。用塑料试剂瓶密闭保存。（二）标准溶液浓度的校正 如果上述酸碱溶液在同一实验中都作为标准液使用，两者浓度应相等，两者浓度是否相等可用如下试验校正。取中号试管1支，用微量加样器加稀释酚红溶液0.1ml，用刻度吸量管吸加10mmol/L HCl溶液1.0ml，中性生理盐水2.0ml，混匀，用10mmol/L NaOH溶液滴定至微红色（15s不褪色），记录NaOH溶液的消耗体积。平行操作2管，取NaOH溶液消耗体积的平均值。如果NaOH溶液恰好消耗1.0ml则表示两溶液浓度相等。假如不等，则要计算校正系数。例如：滴定时用去NaOH溶液1.1ml，则校正系数为：1/1.1=0.9滴定时用去NaOH溶液0.9ml，则校正系数为：1/0.9=1.1实验三 721型分光光度计波长检测与校正【实验要求】学习721型分光光度计的使用方法与吸收曲线绘制及波长校正方法。【实验原理】光源通过棱镜色散成连续光谱，转动准直镜使色散光谱中某一部分由出光狭缝射出而成一单色光束，该光束的主波长由随同准直镜转动的波长刻度盘指示。实际主波长与波长刻度盘指示允许有一定误差（360600 nm范围3nm，600700 nm范围5nm，700800 nm范围8nm）。刻度盘读数与出射光束实际波长是否相符，可通过测绘已知吸收峰波长的标准溶液或标准滤光片（如镨钕滤光片）的吸收曲线而确定。镨钕滤光片在529nm有吸收峰（max）。以镨钕滤光片在520540nm范围的吸光度对波长作吸收曲线（A-）。如果吸收曲线的吸收峰偏离5292nm（超过允许误差波长）时应进行波长校正。【器材】721分光光度计，分光光度计配件镨钕滤光片、滤光片支架，白卡纸，螺丝刀，坐标纸。一、吸收曲线绘制【操作】1.接通仪器电源，预热20min。2.待仪器稳定后将镨钕滤光片（水红色）固定于滤光片支架，置于比色皿座上。转动波长调节旋钮，使波长刻度盘读数为520nm，以空气调零、调“T”旋钮至100%，将镨钕滤光片推向光路并记录吸光度值（每一波长重复测定3次）。3.按表1-1中各波长，重复上述步骤（每次均须重新调零和调100%），记录数据。表1-1不同波长处镨钕滤片的吸光度/nmA1A2A3/nm A1A2A3520532522534524536526538528540530【结果处理】1.取方格坐标纸，以波长为横坐标、吸光度为纵坐标（每一小格为0.01A）建立直角坐标。2.将不同波长处测得吸光度的平均值（）按相应波长在坐标纸上标出。3.连接各点，即可得到所测标准滤光片的吸收曲线。4.观察指定吸收峰波长（实测值）与标度值是否相符，若不符合，即两者存在偏差。偏差值在2nm以内，波长误差在允许误差范围；偏差的绝对值2nm（超过允许误差），则应进行波长校正。二、波长校正【操作】1.接通仪器电源，预热20min；2.将镨钕滤光片固定于滤光片支架，置于比色皿座内，旋转波长至528（或530）nm处，以空气调零、调“T”旋钮至100%；3.用螺丝刀卸下仪器侧面板上的四颗固定螺丝，按说明书指示找准波长调节螺杆；4.手握螺丝刀，缓慢转动波长调节螺杆，同时观察读数表盘上吸光度变化（吸光度下降应反向转动）直至调至最大（透光度则为最小）为止；5.读取特征波长附近各10nm（间隔2nm测定一次）的吸光度值验证无误后，上好侧面板。【注意事项】1.调节前务必确认波长螺杆是否找准，且不可错调，以免引起更大的麻烦。2.调节波长螺杆时用力要均匀，转动要缓慢，用力过猛，可导致螺杆头损坏。3.分光光度计波长检定属计量部门定期强制检定项目，各实验室应接受当地计量部门检定，并保留检定合格证书备查。实验四 回收试验【实验原理】将被测物标准液加入待测标本中作为回收样品，原待测标本中加入等量的无被测物的溶剂作为基础样品，然后同时用候选方法对两样品进行测定，通过以下公式计算出回收率。回收浓度= 回收样品测得浓度基础样品测得浓度【试剂】1.血清标本 收集无肝炎病毒、无溶血、无脂浊的人混合血清。2.葡萄糖标准液 25mmol/L、50mmol/L。3.GOD-POD法测血糖试剂盒。【操作】1.样品准备 基础样品：血清2ml蒸馏水0.1ml回收样品：血清2ml25mmol/L葡萄糖标准液0.1ml回收样品：血清2ml50mmol/L葡萄糖标准液0.1ml2.血糖浓度测定 按GOD-POD法测定各制备样品的血糖浓度。3.将各计算结果填入下表。表1-2回收试验的数据处理测得浓度（mmol/L）加入浓度（mmol/L）回收浓度（mmol/L）回收率/ %基础样品回收样品回收样品平均回收率【注意事项】1.吸量要准确，否则将严重影响实验结果。2.加入的标准液体积要小，一般不超过待测标本体积的10%，否则血清基质被过分稀释，不能反映原有标本的实际情况。3.一般须做高、中、低不同浓度标准液的回收试验，计算平均回收率；且加入标准液后，样品中被测物浓度最好达到医学决定水平。4.每份样品应重复测定23次，以减少随机误差对实验结果的干扰。5.为防止标准液不稳定、制备中的误差或实验操作等因素影响实验结果，可用比较方法对样品进行同步分析，增加实验结果的可靠性。【结果判断】一般实验方法回收率应为95%105%。第二章 血清（浆）蛋白质测定实验五 血清总蛋白测定（双缩脲法）血清总蛋白（total protein，TP）是血清中所有蛋白质的总称。TP的测定方法很多，常规化学测定方法是双缩脲法。【实验要求】掌握双缩脲法测定血清TP的实验原理与方法；练习比色法的结果计算及标准曲线制作；巩固分光光度计的使用。【实验原理】蛋白质分子中的肽键在碱性溶液中与Cu2+作用生成稳定的紫红色络合物。颜色深浅在一定范围内与蛋白质含量成正比，与同样处理的蛋白标准液比较，经计算或查标准曲线即可求出血清总蛋白含量。【试剂】1.6mol/L氢氧化钠溶液称取NaOH 240g，用新鲜蒸馏水溶解并最终定容至1L，置室温贮存在密封的聚乙烯瓶里。2.双缩脲试剂（Doumas）称取结晶硫酸铜（CuSO45H20）3.0g，溶于500ml新鲜蒸馏水中，加酒石酸钾钠（NaKC4H4O64H2O）9.0g，碘化钾（KI）5.0g，待完全溶解后，加入6mol/L氢氧化钠溶液100ml，最后用蒸馏水定容至1L。室温贮存在密闭的聚乙烯瓶里，可稳定6个月。3.蛋白标准液多用商品血清蛋白标准液，或定标质控物为标准。4.生理盐水（154mmol/L氯化钠）。【操作】取试管三支，标明测定、标准和空白管，按表4-4操作。表2-1双缩脲法测定血清总蛋白操作表加入物 / ml测定管标准管空白管待测血清0.1蛋白标准液0.1生理盐水0.40.40.5双缩脲试剂3.03.03.0混匀，置37水浴10min（或2530min），用540nm波长比色，以空白管调零，读取各管吸光度。【计算】血清TP（g/L）蛋白标准液浓度g/L【标准曲线绘制】1.配制20g/L蛋白标准液如蛋白标准液浓度为70g/L，则取此液2ml，加入生理盐水5ml，混匀即成。2.取试管六支，标明管号，按表4-5操作。表2-2双缩脲法测定血清蛋白标准曲线制作表加入物 / ml01234520g/L蛋白标准液0.10.20.30.40.5生理盐水0.50.40.30.20.1双缩脲试剂3.03.03.03.03.03.0相当于血清蛋白质 / g/L020406080100混匀，置37水浴10min（2530 min），用540nm波长比色，以“0”管调零，读取各管吸光度。上述操作应平行测定3次。各管取3次吸光度均值作为纵坐标，相应的浓度作为横坐标，绘制成标准曲线。【注意事项】1.血清标本以新鲜为宜；明显溶血标本可干扰双缩脲反应，不宜使用；黄疸血清应做相应血清空白；含脂类极多的血清加入试剂后仍混浊不清，可用乙醚抽提后再比色。2.蛋白标准液要求澄清。不可选用未知性能的蛋白质作为血清蛋白测定的标准。3.双缩脲试剂要密闭贮存，防止吸收二氧化碳；双缩脲试剂中二价铜离子容易还原成一价铜，故不宜长期保存。4.右旋糖酐对测定有干扰，若患者注射右旋糖酐后，应过几天之后再行测定。5.血清蛋白质的含量一般用g/L表示，不用mol/L表示。【参考范围】6080g/L。【临床意义】1.血清总蛋白增高（1）血液浓缩如呕吐、腹泻、高热等，外伤性休克，慢性肾上腺皮质功能减退（由于钠的丢失而致继发性失水）。（2）血浆蛋白质合成增加如多发性骨髓瘤。2.血清总蛋白降低（1）血浆稀释如静脉注射过多低渗溶液或各种原因引起的水钠潴留。（2）营养不良和消耗增加如长期食入蛋白含量不足或慢性肠道疾病引起吸收不良，使体内缺乏合成蛋白质的原料；消耗性疾病，如严重结核病、甲状腺功能亢进和恶性肿瘤等。（3）合成障碍当肝功能严重受损时，血浆蛋白质合成量减少，以清蛋白最为显著。（4）蛋白质大量丢失严重烫伤、大出血、肾病综合征、溃疡性结肠炎。【方法评价】1.双缩脲法并非蛋白质特有的颜色反应，凡含有两个或两个以上肽键的物质均能发生双缩脲反应。2.双缩脲法呈色稳定，30min4h内颜色不变；操作简便、快速，试剂稳定。不仅适合手工操作，也便于上机分析。3.线性范围为0140g/L，RCV为4%。实验六 血清清蛋白测定（溴甲酚绿法）清蛋白（albumin，Alb或A）由肝细胞合成，是血浆中含量最多的蛋白质。目前，国内外实验室多采用在不分离清蛋白和球蛋白的条件下，用溴甲酚绿直接测定清蛋白的方法。【实验要求】掌握BCG法测定血清Alb的实验原理与方法；学习微量加样器的使用方法；能熟练使用分光光度计。【实验原理】在pH4.2的缓冲液中，清蛋白作为一种阳离子与阴离子染料溴甲酚绿（bromocresol green，BCG）结合形成蓝绿色复合物，在波长630nm处有吸收峰，颜色深浅与清蛋白含量成正比，与同样处理的清蛋白标准液比较，可求得血清清蛋白含量。【试剂】1. 0.5mol/L琥珀酸缓冲贮存液（pH 4.1）称取氢氧化钠10g，琥珀酸56g，溶解于800ml蒸馏水中，用1mol/L氢氧化钠溶液调pH至4.10.05，加蒸馏水至1L，置4冰箱低温保存。2.BCG贮存液（10mmol/L）称取溴甲酚绿（MW720.02）1.80g，溶于5ml浓度为1mmol/L氢氧化钠溶液中，加蒸馏水至250ml，置棕色瓶保存。3.叠氮钠贮存液溶解叠氮钠40g于1L蒸馏水中。4.聚氧乙烯月桂醚（Brij-35）溶液称取聚氧乙烯月桂醚25g，加蒸馏水80ml，置60左右水浴中使其溶解，加蒸馏水至100ml。5. BCG试剂于1L容量瓶内加入蒸馏水400ml，琥珀酸缓冲贮存液100ml，准确加入BCG贮存液8ml，再加入叠氮钠贮存液2.5ml，聚氧乙烯月桂醚溶液2.5ml，最后，用蒸馏水稀释至刻度。配好的BCG试剂的pH应为4.150.05。6.清蛋白标准液（40g/L） 多用商品血清蛋白标准，或定标质控物。此液冰箱保存。7.生理盐水。【操作】取试管三支，标明测定、标准和空白管，按表4-6操作。表2-3BCG法测定血清清蛋白操作表加入物 / ml测定管标准管空白管待测血清0.02清蛋白标准液 / g/L0.02生理盐水0.02BCG试剂4.04.04.0充分混匀，置室温10min，用630nm波长比色，以空白管调零，读取各管吸光度。【计算】血清清蛋白（g/L）清蛋白标准液浓度g/L同时测定血清清蛋白与总蛋白，以总蛋白浓度减去清蛋白浓度，即得球蛋白（G）浓度，并计算清蛋白与球蛋白比值（A/G比值）。【参考范围】清蛋白：3555g/L 球蛋白：2029g/L A/G：1.52.5/1【临床意义】1.血清清蛋白（1）增高常见于严重脱水所致的血浆浓缩。（2）降低临床上较常见，与总蛋白降低的原因大致相同。急性降低常见于大量出血或严重烧伤；慢性降低见于肾病蛋白尿、肝功受损、肠道肿瘤与结核、慢性出血、营养不良和消耗性疾病等。清蛋白如低于20g/L，患者可出现水肿。2.血清球蛋白（1）增高严重脱水、炎症、免疫系统疾病和肿瘤。（2）降低血液稀释、严重营养不良、胃肠道疾病等。肾上腺皮质激素和其它免疫抑制剂有抑制免疫功能的作用，会导致球蛋白合成减少。球蛋白浓度如低于10g/L时，可怀疑为无球蛋白血症。3.清蛋白与球蛋白比值（A/G）临床上常用A/G值衡量肝病的严重程度，当A/G值小于l时，称比值倒置，为慢性肝炎或肝硬化的特征之一。【方法评价】1.高胆红素血症和溶血标本对本法不产生干扰。严重高脂血症可使结果偏高，应采用标本空白校正。若标本混浊，可做标本空白（血清0.02ml，加琥珀酸缓冲液4ml），用测定管吸光度减去标本空白管吸光度后再计算结果。2. BCG系一种pH指示剂，它受酸、碱影响较大，所用器材必须清洁，无酸、碱污染。3.BCG试剂的pH必须严格控制在pH4.150.05，pH升高可使染料空白增高，与清蛋白结合率下降。所以，控制反应液的pH是本法测定的关键。4.BCG与蛋白质结合的特异性较低。它不仅与清蛋白结合呈色，还与血清中其它蛋白质呈色，其中以1球蛋白、运铁蛋白（属球蛋白）、触珠蛋白（属2球蛋白）最为明显， BCG与不同蛋白质的反应速率不同，与清蛋白可立即发生反应（快反应），与其它蛋白质反应较慢（慢反应）。实验证明，血清与BCG试剂一经混合，“慢反应”即可发生，约持续1h才完成。5. Brij-35是一种非离子去垢剂，它可增强BCG-清蛋白复合物的溶解度，消除BCG同清蛋白反应时可能产生的沉淀，它的浓度高于或低于所指定的浓度时，均导致敏感度降低和直线性丧失，对测定结果有较大影响。故其配制浓度和所加试剂量一定要准确。6.当60g/L清蛋白标准液与BCG试剂作用后，溶液在光径1cm、波长630nm时，测定的吸光度应为0.8110.035，若达不到此值，表示BCG试剂灵敏度较差。7.本法灵敏度高，操作简便，重复性好，并可用于自动化分析技术。8.线性范围为1060 g/L，CV3%。实验七 血浆纤维蛋白原测定（双缩脲法）纤维蛋白原（Fibrinogen，Fbg）是血液中含量最高的凝血因子。测定方法有凝固法、免疫比浊法、复钙双缩脲法等。本章介绍复钙双缩脲法。【实验要求】掌握双缩脲比色法测定血浆纤维蛋白原的实验原理与方法；学会比色法计算公式的推导。逐步养成严谨务实的良好工作作风。【实验原理】在稀释血浆中加入钙离子，使纤维蛋白原转化成纤维蛋白凝块，分离并洗涤沉淀后，用双缩脲法测定其含量。【试剂】1.225.2mmol/L氯化钙溶液称取氯化钙25g，用蒸馏水溶解并定容至1L。2.生理盐水3.双缩脲试剂 4.蛋白标准液（试剂2、3、4同血清总蛋白测定）。【操作】1.测定管制备（1）在25ml小烧杯中加入新鲜血浆0.5ml，生理盐水10ml，225.2mmol/L氯化钙溶液0.5ml，混匀。置37温箱保温，直至凝块形成（大约需30min）。如纤维蛋白原含量过低，需延长保温时间，对无纤维蛋白凝块形成的标本，需保温过夜后方可作结论。（2）用一小玻棒小心将凝块卷起，转动玻棒并在杯壁挤压，使凝块紧裹在玻棒上，取出，用滤纸小心吸干，用蒸馏水小心冲洗数次。（3）将裹有凝块的玻棒放入一试管中，此即为测定管。2.另取试管两支，标明标准管和空白管，按表4-7进行操作。表2-4双缩脲法测定血浆纤维蛋白原操作表加入物 / ml测定管标准管空白管步骤1制得的凝块全部生理盐水0.10.1玻棒搅动直至凝块完全溶解1：10稀释的蛋白标准液0.1双缩脲试剂5.05.05.0混匀，置37水浴10min（或2530min），用540nm波长比色，以空白管调零，读取各管吸光度。【计算】血浆纤维蛋白原（gL）【注意事项】1.本法所用标本为血浆，要求标本新鲜，不能溶血。抗凝剂使用不能过量。2.制备测定管时纤维蛋白凝块的卷起、挤压、吸干和洗涤每一步都要特别小心，避免纤维蛋白丢失而使结果偏低。【参考范围】24g/L【临床意义】1.纤维蛋白原增加纤维蛋白原是一种急性时相蛋白，其增加往往是机体的一种非特异反应，常见于下列疾病：（1）感染：毒血症、肺炎、轻型肝炎、胆囊炎、肺结核及长期的局部炎症。（2）无菌炎症：肾病综合征、风湿热、恶性肿瘤、风湿性关节炎、心梗及脑梗等。（3）其他：如外科手术、放射治疗、月经期及妊娠期也可见轻度增高。2.纤维蛋白原减少（1）原发性纤维蛋白原减少的病例极少。一种先天性纤维蛋白原缺乏症是极为罕见的遗传性疾病，通过常染色体隐性基因遗传，此患者肝不能合成纤维蛋白原。男、女两性均能发生，但以男婴为多见，患婴出生时，半数出现脐带出血，其血液凝固缓慢或只有部分凝固。（2）继发性血浆纤维蛋白原减少的原因是由于纤维蛋白溶酶溶解纤维蛋白所致。如胎盘早期剥离，分娩时羊水进入血液形成血栓，引起弥漫性血管内凝血，激活纤维蛋白溶酶原，使血中纤维蛋白溶酶活力增加，溶解纤维蛋白，消耗了体内原有的纤维蛋白原,使其含量减少。有时下降至0.5g/L以下。（3）严重的肝实质损害，如肝坏死、慢性肝病晚期、肝硬化等此外，严重的低纤维蛋白原血症也可见于肺及前列腺手术中。【方法评价】本法操作烦琐、费时，易使纤维蛋白凝块丢失，同时还能沉淀其他蛋白质，具备条件时最好采用加入凝血酶原的凝固法或免疫比浊法。实验八 血清粘蛋白测定（酚试剂法）粘蛋白是含粘多糖的复合蛋白质，主要存在于1及球蛋白中。它不被过氯酸、磺基水杨酸等蛋白沉淀剂所沉淀，可被磷钨酸沉淀。【实验要求】掌握酚试剂法测定血清粘蛋白的实验原理、方法与计算方法；学会使用离心机；练习吸取上清液的技能。【实验原理】用0.6mol/L过氯酸沉淀血清中其他蛋白质时，粘蛋白不被沉淀，滤液（或上清液）中粘蛋白用磷钨酸溶液沉淀，以酚试剂测定其中蛋白质的含量。【试剂】1.生理盐水。2.1.8mol/L过氯酸取含量为70%72%过氯酸28m1，加蒸馏水稀释至200m1。若用60%过氯酸则需39.2m1稀释至200m1，配制后需用标准氢氧化钠标定。3.17.74mmo1/L磷钨酸溶液称取磷钨酸H7P（W2O7）65.0g，溶于2mo1/L盐酸中，并加至100m1。4.酚试剂于1 500m1球形烧瓶中加入钨酸钠100g，钼酸钠25g，蒸馏水700m1，浓磷酸50m1，浓盐酸100m1，缓缓回流蒸馏10h，取下冷凝管，加硫酸锂75g，蒸馏水50m1，并加溴水23滴，再煮沸15min以除去多余的溴（亦可以30%过氧化氢68滴代替），冷却后稀释至1L。此试剂应为金黄色而不带绿色，贮棕色瓶保存。使用时按需要量用蒸馏水等量稀释后使用。（溴有毒，开启瓶塞或加溴煮沸时应在通风柜内操作！）5.1.88mo1/L碳酸钠溶液。6.酪氨酸标准溶液(0.05mg/ml)精确称取酪氨酸5.0mg，以0.lmol/L盐酸溶解并定容至100m1。【操作】在15m1离心管中加入血清0.5m1和生理盐水4.5m1，混匀，滴加1.8mol/L过氯酸溶液2.5m1，混匀，使血清蛋白沉淀。静止l0min后，用定量滤纸过滤或离心。取滤液或上清液2.5m1置于另一试管中，加17.74mmol/L磷钨酸0.5m1混匀，使粘蛋白沉淀。静止10min后，以3 000 r/min离心l0min，倾去上清液并沥干，再加磷钨酸溶液2m1，悬浮沉淀物，同法离心后倾去上清液（不可使沉淀损失！），沥干，以此管为测定管。另取试管两支，标明标准管和空白管，按表4-8测定。表2-5酚试剂法测定血清粘蛋白操作表加入物 / ml测定管标准管空白管0.05mg/ml酪氨酸标准液0.25蒸馏水1.751.501.751.88mo1/L碳酸钠溶液0.500.500.50酚试剂0.250.250.25混匀，放置37水浴15min，取出后在650nm波长处进行比色，以空白管调零，分别读取各管吸光度。【计算】血清粘蛋白(mg/L)（以酪氨酸计）75粘蛋白含酪氨酸为4.2%，如果粘蛋白以蛋白计发报告，只需将上述以酪氨酸计算结果乘100/4.2（23.8）即可。【注意事项】1.过氯酸为强氧化剂，应按危险品保存，实验操作时也应小心。 2.过氯酸沉淀蛋白在30以下进行较好，否则结果将偏低。操作中滴加过氯酸溶液时速度宜慢，以3040s内加完2.5ml为度。速度过快易发生混浊，离心后不易得到清晰的上清液。3.加过氯酸溶液沉淀蛋白后，以及滤液加磷钨酸后，均需放置l0min再进行过滤或离心。倾去上清液时，须细心操作，不能使沉淀丢失，否则结果偏低。【参考范围】以酪氨酸计为(33.812.7)mg/L以蛋白计为 0.718.7g/L【临床意义】1.血清粘蛋白增高见结核病、肺炎、风湿热、风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、肿瘤（尤其是女性生殖器肿瘤）等。2.血清粘蛋白降低见实质性肝病和肾病综合征。【方法评价】本法准确度低，测定结果一般偏低。实验九 血清蛋白质测定（醋酸纤维素薄膜电泳法）【实验要求】掌握醋酸纤维素薄膜电泳技术分离血清蛋白的原理及操作；熟悉正常人血清蛋白电泳图谱特征；了解血清蛋白测定的临床意义。【实验原理】血清中各种蛋白质的等电点与分子大小有差异，电泳迁移率不同，因此，采用电泳技术可以分离血清蛋白质。各种血清蛋白质的等电点在pH7.0以下，在pH8.6的缓冲液中带负电荷，电场中向正极泳动，用醋酸纤维素薄膜电泳可将血清蛋白质分离为5条区带，从正极向负极依次为清蛋白、1-球蛋白、2 -球蛋白、-球蛋白和-球蛋白（图9-3，再经脱色、比色，可求出各部分蛋白质的相对百分含量。图2-1 血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳示意图【器材】醋酸纤维素薄膜（2 cm8cm）、培养皿、滤纸、镊子、剪子、加样器（可用血红蛋白吸管）、直尺、铅笔、玻璃板（8cm12cm）、电泳仪、分光光度计、吸光度计。【试剂】1.巴比妥缓冲液（pH8.6，0.07mol/L，离子强度0.06） 取巴比妥钠12.76g、巴比妥1.66g，加蒸馏水500ml，加热溶解，冷却后用蒸馏水稀释至1 000ml。2.氨基黑10B染色液 取氨基黑10B 0.5g，加甲醇50ml、冰醋酸10ml，混匀溶解后，加蒸馏水至100ml。3.漂洗液 取95%乙醇45ml，加冰醋酸5ml，混匀后用蒸馏水稀释至100ml。4.洗脱液 0.4mol/L NaOH。5.透明液 取柠檬酸（C6H5Na3O72H2O）21g、N-甲基-2-吡咯烷酮150g，以蒸馏水溶解，并稀释至500ml。【操作】1.准备（1）电泳槽准备 将电泳槽置于水平平台上，两侧电泳槽中注入等量巴比妥缓冲溶液，使槽内液面处于同一高度，液面与支架距离约22.5cm，支架宽度调节到恰好适合醋酸纤维素薄膜的长度（约810cm）。用4层纱布搭桥，此即盐桥（图9-4）。图2-2 醋酸纤维素薄膜电泳装置示意图 （2）薄膜准备 取2 cm8 cm醋酸纤维素薄膜，在膜的粗糙面一端1.5cm处用铅笔轻划一直线，作为点样位置，并编号。将薄膜浸入巴比妥缓冲液中，待充分浸透（20min以上），即薄膜无白色斑点后，用镊子取出,夹在滤纸中间轻轻吸去多余的缓冲液。2.点样 用加样器取血清约35l ， 均匀加在薄膜点样线上，待血清渗入膜内后，移开加样器。膜上血清样本应有一定宽度、粗细均匀,不要浸润至膜边缘。3.电泳 将薄膜点样端靠近阴极，膜粗糙面向下，平整地贴于盐桥上，加盖,平衡约5min，开启电源，调节电压为100160V，电流为0.40.6mA/cm膜宽，通电4050 min，待电泳区带展开约3.54.0cm，即可关闭电源。4.染色 用镊子取出薄膜，浸入染色液中23min。5.漂洗 从染液中取出薄膜，沥去染液，依次浸入34个漂洗皿的漂洗液中反复漂洗, 直至背景颜色脱净为止。此时即得5条蛋白色带，从阳极端起，依次为清蛋白、1 、2 、和球蛋白。6.透明 将漂净吹干的薄膜浸入透明液中35 min，取出平铺于洁净干燥玻片上（应无气泡），直立片刻除去透明液，干燥后即成透明膜。此膜可扫描定量，并可长期保存。7.定量（1）吸光度计法：将干燥的薄膜放入微机控制的自动扫描吸光度计内，对蛋白质区带进行扫描，自动绘出电泳图形，并直接打印出各部分蛋白质的相对百分含量。（2）洗脱比色法：取试管6支，将0.4 mol/L NaOH溶液 6ml加入第1 管，其余各管加3ml。将漂净的薄膜用滤纸吸干后，剪下各条蛋白区带，并于空白部位剪一相当于清蛋白宽度的薄膜作为空白。将清蛋白区带浸入第1 管溶液，其余蛋白区带与空白区带依次浸入后5 管溶液中。于37水浴20 min（不时振摇）。待颜色脱净，取出冷却。用分光光度计比色，于620nm波长，以空白管调零，读取各管的吸光度值。【计算】吸光度总和（AT）= 2A+1+2+（吸光度）各部分蛋白质所占百分比（%）=AX表示各部分蛋白（清蛋白、1、2、）的吸光度。 【注意事项】1.每次电泳前，电泳槽两边的缓冲液液面应保持平衡。2.在电泳过程中，电泳槽一定要加盖密闭，电泳完毕，要先断开电源，再取出薄膜，以免触电。3.缓冲液越新鲜越好，不用时，宜贮于冰箱。电泳槽内的缓冲液可以连续使用数次，但是下次电泳时，正负极要更换。4.下述原因会引起电泳图谱分离不清或不整齐：（1）点样过多；（2）点样不均匀、不整齐，样品触及薄膜边缘；（3）薄膜过湿致样品扩散；（4）点样速度过慢，薄膜表面局部干燥；（5）样品不新鲜或溶血；（6）薄膜与盐桥接触不良；（7）薄膜位置与电流方向不平行；（8）缓冲液变质。【参考范围】各实验室应根据不同的实验条件及检测方法和检测对象设定参考值范围，表9-1仅供参考。表2-6 氨基黑10B染色洗脱法参考范围血清蛋白质组分占总蛋白的百分数/%清蛋白57.4571.731 球蛋白1.764.482球蛋白4.048.28球蛋白6.7911.39球蛋白11.1822.97【临床意义】1.慢性肾炎、肝硬化时，清蛋白降低，球蛋白升高23倍。2.肾病综合征时，清蛋白降低，2 及球蛋白升高。3.结缔组织病（如红斑狼疮，类风湿性关节炎等）时，球蛋白显著升高。4.多发性骨髓瘤时，清蛋白降低，球蛋白增多，于球蛋白和球蛋白区带之间出现“M”带。第三章 体液葡萄糖及其代谢物测定实验十 血糖测定（GOD-POD法）【实验要求】 掌握血糖测定葡萄糖氧化酶-过氧化氢酶（GOD-POD法）的原理，操作方法。能及时发现和解决实验中出现的问题。【实验原理】葡萄糖氧化酶（GOD）催化葡萄糖氧化成葡萄糖酸，并产生过氧化氢。在过氧化氢酶（POD）及色原性受体4-氨基安替比林（4-AAP）的存在下，过氧化氢释放氧使色素原氧化生成红色醌类化合物。醌的生成量与葡萄糖成正比，在波长505nm处比色，求得葡萄糖含量。葡萄糖 O2 H2O 葡萄糖酸 H2O22H2O2 4-AAP 酚 醌亚胺 4H2O【试剂】有商品试剂盒供应。例如，某试剂盒的成分与参考浓度：1.葡萄糖氧化酶 1 200U/L；过氧化物酶1 200 U/L；4-氨基安替比林 0.8mmol/L；DHBS（3、5-二氯-2-羟基苯磺酸钠）3.5mmol/L；磷酸缓冲液pH7.0 100mmol/L；稳定剂适量。2.葡萄糖标准液 5mmol/L【操作】1.自动分析法 按仪器说明书的要求进行测定。2.手工操作法 取试管3支，按表3-1操作表3-1 GOD-POD法测定血糖操作步骤加入物（ml）空白管标准管测定管血清葡萄糖标准液蒸馏水酶工作液0.022.00.022.00.022.0混匀，置37水浴，保温10min，在波长505nm处比色，以空白管调零，读取标准管及测定管吸光度。【计算】【参考范围】空腹血清葡萄糖为3.896.11mmol/L (70110mg/dl) （或参考试剂盒提供的参考范围）【临床意义】1.生理性高血糖 见于饭后12h，注射葡萄糖或摄入高糖食物后、情绪紧张肾上腺素分泌增加时，但不应超过10mmol/L。2.病理性高血糖 见于(1)内分泌腺功能障碍能引起高血糖，如胰腺细胞损害导致胰岛素分泌缺乏，血糖可超过正常，临床上称为糖尿病。其他内分泌疾病引起的各种对抗胰岛素的激素分泌增加也会出现高血糖；(2)颅内压增高：颅内压增高刺激血糖中枢，如颅外伤、颅内出血、脑膜炎等；(3)由于脱水引起的高血糖：如呕吐、腹泻和高热等可使血糖轻度增高。3.生理性或暂时性低血糖 见于饥饿、剧烈运动、注射胰岛素后、妊娠和服用降糖药后。4.病理性低血糖 见于(1)胰岛细胞增生瘤等，使胰岛素分泌过多；(2)对抗胰岛素的激素分泌不足，如垂体前叶功能减退，肾上腺皮质功能减退和甲状腺功能减退而使生长素、肾上腺皮质激素分泌减小；(3)严重肝病患者，由于肝脏储存糖原及糖异生等功能低下，肝脏不能有效地调节血糖。【方法评价】葡萄糖氧化酶法因其操作简便、特异性高，已作为临床实验室测定血糖的主要方法。本法线性范围可达23mmol/L，但溶血（胆色素0.34mmol/L），左旋多巴（0.5mmol/L），谷胱甘肽，维生素C等还原性物质均可使测定结果下降。实验十一 糖化血红蛋白测定(亲和层析法)糖化血红蛋白（glycoseylated hemoglobin,GHb）是在红细胞生存期间，HbA1中HbA1c、HbA11、HbA12与血中己糖（主要为葡萄糖）缓慢、连续的非酶促反应产物。凡连接有己糖的HbA1统称为糖化血红蛋白。红细胞中HbA1c 的浓度反映了过去120 天的血糖平均水平。HbA1c 检测用于对糖尿病患者的长期监测。临床实验室HbA1c检测方法主要分为两大类：一类是依据电荷的差异，用阳离子交换层析和电泳的方法将糖化和未糖化的血红蛋白分离；另一类是依据血红蛋白上糖化基团的结构特点，用免疫分析和硼酸盐亲和层析来测定。目前测定GHb的推荐方法是亲和层析和控制温度的离子交换层析微柱法。高效液相色谱（HPLC）被列为参考方法。本实验用亲和层析法。亲和层析法特异性强，不受异常血红蛋白的干扰。因具有快速的特点，可作为快速床旁检测HbA1c，为临床提供即时的检测结果。【实验要求】熟悉层析法测定糖化血红蛋白的原理和主要临床意义，通过仪器操作掌握该法的基本操作过程及注意事项，并能联系临床分析实验结果。【实验原理】糖化血红蛋白仪采用硼酸亲和层析法将非糖化血红蛋白与糖化血红蛋白分离并分别测试，经计算可以得出HbA1c 在样本中的相对浓度。【仪器】糖化血红蛋白分析仪（如DS1糖化血红蛋白分析仪等）【试剂】有商品试剂盒供应。【操作】将糖化血红蛋白检测试剂放到仪器上，向试管1(包含硼酸亲和树脂、表面活性剂、0.1%叠氮钠和缓冲液)内加入血样（使用 EDTA 或肝素抗凝的静脉血或指尖血）10l，血细胞会迅速裂解并释放出血红蛋白，硼酸亲和树脂与糖化血红蛋白结合。短暂孵育后，将液体倒入测试杯中央管道，其中非糖化血红蛋白部分将进入一个空腔并接受光学检测。糖化血红蛋白仍然保留在位于测试杯底部管道的硼酸树脂上。硼酸亲和树脂经由试管2(包含0.1%叠氮钠和缓冲液)溶液的洗脱，并由试管3(包含缓冲液，0.5%苯氧乙醇和表面活性剂)溶液再抽提洗脱，糖化血红蛋白的浓度由分光光度计（440nm）读数，然后计算HbA1c 相对浓度。详细操作见具体的仪器与试剂盒说明。【参考范围】非糖尿病儿童及成人平均HbA1c为5%，参考范围为3%7%。【注意事项】如用静脉血，样本须先充分混合并平衡至室温，用微量加样器抽取10l 样本加入试管1。【临床意义】血糖控制良好的糖尿病患者HbAlc应为7%。当糖尿病患者的血糖控制不佳，或一天中血糖有较大的波动时，HbAlc值就会超过7%。【方法评价】1.糖化血红蛋白仪及检测试剂测试HbA1c的性能符合“糖尿病控制与并发症实验”(DCCT)的要求，通过美国糖化血红蛋白标准化项目(NGSP)对它的检验，是国际认可的标准方法。2.精密度 用3个不同批号的糖化血红蛋白检测试剂进行平行对照试验，HbA1c 在5.7%水平的样本，CV为4.1%；HbA1c 在9.4%水平的样本，CV为3.8%。3.线性和温度的影响 理论测试的线性范围为225%。用患者样本测试结果为415%。温度在1730之间时，测试结果不受影响。4.其他血红蛋白的影响 糖化血红蛋白仪使用的硼酸亲和层析法测定血HbA1c，不受HbS、HbC、HbD、HbF的影响。第四章 血清（浆）脂类及脂蛋白测定实验一十二 血清总胆固醇测定（胆固醇氧化酶法）【实验要求】掌握血清总胆固醇（TC）测定（胆固醇氧化酶法）的原理，操作方法。能及时发现和解决实验中出现的问题。【实验原理】血清中的胆固醇酯（CE）被胆固醇酯酶（CHE）水解成游离胆固醇（Chol）,后者被胆固醇氧化酶（CHOD）氧化成4-胆甾烯酮并产生过氧化氢，再经过氧化物酶（POD）催化4-氨基安替比林（4-AAP）与酚（三者合称PAP），生成红色醌亚胺色素（Trinder反应）。醌亚胺的最大吸收在500nm左右，吸光度与标本中TC含量成正比，反应式如下：胆固醇酯 H2O 胆固醇 游离脂肪酸胆固醇 O2 4-胆甾烯酮 H2O22H2O2 4-AAP + 酚 醌亚胺 4H2O【试剂】有商品试剂盒供应。例如，某试剂盒的成分与参考浓度：Pipes piperazine-N,N-bis(2-ethanesulfonic acid)，哌嗪-N, N-双(2-乙磺酸)缓冲液 50mmol/L (pH6.70) ；酚24mmol/L；胆酸钠0.5mmol/L ；胆固醇酯酶180U/L；胆固醇氧化酶200U/L；过氧化物酶1 000U/L；4-氨基安替比林0.5mmol/L。【操作】1.自动分析法 按仪器说明书的要求进行测定。2.手工操作法 取试管3支，按表4-1操作表4-1 GOD-POD法测定血糖操作步骤加入物（ml）空白管标准管测定管血清胆固醇标准液蒸馏水酶工作液0.022.00.022.00.022.0混匀，置37水浴，保温10min，在波长505nm处比色，以空白管调零，读取标准管及测定管吸光度。【计算】血清总胆固醇（mmol/L）= 参考血清胆固醇浓度（mmol/L）【参考范围】正常5.17mmol/L (200mg/dl)临界值（轻度增高）：5.176.47mmol/L(200250mg/dl)高胆固醇血症：6.47mmol/L(250mg/dl)严重高胆固醇血症：7.76mmol/L(300mg/dl)【临床意义】1.增高 见于脂肪肝、肝脏肿瘤、甲低、严重糖尿病、粘液性水肿、动脉粥样硬化、妊娠、肾病综合征等；家族性高胆固醇血症时显著增高。2.降低 常见于急性肝坏死、肝硬化；甲亢、恶性贫血、溶血性贫血、营养不良等也可见降低。【方法评价】该方法灵敏度高、准确度和精密度好，线性范围宽，可达15.51mmol/L，既适用于手工操作，也适合自动分析，是目前测定胆固醇的主要方法。胆红素、谷胱甘肽、尿酸和维生素C等一些还原性物质将使结果受到干扰。实验一十三 血清高密度脂蛋白胆固醇测定（化学修饰酶法）流行病学表明，高密度脂蛋白（HDL）与冠心病呈负相关，测定高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）反映HDL的水平。HDL-C低于0.9 mmol/L是冠心病危险因素，HDL-C增高（大于1.55mmol/L）被认为是冠心病的“负”危险因素。【实验要求】熟悉高密度脂蛋白胆固醇测定（化学修饰酶法）的原理，操作方法。能及时发现和解决实验中出现的问题。【实验原理】胆固醇酯酶（CHE）和胆固醇氧化酶（CHOD）经化学修饰后，对LDL（低密度脂蛋白）、VLDL（极低密度脂蛋白）、乳糜微粒（CM）的反应性降低，当两种化学修饰酶与葡萄糖硫酸钠、硫化环状糊精复合系并用时，选择性地作用于HDL-胆固醇。本方法原理反应方程式如下：HDL-胆固醇 H2O 胆固醇 游离脂肪酸胆固醇 O2 胆甾烯酮 H2O2H2O2 4-AAP HSDA 醌类化合物 （HSDA：sodium N-(2hydroxy-3-sulfopropyl)-3,5-dimethoxyaniline）【试剂】有商品试剂盒供应。例如，某试剂盒的成分与参考浓度：1.试剂 GOODS缓冲液100mmol/L (pH7.0) ；HSDA 5mmol/L；Mg2+ 1.5mmol/L；表面活性剂适量；防腐剂适量。2.试剂 GOODS缓冲液100mmol/L (pH7.0)；胆固醇酯酶5KU/L；胆固醇氧化酶5KU/L；过氧化物酶3KU/L；4-氨基安替比林0.25mmol/L；防腐剂适量。注释：GOODS缓冲液(Goods buffers)1960年，N.E.Good等总结了各种缓冲试剂的优缺点后，合成了一系列专门用于生命科学研究的特定缓冲体系，为Goods缓冲液。Goods缓冲液可查阅有关资料。Goods缓冲液的主要优点是不参加和不干扰生物化学反应过程，对酶化学反应等无抑制作用，所以专门用于细胞器和极易变性的、对pH敏感的蛋白质和酶的研究工作。其缺点是：价格昂贵，对测定蛋白质含量的双缩脲法和Lowry法不适用，因为它们会使空白管的颜色加深。【操作】严格按试剂盒操作规程操作。例如：血清4l，加试剂300l，37水浴5min，在546nm处读取吸光度A1，再加入试剂100ul，37保温5min ，在546nm处读取吸光度A2。上机操作参数：根据各实验室仪器的型号及操作说明书设置。【计算】A= A2 A1血清HDL-C（mmol/L）= 标准液浓度 mmol/L【参考范围】男性 1.141.76 mmol/L 女性 1.221.91 mmol/L建议各实验室建立自己的参考范围。【临床意义】1.下降 多见于脑血管病、糖尿病、肝炎、肝硬变等患者；高甘油三酯血症往往伴有低HDL-C；肥胖者多偏低；吸烟可使HDL-C下降。2.升高 饮酒和长期体力活动会使HDL-C升高。【方法评价】本方法测定线性可达3.07mmol/L（120mg/dl），在全自动分析仪上的线性取决于所用试剂量与样品量的比例、测定时间和比色杯光径。实验一十四 血清低密度脂蛋白胆固醇测定（化学修饰酶法）低密度脂蛋白（LDL）增高是动脉粥样硬化的主要脂类危险因素。测定低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）反映LDL的水平。目前常用LDL-C代替总胆固醇（TC）作为冠心病危险因素指标。【实验要求】熟悉血清低密度脂蛋白胆固醇测定（化学修饰酶法）的原理，操作方法。能及时发现和解决实验中出现的问题。【实验原理】胆固醇酯酶（CHE）和胆固醇氧化酶（CHOD）经化学修饰后，对HDL、VLDL、乳糜微粒的反应性延迟，仅仅选择性地作用于LDL-胆固醇。本方法原理反应方程式如下：LDL-C H2O 胆固醇 游离脂肪酸胆固醇 O2 胆甾烯酮 H2O2H2O2 4-AA HSDA 紫色醌类色素 【试剂】有商品试剂盒供应。例如，某试剂盒的成分与参考浓度：1.试剂 GOOd s缓冲液120mmol/L (pH7.0) ；HSDA2.5mmol/L；表面活性剂适量；胆固醇酯酶1.0KU/L。